Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbon có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió zingiber zerumbert sm và chuyển hóa zerumbon thành các hợp chất có hoạt tính sinh học

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbon có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió zingiber, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Lê Thị Thùy
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Khoa Học
• Đề tài: Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) và chuyển hóa zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học.
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Khái quát về chi Gừng (Zingiber)
• 1.2. Đặc điểm thực vật của các cây chi Gừng
• 1.3. Sinh thái, sinh trưởng và phát triển
• 1.4. Khái quát về cây Gừng gió (Zingiber zerumbet)
• 1.5. Đặc điểm thực vật
• 1.6. Nguồn gốc và phân bố của cây Gừng gió (Zingiber zerumbet)
• 1.7. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet)
• 1.8. Các tecpenoit và tinh dầu của Gừng gió
• 1.9. Công dụng và các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)
• 1.10. Gừng gió trong y học các dân tộc Phương Đông
• 1.11. Các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet)
• 1.12. Zerumbone và hoạt tính sinh học
• 1.12.1. Cơ chế oxi hóa khử
• 1.12.2. Cơ chế thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis mechanism)
• 1.13. Phân lập và chuyển hóa Zerumbone
• 1.13.1. Phân lập Zerumbone
• 2. ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
• 2.1. Đề tài, mục tiêu, nội dung
• 2.1.1. Mục tiêu của đề tài
• 2.1.2. Nhiệm vụ của đề tài
• 2.2. Thiết bị nghiên cứu
• 2.3. Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone từ thân rễ cây gừng gió
• 2.3.1. Nguyên liệu và phương pháp xử lý
• 2.3.2. Điều chế cặn chiết không phân cực
• 2.3.3. Phân lập Zerumbone có chất lượng cao từ cặn chiết không phân cực bằng sắc ký cột
• 2.3.4. Phân lập Zerumbone chất lượng cao từ cặn chiết không phân cực bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC)
• 2.3.5. Điều chế zerumbone có chất lượng cao từ cặn chiết phần không phân cực bằng phương pháp kết tinh phân đoạn
• 2.3.6. Điều chế các dẫn xuất của Zerumbone
• 2.3.6.1. Điều chế amino zerumbone (ZerNH2)
• 2.3.6.2. Điều chế 3-isopropylaminozerumbone
• 2.3.7. Khảo sát hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất của Zerumbone
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Điều chế Zerumbone chất lượng cao (≥ 99%)
• 3.2. Nguyên liệu cho điều chế zerumbone
• 3.3. Điều chế phần không phân cực (dầu Zerumbone) và zerumbone tinh khiết
• 3.4. Tổng hợp một số dẫn xuất của zerumbone và khảo sát hoạt tính chống ung thư của chúng
• 3.4.1. Tổng hợp 3-amino và 10-amino Zerumbone
• 3.4.2. Tổng hợp 3-isopropylamino zerumbone
• 3.4.3. Khảo sát hoạt tính chống ung thư của 3-isopropylaminozerumbone
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phân lập zerumbone từ cây gừng gió

Nghiên cứu phân lập và chuyển hóa zerumbone từ cây gừng gió (Zingiber zerumbet) đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Zerumbone là một hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, đặc biệt trong việc phòng ngừa và chống ung thư. Cây gừng gió không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước Đông Nam Á. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học của cây mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm y dược từ thiên nhiên.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây gừng gió

Cây gừng gió (Zingiber zerumbet) là một loại cây thân thảo, cao từ 1,2 đến 1,7 mét. Thân rễ của cây có màu vàng nhạt, thịt củ màu vàng sáng và có mùi thơm nhẹ. Cây thường mọc ở những nơi ẩm ướt, dưới tán rừng, và có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện khí hậu nhiệt đới.

1.2. Tầm quan trọng của zerumbone trong y học

Zerumbone được biết đến với khả năng phòng ngừa và chống lại nhiều loại ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư vú. Nghiên cứu cho thấy hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và thúc đẩy quá trình tự chết của chúng.

II. Thách thức trong việc phân lập zerumbone từ cây gừng gió

Mặc dù zerumbone có nhiều lợi ích, việc phân lập hợp chất này từ cây gừng gió gặp phải một số thách thức. Đầu tiên, quy trình chiết xuất và phân lập cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng và hiệu suất cao. Thứ hai, sự biến đổi của thành phần hóa học trong các điều kiện khác nhau cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả phân lập.

2.1. Các phương pháp chiết xuất hiện tại

Hiện nay, có nhiều phương pháp chiết xuất được sử dụng để phân lập zerumbone, bao gồm sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được sản phẩm chất lượng cao.

2.2. Khó khăn trong việc tối ưu hóa quy trình

Quá trình tối ưu hóa quy trình phân lập zerumbone đòi hỏi sự nghiên cứu kỹ lưỡng về các yếu tố như nhiệt độ, thời gian chiết xuất và loại dung môi. Những yếu tố này có thể ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng.

III. Phương pháp phân lập zerumbone hiệu quả từ cây gừng gió

Để phân lập zerumbone một cách hiệu quả, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp tăng cường hiệu suất chiết xuất mà còn đảm bảo chất lượng của hợp chất thu được.

3.1. Sắc ký cột trong phân lập zerumbone

Sắc ký cột là một trong những phương pháp phổ biến nhất để phân lập zerumbone. Phương pháp này cho phép tách biệt các hợp chất dựa trên tính chất hóa học của chúng, từ đó thu được zerumbone với độ tinh khiết cao.

3.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế SKLMĐC

Sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) cũng là một phương pháp hiệu quả trong việc phân lập zerumbone. Phương pháp này giúp xác định nhanh chóng và chính xác các hợp chất có trong mẫu chiết xuất, từ đó hỗ trợ trong việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của zerumbone

Kết quả nghiên cứu cho thấy zerumbone có thể được phân lập với độ tinh khiết lên đến 99%. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hợp chất này có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong việc phát triển các loại thuốc chống ung thư.

4.1. Ứng dụng trong phát triển thuốc

Nghiên cứu về zerumbone đã mở ra nhiều cơ hội trong việc phát triển các loại thuốc mới. Hợp chất này có thể được sử dụng để điều chế các sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, phục vụ cho việc điều trị ung thư và các bệnh lý khác.

4.2. Kết quả thử nghiệm lâm sàng

Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy zerumbone có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đồng thời không gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của hợp chất này trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu zerumbone

Nghiên cứu về zerumbone từ cây gừng gió không chỉ mang lại những hiểu biết mới về thành phần hóa học của cây mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm y dược từ thiên nhiên. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y học.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các phương pháp chiết xuất mới, nhằm tối ưu hóa quy trình phân lập zerumbone và các dẫn xuất của nó. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm.

5.2. Tiềm năng ứng dụng trong y học

Với những kết quả nghiên cứu hiện tại, zerumbone có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho nhiều loại bệnh, đặc biệt là ung thư. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển sẽ giúp khai thác tối đa giá trị của hợp chất này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những thách thức y tế hàng đầu toàn cầu với tỷ lệ tử vong cao và nhu cầu cấp thiết về các hoạt chất điều trị có nguồn gốc tự nhiên ít độc tính. Cây gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là loài thảo dược quý hiếm được bảo vệ theo Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Các nghiên cứu hóa thực vật cho thấy tinh dầu củ gừng gió chứa hàm lượng Zerumbone đặc biệt cao, chiếm từ 72,30% đến 73,20% tổng lượng tinh dầu. Hợp chất sesquiterpenoid này đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh mẽ trên 10 dòng tế bào ung thư ác tính khác nhau như ung thư gan, phổi, vú, đại tràng và tử cung.

Tuy nhiên, các phương pháp phân lập Zerumbone truyền thống bằng sắc ký cột cổ điển thường cho hiệu suất thấp, chỉ đạt khoảng 0,062% tính theo khối lượng củ tươi, đồng thời tiêu tốn nhiều dung môi và dung dịch hấp phụ đắt tiền. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề tối ưu hóa quy trình phân lập Zerumbone đạt độ tinh khiết trên 99,0% từ nguồn nguyên liệu củ gừng gió thu hái tại vùng Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc. Nghiên cứu được triển khai trong khuôn khổ chương trình khoa học công nghệ hóa dược trọng điểm quốc gia.

Mục tiêu cụ thể của luận văn bao gồm việc khảo sát, so sánh 3 phương pháp phân lập Zerumbone từ cặn chiết không phân cực, xây dựng quy trình công nghệ kết tinh phân đoạn hiệu suất cao và tiến hành bán tổng hợp các dẫn xuất amino mới nhằm nâng cao hoạt tính sinh học. Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa thực tiễn lớn, nâng hiệu suất thu hồi Zerumbone tinh khiết lên 0,35% tính theo củ tươi (tăng gấp 5,6 lần so với công bố quốc tế) từ tỷ lệ chuyển đổi bột khô đạt 14,28%, cung cấp nguồn nguyên liệu chất lượng cao phục vụ phát triển dược phẩm điều trị ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng hóa học các hợp chất thiên nhiên và dược lý phân tử hiện đại. Cấu trúc phân tử Zerumbone là một sesquiterpenoid đơn vòng 11 cạnh, tên khoa học (2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1-on với công thức C15H22O. Khung lý thuyết của đề tài tập trung vào 3 cơ chế tác động sinh học chính:

1. Cơ chế ức chế yếu tố phiên mã nhân NF-κB (Nuclear Factor kappa B): Bình thường NF-κB liên kết với protein ức chế I-κB. Khi gặp tác nhân kích thích độc hại, I-κB bị phân hủy khiến NF-κB tự do kích hoạt các gen sinh u và viêm. Zerumbone đóng vai trò tương tự I-κB, liên kết trực tiếp với NF-κB hoạt hóa thông qua nhóm chức carbonyl α,β-không no, ngăn chặn sự tăng sinh khối u.
2. Cơ chế kích hoạt quá trình tự chết tế bào (Apoptosis): Zerumbone thúc đẩy tế bào ung thư bước vào chu trình chết sinh lý có kiểm soát mà không gây tổn thương mô xung quanh (khác với hiện tượng hoại tử tế bào).
3. Cơ chế điều hòa oxy hóa khử GSH/GSSG: Phản ứng cộng hợp ái nhân Michael giữa Glutathione (GSH) và nhóm carbonyl α,β-không no của Zerumbone làm thay đổi điện thế màng tế bào ung thư, đưa trạng thái bệnh lý về cân bằng sinh học bình thường.

Phương pháp nghiên cứu

• Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Thu thập tổng cộng 7,0 kg thân rễ gừng gió tươi tự nhiên tại huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc vào thời điểm cuối tháng 11 dương lịch. Phương pháp lấy mẫu theo thời gian thu hoạch được áp dụng chặt chẽ vì giai đoạn này hàm lượng Zerumbone đạt đỉnh cao nhất; từ tháng 3 đến tháng 4 năm sau củ nảy mầm làm hoạt chất suy giảm nghiêm trọng. Mẫu tươi được rửa sạch, thái lát dày 2,0 cm, sấy khô ở nhiệt độ 45°C và nghiền thành 1,0 kg bột củ khô (kích thước hạt 2,0 mm, đạt hiệu suất thu hồi 14,28%).
• Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Bột khô được chiết ngâm với cồn EtOH 96% ở nhiệt độ phòng, cô đặc còn 1/5 thể tích, bổ sung 4/5 thể tích nước muối 10% rồi chiết phân đoạn bằng n-hexan. Kỹ thuật này giúp phân lập chọn lọc hoàn toàn 40,0 g cặn không phân cực (hiệu suất 4,0% tính theo bột khô), loại bỏ sạch các hợp chất phân cực như flavonoid và curcuminoid.
• Quy trình phân lập và tổng hợp dẫn xuất: So sánh song song 3 phương pháp gồm sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 0,040-0,063 mm), sắc ký lớp mỏng điều chế (bản PLC 60F254 dày 2,0 mm) và kỹ thuật kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp. Dẫn xuất amino được tổng hợp bằng phản ứng cộng ái nhân của NH3 25% và isopropylamin trong dung môi acetonitril ở nhiệt độ 25-28°C trong thời gian 7 ngày.
• Xác định cấu trúc và hoạt tính: Cấu trúc được kiểm chứng bằng UPLC-MS, GC-MS (hệ GC-6890/MS-5973), phổ hồng ngoại FT-IR (máy Nicolet 760), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMQC, HMBC trên máy Bruker Avance 500 MHz. Hoạt tính kháng ung thư được thử nghiệm trên 3 dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan), Lu (ung thư phổi), RD (ung thư cơ tim) theo tiêu chuẩn NCI trên phiến vi lượng 96 giếng và đo quang phổ ELISA tại bước sóng 495-515 nm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu hóa hiệu suất phân lập Zerumbone tinh khiết: Nghiên cứu đã chứng minh phương pháp kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp là giải pháp vượt trội nhất. Từ 1,0 kg bột khô thu được 24,5 g Zerumbone tinh khiết 99,5%, đạt hiệu suất 0,35% tính theo củ tươi ban đầu. Kết quả này vượt trội hoàn toàn so với phương pháp sắc ký cột (đạt 0,10%) và sắc ký lớp mỏng điều chế (đạt 0,08%). So sánh với công bố sáng chế quốc tế của các nhà khoa học nước ngoài năm 2009 (đạt 0,062%), quy trình này đạt hiệu suất cao hơn 5,6 lần (tăng 464,5%).
2. Xác lập bộ dữ liệu quang phổ chuẩn: Zerumbone tinh chế có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy chuẩn xác ở 66-67°C, Rf = 0,75 trong hệ n-hexan/EtOAc (8/2). Phổ khối UPLC-MS cho pic đơn sắc phân tử lượng 218 đvC (M+ = 219,19). Phổ 13C-NMR ghi nhận đủ 15 nguyên tử carbon với tín hiệu C=O đặc trưng tại 204,33 ppm và 6 carbon olefin trong vùng 124-160 ppm. Phổ DEPT xác nhận sự có mặt của 4 nhóm methyl, 3 nhóm methylen và 4 nhóm metin.
3. Tổng hợp thành công 3 dẫn xuất amino mới:
   • Phản ứng với amoniac tạo ra hỗn hợp gồm 3-amino-zerumbone (hợp chất A) và (R)-10-amino-zerumbone (hợp chất B) với hiệu suất thô 87,5%, sau khi tinh chế qua cột silica gel thu được sản phẩm tinh khiết với hiệu suất 41,0%.
   • Phản ứng với isopropylamin tạo thành 3-isopropylamino-zerumbone với hiệu suất thô 80,0% và hiệu suất sau tinh chế đạt 70,0%.
4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vượt trội: Thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 cho thấy Zerumbone đạt giá trị IC50 = 3,15 ± 0,026 μg/ml, mạnh hơn gấp 2,25 lần so với thuốc hóa trị chuẩn Cis-platin (IC50 = 7,08 ± 0,073 μg/ml). Đồng thời, Zerumbone thể hiện độc tính chọn lọc trên tế bào ác tính mà không gây hại tế bào gan lành. Dẫn xuất 3-isopropylamino-zerumbone thể hiện hoạt tính ức chế mạnh ở nồng độ thấp dưới 75 μM.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất vượt trội của phương pháp kết tinh phân đoạn được giải thích là do tận dụng sự chênh lệch độ tan của Zerumbone trong dung môi không phân cực ở điều kiện nhiệt độ thấp, giúp hoạt chất kết tinh tự nhiên mà không bị thất thoát trên chất hấp phụ như sắc ký cột.

Khi trình bày các kết quả này, dữ liệu thực nghiệm có thể được trực quan hóa thông qua bảng so sánh hiệu suất và độ tinh khiết giữa 3 phương pháp phân lập (sắc ký cột 0,10%, sắc ký lớp mỏng 0,08%, kết tinh phân đoạn 0,35%). Đồng thời, một biểu đồ cột so sánh chỉ số IC50 giữa Zerumbone (3,15 μg/ml) và Cis-platin (7,08 μg/ml) trên tế bào Hep-G2 sẽ làm nổi bật ưu thế dược lực của hoạt chất tự nhiên. Sơ đồ quy trình công nghệ 3 công đoạn (Chiết dầu Zerumbone - Kết tinh thô - Kết tinh tinh khiết) cũng là minh chứng rõ ràng cho khả năng ứng dụng công nghiệp.

Việc chuyển hóa nhóm carbonyl α,β-không no thành các dẫn xuất amino giúp tăng tính phân cực và khả năng tan trong nước, mở ra triển vọng khắc phục rào cản sinh khả dụng vốn có của các hợp chất sesquiterpene tự nhiên.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng quy mô công nghệ phân lập bán công nghiệp: Các trung tâm nghiên cứu hóa dược cần tiến hành thử nghiệm quy trình kết tinh phân đoạn ở quy mô pilot từ 50 đến 100 kg nguyên liệu khô/mẻ trong vòng 12 tháng, nhằm tối ưu hóa các thông số nhiệt độ, tỷ lệ hồi lưu dung môi và thiết bị lọc hút chân không công nghiệp.
2. Quy hoạch vùng trồng gừng gió chuẩn GACP-WHO: Doanh nghiệp dược phẩm phối hợp cùng Sở Nông nghiệp các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc (đặc biệt là Vĩnh Phúc, Phú Thọ) thiết lập vùng chuyên canh gừng gió diện tích 20-50 ha trong thời gian 24 tháng, nhằm đảm bảo năng suất củ tươi đạt 20-32 tấn/ha/năm với hàm lượng Zerumbone trong tinh dầu ổn định trên 70,0%.
3. Đẩy mạnh thử nghiệm dược lý in vivo và độc tính bán trường diễn: Các nhóm nghiên cứu chuyên ngành dược lý và sinh học phân tử cần thực hiện các phép thử in vivo trên mô hình chuột mang khối u trong 18 tháng, đánh giá chi tiết chỉ số dược động học của dẫn xuất 3-isopropylamino-zerumbone nhằm hướng tới đích hạ chỉ số IC50 xuống dưới 1,0 μg/ml.
4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đăng ký bảo hộ sở hữu trí tuệ: Nhóm tác giả và cơ quan chủ trì cần hoàn thiện hồ sơ đăng ký sáng chế/giải pháp hữu ích cho quy trình công nghệ kết tinh phân đoạn trong vòng 6 tháng, đồng thời ban hành tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu Zerumbone tinh khiết 99,5% bằng UPLC-MS và NMR.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu Hóa học Hợp chất thiên nhiên và Hóa dược: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chi tiết về chiết tách sesquiterpenoid, hệ dung môi kết tinh và bộ dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR 500 MHz chuẩn xác của Zerumbone và các dẫn xuất amino.
• Doanh nghiệp và Nhà máy sản xuất Dược phẩm sinh học: Ứng dụng ngay quy trình công nghệ 3 công đoạn có tính khả thi cao, chi phí thấp, giúp nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm lên 0,35% phục vụ sản xuất nguyên liệu thuốc chống ung thư.
• Giảng viên, Học viên cao học và Sinh viên ngành Hóa - Dược: Sử dụng làm tài liệu tham khảo phương pháp luận chuẩn mực về tối ưu hóa quy trình phân lập, kỹ thuật sắc ký và phương pháp bán tổng hợp hữu cơ các hợp chất vòng lớn.
• Bác sĩ lâm sàng và Chuyên gia Ung bướu: Nắm bắt các bằng chứng thực nghiệm về cơ chế tác động apoptosis, ức chế NF-κB và tiềm năng ứng dụng hoạt chất tự nhiên có độc tính chọn lọc cao trong phác đồ điều trị bổ trợ ung thư gan, phổi và tử cung.

Câu hỏi thường gặp

1. Cây gừng gió phân bố ở đâu và hàm lượng Zerumbone trong các bộ phận khác nhau như thế nào? Cây gừng gió phân bố rộng tại vùng rừng núi Việt Nam như Tam Đảo, Bình Trị Thiên. Hàm lượng Zerumbone tập trung cao nhất ở tinh dầu củ (72,30%), tiếp theo là thân (21,30%), cụm hoa (3,20%) và thấp nhất ở lá (2,40%).

2. Tại sao phương pháp kết tinh phân đoạn lại tối ưu hơn sắc ký cột truyền thống? Phương pháp kết tinh phân đoạn cho hiệu suất thu hồi đạt 0,35% tính theo củ tươi (độ tinh khiết 99,5%), cao gấp 3,5 lần so với sắc ký cột (0,10%) và 4,37 lần so với sắc ký mỏng điều chế (0,08%), đồng thời tiết kiệm 80% chi phí dung môi và hạt silica gel.

3. Cơ chế phân tử nào giúp Zerumbone tiêu diệt tế bào ung thư gan Hep-G2? Zerumbone ức chế quá trình giải phóng yếu tố nhân NF-κB, dập tắt tín hiệu sinh u, đồng thời phản ứng cộng hợp ái nhân với Glutathione (GSH) làm thay đổi điện thế tế bào, kích hoạt enzyme caspase thúc đẩy tế bào ung thư tự chết theo chương trình apoptosis.

4. Khả năng ức chế tế bào ung thư của Zerumbone so với thuốc hóa trị Cis-platin ra sao? Thực nghiệm in vitro chứng minh Zerumbone có hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2 với IC50 = 3,15 ± 0,026 μg/ml, mạnh hơn gấp 2,25 lần so với Cis-platin (IC50 = 7,08 ± 0,073 μg/ml) và có ưu điểm vượt trội là không gây độc cho tế bào thường.

5. Dẫn xuất 3-isopropylamino-zerumbone có ưu điểm gì so với Zerumbone tự nhiên? Dẫn xuất 3-isopropylamino-zerumbone được tổng hợp với hiệu suất cao 70,0%, có độ tan và tính phân cực cải thiện đáng kể, giúp tăng sinh khả dụng và thể hiện khả năng ức chế mạnh các dòng tế bào ung thư kháng thuốc ở dải nồng độ IC50 dưới 75 μM.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp điều chế Zerumbone đạt độ tinh khiết 99,5% với hiệu suất 0,35% từ củ tươi, cao gấp 5,6 lần sáng chế quốc tế.
• Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của Zerumbone và 3 dẫn xuất amino mới (3-amino, 10-amino và 3-isopropylamino-zerumbone) bằng các phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 500 MHz và khối phổ.
• Khẳng định hoạt tính kháng ung thư gan Hep-G2 nổi bật của Zerumbone với IC50 = 3,15 μg/ml, vượt trội so với hóa chất đối chứng Cis-platin và có tính chọn lọc cao.
• Thiết lập quy trình công nghệ 3 công đoạn có tính khả thi cao, mở đường cho việc sản xuất thử nghiệm quy mô pilot 50-100 kg/mẻ trong giai đoạn 12-24 tháng tới.
• Các đơn vị sản xuất dược phẩm và viện nghiên cứu nên đẩy mạnh hợp tác chuyển giao công nghệ, tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng để sớm đưa các dẫn xuất Zerumbone vào ứng dụng điều trị thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời không chỉ ở nƣớc ta mà còn ở rất nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonexia, Thái Lan, Miến Điện… Gừng gió là cây mọc hoang dại phổ biến ở nƣớc ta từ Bắc tới Nam, đặc biệt là ở các tỉnh miền núi nƣớc ta. Hợp chất có hoạt tính sinh học chính của gừng gió là Zerumbone- nó là chất có hoạt tính phòng ngừa và chống ung thƣ mạnh trên 10 loại ung thƣ khác nhau, đặc biệt là ung thƣ gan và ung thƣ vú. Vì vậy, gần 20 năm trở lại đây, Zerumbone nhận đƣợc sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới, đặc biệt là các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ. Ngoài ra những nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học đã chứng minh rằng dẫn xuất của zerumbone cũng có hoạt tính phòng ngừa và chống ung thƣ mạnh.

Chính vì vậy mà chúng tôi đặc biệt quan tâm tới việc điều chế zerumbone có chất lƣợng cao từ cây gừng gió để chuyển hóa zerumbone thành các chất khác nhau nhằm tạo ra đƣợc những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dƣợc. Đấy cũng chính là lí do mà chúng tôi chọn đề tài:“ Nghiên cứu các phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ cây gừng gió( Zingiber zerumbet Sm) và chuyển hóa zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học.” 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Khái quát về chi Gừng (Zingiber) Họ Gừng (Zingiberaceae) có nhiều chi và nhiều loài khác nhau. Hầu hết các loại cây thuộc họ Gừng phân bố chủ yếu ở các nƣớc Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản… Theo các tác giả Võ Văn Chi và Dƣơng Đức Tiến đã tổng kết, họ Gừng có 45 chi gồm hơn 1300 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.

Riêng ở Việt Nam, họ Gừng có 8 chi gồm 25 loài khác nhau phân bố rải rác từ Bắc tới Nam [4,5]. Chi Gừng (Zingiber) gồm khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới Châu Á và Châu Úc. Trung tâm phong phú nhất của chi Gừng là ở các nƣớc Đông Nam Á. Đặc điểm thực vật của các cây chi Gừng: - Các cây thuộc chi Gừng là loại thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng từ 0,5-3,5 m.

Thân rễ mập, phân nhánh nhiều, tạo thành củ nằm ngang trên mặt đất. Thịt củ nạc, thơm và có vị cay. - Lá mọc so le theo hai phía đối xứng trên thân; phiến lá hình mác, thuôn đến bầu dục dài hoặc hình đƣờng chỉ; cuống lá rất ngắn hoặc hầu nhƣ không có; bẹ lá nguyên hoặc xẻ hai thuỳ; có mùi thơm nhẹ. - Cụm hoa bông, thƣờng mọc từ thân rễ, đôi khi ở ngọn “thân giả”.

Các hoa mọc sít nhau và mỗi hoa đƣợc bao bởi một lá bắc sắp xếp nhƣ dạng vẩy cá từ dƣới lên trên; lúc đầu thƣờng có màu xanh, sau chuyển dần sang màu vàng, đỏ nhạt, vàng sáng hoặc đỏ. Cánh hoa hình ống mảnh, màu trắng, vàng hoặc hồng; bao phấn thƣờng có dạng hình ống bao lấy vòi nhụy, bầu ba ô nhẵn hoặc có lông dày. Quả nang 3 ô, hạt nhiều, hình trứng hay hình xoan, màu nâu đỏ, màu đen, trắng hay vàng [7]. Sinh thái, sinh trƣởng và phát triển.

Các loài trong chi Gừng (Zingiber) thƣờng thích nghi với điều kiện ẩm, đƣợc che bóng và nhiệt độ không quá cao (khoảng 27-300C về ban ngày và 17-180C về 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ban đêm). Chúng sinh trƣởng dƣới tán rừng thứ sinh, rừng cây bụi, rừng tre, rừng tếch, ở khe núi, thung lũng hoặc ven bìa rừng… Chúng ƣa đất tốt, màu mỡ và sinh trƣởng tốt ở những khu vực có độ cao dƣới 1500m so với mặt nƣớc biển. Một số loài có thể mọc trên đất có lẫn sỏi đá, trên bãi đất trống hoặc trong rừng tới độ cao 3000m so với mặt nƣớc biển. Thân, rễ các loại cây thuộc chi Gừng phát triển rất nhanh.

Từ một chồi giống ban đầu, chúng có thể phân nhánh, đâm chồi, tăng sinh khối và phát triển thành một bụi lớn chỉ trong một vài năm. Ở nƣớc ta, chi Gừng cũng khá phong phú. Chúng sinh trƣởng chủ yếu trong vùng núi ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam. Theo Phạm Hoàng Hộ [7], chi Gừng ở Việt Nam có 11 loài nhƣ sau: Bảng 1.

Các loài Gừng có ở Việt Nam TT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố 1 Zingiber officinale Roscoe Gừng Phân bố rộng Tây Nguyên, 2 Zingiber acuminatum Valeton Gừng nhọn Trung Bộ Bà Rịa- Vũng 3 Zingiber conchichinensis Gagn Gừng Nam Bộ Tàu 4 Zingiber eberhardtii Gagn Gừng Eberhardt Lâm Đồng 5 Zingiber gramineum Bl Gừng lúa, Ngải trặc Biên Hòa 6 Zingiber monophyllum Gagn Gừng một lá Ninh Bình 7 Zingiber pellitum Gagn Gừng bọc da Bà Rịa 8 Zingiber purpureum Roscoe Gừng tía Phân bố rộng 9 Zingiber rubens Roxb Gừng đỏ Lâm Đồng 10 Zingiber rufopilosum Gagn Gừng lông hung Hà Nội 11 Zingiber zerumbet (L. Gừng gió Phân bố rộng 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trong 11 loài Gừng thƣờng thấy ở nƣớc ta, có 3 loài đƣợc nhân dân ta dùng nhiều:  Gừng (Zingiber purpureum Roscoe): còn gọi là Khƣơng, Sinh khƣơng (Gừng tƣơi), Can khƣơng (Gừng khô), đƣợc trồng khắp cả ba miền Bắc, Trung, Nam để làm mứt, gia vị, thuốc chữa bệnh đƣờng ruột. Củ màu vàng, thơm, cay. Phát hoa ở đất, hình bầu dục trên một cọng dài 5-10cm.

Lá hoa xanh sau ngả sang đỏ. Hoa vàng, cánh môi to 2cm, có sọc đỏ. Noãn sào không long.  Gừng tía (Zingiber montanum (Koanig) Dietrich): còn đƣợc dân gian gọi là Gừng dại, Gừng đỏ… Ở nƣớc ta Gừng tía mọc tự nhiên tại Cúc Phƣơng (Ninh Bình), Ba Vì (Hà Nội) và các tỉnh phía Nam.

Gừng tía đƣợc dùng làm gia vị thay thế Gừng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và dùng làm thuốc chữa bệnh. Cây cao đến 2m. Củ màu vàng cam, vị nóng, đắng, thơm. Phát hoa ở gốc, xoan hay bầu dục.

 Gừng gió (Zingiber zerumbet. Sm ): xem mục 1. Công dụng của các loài cây thuộc chi Gừng Hầu hết các loài cây thuộc chi Gừng (Zingiber) đều có chứa tinh dầu, đƣợc coi là nguồn nguyên liệu có giá trị để làm gia vị và làm thuốc. Thân rễ đƣợc làm gia vị trong chế biến thực phẩm, là nguyên liệu chế biến rƣợu bia, mứt Gừng… Trong dân gian, Gừng là vị thuốc giúp kích thích tiêu hóa, dùng trong những trƣờng hợp kém ăn, ăn uống không tiêu, chữa đau dạ dày, cảm mạo, phong hàn, làm thuốc ra mồ hôi, chữa ho mất tiếng, mụn nhọt, đau đầu, đau nhức xƣơng… Gừng còn đƣợc dân gian dùng để chữa ho cho gia súc nhƣ trâu, bò, voi, ngựa bị đau mắt đỏ, ăn không nuốt đƣợc… 1.

Khái quát về cây Gừng gió (Zingiber zerumbet. Sm) Cây Gừng gió có tên khoa học là Zingiber zerumbet (L) J. Sm (hay Zingiber zerumbet. Sm) thuộc chi Gừng (Zingiber), họ Gừng (Zingiberaceae).

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Ngoài ra, cây còn có một số tên đồng nghĩa sau: Amoum zerumbet L (1753); Zingiber amaricans Blume (1872); Z. Ở mỗi nƣớc, cây Gừng gió đƣợc gọi với nhiều tên riêng nhƣ: Riềng dại, Ngải mặt trời, Ngải xanh (Việt Nam), Khuhet phtu, Prateal vongatit (Campuchia), Gingembre fou (Pháp) và Phong Khƣơng (Trung Quốc) [4, 5, 7, 8, 9]. Đặc điểm thực vật Gừng gió (Zingiber zerumbet.Sm) đƣợc xếp vào loại cây trồng quý hiếm cần đƣợc bảo tồn theo qui định số 80/2005/QĐ-BNN ký ngày 05/12/2005 của Bộ NN & PTNT. Nó thuộc danh mục 1, danh mục các nguồn gien trao đổi quốc tế trong trƣờng hợp đặc biệt.

Gừng gió thuộc dạng cây thảo, cao khoảng 1,2-1,7 m. Thân rễ (hay còn gọi là củ) phân nhánh, vỏ ngoài màu vàng nhạt, thịt củ màu vàng sáng, có mùi thơm nhẹ. Ống bẹ lá sắp xếp sít nhau tạo thành thân giả, gần nhƣ không cuống; phiến lá hình mác thuôn, kích thƣớc 25-40 x 4-8 cm, thon ở gốc, chóp lá hình nhọn, mặt trên xanh lục đậm, mặt dƣới xanh nhạt và có lông rải rác. Cụm hoa bông, hình trụ hay trứng, kích thƣớc 6-14 x 4-5 cm, chóp tù, mọc từ thân rễ, trên cán dài 10-30 cm, thẳng, có nhiều vẩy xếp lợp lên nhau bao quanh.

Cụm hoa có nhiều lá bắc xếp lớp lên nhau, lá bắc gần giống hình trứng, kích thƣớc 3-4 x 2,5 cm. Khi còn non có màu xanh, già chuyển sang màu đỏ. Hoa mọc ở mỗi kẽ lá bắc; đài hình ống, dài 2,5 cm, ngắn hơn lá bắc, màu trắng, tràng hoa hình ống, dài từ 5-5,5 cm với các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía lƣng lớn hơn, kích thƣớc 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ, kích thƣớc 1,6 x 0,7 cm; môi dài 5 cm, mép có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu 3 ô. Quả nang hình trụ hay bầu dục, dài 1,5 cm, khi chín có màu đỏ; hạt ít, màu đen, áo hạt có màu trắng [9].

Tại Đông Nam Á dựa vào đặc điểm cụm hoa, năm 1996 Thailade đã mô tả và sắp xếp những dạng khác nhau của loài Gừng gió (Z. zerumbet) vào các thứ 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. amaricans (Blume) Thailade; Var. aromaticum (Valeton) Thailade; var.

Do sự đa dạng về hình thái nên những nghiên cứu về thành phần hóa học trong tinh dầu Gừng gió phân bố ở các vùng, các nƣớc khác nhau thay đổi trong giới hạn khá rộng. Và năng suất thu hái “củ” ở các thứ Gừng gió cũng khác nhau, năng suất “củ” tƣơi của var. zerumbet trong khoảng từ 20-32 tấn/ha/năm, còn của các thứ khác thấp hơn [9]. Cây Gừng gió (Zingiber zerumbet.

Nguồn gốc và phân bố của cây Gừng gió (Zingiber zerumbet. Sm) Nhiều tác giả cho rằng Gừng gió có nguồn gốc từ Ấn Độ, đƣợc ngƣời dân ở đây trồng và phổ biến rộng rãi sang nhiều nƣớc Châu Á nhƣ: Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaixia, Lào, Campuchia, Thái Lan. Gừng gió là loài cây có nguồn gen đa dạng, sinh trƣởng nhanh, khả năng chống chịu khỏe nên có thể tự nhiên hóa mạnh [8, 9]. Ở Việt Nam, cây mọc rải rác ở các tỉnh trung du, vùng núi thấp và đôi khi có ở đồng bằng.

Cây ƣa chịu ẩm, chịu bóng và thƣờng mọc ở ven rừng, dƣới tán cây, 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ở vùng trung du và đồng bằng, cây mọc lẫn trong các lùm bụi dƣới chân đồi hoặc các làng bản [4]. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet.