Sàng lọc hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh và một số hoạt tính sinh học khác từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo solanum procumbens l

Khám phá hợp chất chống oxi hóa mạnh và các hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo Solanum procumbens.

• Tác giả: Phan Thị Diễm Trinh
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Sàng Lọc Hợp Chất Có Hoạt Tính Chống Oxi Hóa Mạnh Và Một Số Hoạt Tính Sinh Học Khác Từ Xạ Khuẩn Nội Sinh Và Cao Chiết Cây Cà Gai Leo (Solanum procumbens L.)
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN NỘI SINH
• 1.1.1. Sơ lược về xạ khuẩn nội sinh
• 1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh
• 1.1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.1.5. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trong nước
• 1.1.6. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trên cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 1.2.1. Đặc điểm thực vật học của cây cà gai leo
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái và phân bố
• 1.2.3. Thành phần hóa học
• 1.2.4. Lợi ích và tác dụng
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI SINH VẬT THỬ NGHIỆM
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.4.2. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu
• 2.4.2.1. Thu nhận mẫu
• 2.4.2.2. Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.3. Quan sát vi thể, đại thể
• 2.4.3.1. Quan sát đại thể
• 2.4.3.2. Quan sát vi thể
• 2.4.4. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.5. Khảo sát khả năng chống oxi hóa của xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.6. Thu nhận cao chiết thô từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.7. Lên men chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.8. Chiết lỏng-lỏng và thu nhận cao chiết thô từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.9. Định tính khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp hiện màu trên tấm sắc ký bản mỏng (TLC)
• 2.4.10. Đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng sử dụng DPPH
• 2.4.11. Khảo sát khả năng tiêu huyết từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.12. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.13. Thu nhận cao chiết dược liệu từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.14. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.15. Khảo sát khả năng chống oxi hóa của cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.16. Định tính khả năng chống oxi hóa theo phương pháp của Plánder và cộng sự (2012)
• 2.4.17. Đánh giá khả năng chống oxi hóa bằng sử dụng DPPH
• 2.4.18. Khảo sát khả năng chống tạo màng biofilm từ cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.19. Khảo sát khả năng chống ung thư từ cao chiết xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.)
• 2.4.20. Định danh chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) có hoạt tính mạnh nhất
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY
• 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.4.1. Định tính khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp hiện màu trên tấm sắc ký bản mỏng (TLC)
• 3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIÊU HUYẾT CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.6. KẾT QUẢ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.7. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) CÓ HOẠT TÍNH MẠNH NHẤT
• 3.8. THU NHẬN CAO CHIẾT DƯỢC LIỆU TỪ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.9. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 3.10. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hoạt Chất Chống Oxi Hóa Từ Xạ Khuẩn Nội Sinh

Nghiên cứu về hoạt chất chống oxy hóa từ xạ khuẩn nội sinh và cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Các hợp chất này không chỉ có khả năng chống oxy hóa mà còn có nhiều tác dụng sinh học khác. Việc tìm hiểu về nguồn gốc và tiềm năng của chúng là rất cần thiết trong bối cảnh hiện nay.

1.1. Định Nghĩa Và Tầm Quan Trọng Của Hoạt Chất Chống Oxi Hóa

Hoạt chất chống oxy hóa là những hợp chất có khả năng ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do gây ra. Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất này có thể giúp ngăn ngừa nhiều bệnh lý nghiêm trọng.

1.2. Giới Thiệu Về Xạ Khuẩn Nội Sinh

Xạ khuẩn nội sinh là nhóm vi sinh vật sống trong mô thực vật mà không gây hại cho cây. Chúng có khả năng sản sinh ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm cả các hợp chất chống oxy hóa. Việc nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo có thể mở ra hướng đi mới trong y học.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hoạt Chất Chống Oxi Hóa

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng nghiên cứu về hoạt chất chống oxy hóa từ xạ khuẩn nội sinh và cây cà gai leo vẫn gặp nhiều thách thức. Việc phân lập và xác định các hợp chất này không hề đơn giản. Ngoài ra, sự thiếu hụt thông tin về các phương pháp nghiên cứu cũng là một rào cản lớn.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Lập Xạ Khuẩn Nội Sinh

Phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của hệ sinh thái vi sinh vật. Các phương pháp phân lập hiện tại cần được cải tiến để tăng hiệu quả và độ chính xác.

2.2. Thiếu Thông Tin Về Hoạt Chất Chống Oxi Hóa

Mặc dù có nhiều nghiên cứu, nhưng thông tin về các hoạt chất chống oxy hóa từ cây cà gai leo vẫn còn hạn chế. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ ràng các hợp chất và cơ chế hoạt động của chúng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Chất Chống Oxi Hóa Từ Xạ Khuẩn

Để nghiên cứu hoạt chất chống oxy hóa từ xạ khuẩn nội sinh, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập, chiết xuất và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất. Việc áp dụng các công nghệ hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

3.1. Phân Lập Và Chiết Xuất Xạ Khuẩn Nội Sinh

Quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo bao gồm việc thu thập mẫu, nuôi cấy và xác định các chủng xạ khuẩn. Sau đó, các hợp chất có hoạt tính sẽ được chiết xuất để đánh giá khả năng chống oxy hóa.

3.2. Đánh Giá Hoạt Tính Chống Oxi Hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất được đánh giá thông qua các phương pháp như DPPH và TLC. Những phương pháp này giúp xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của các hợp chất chiết xuất từ xạ khuẩn.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hoạt Chất Chống Oxi Hóa Từ Cà Gai Leo

Các hoạt chất chống oxy hóa từ cây cà gai leo có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm. Chúng không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe mà còn có thể được sử dụng trong các sản phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung.

4.1. Ứng Dụng Trong Y Học

Hoạt chất chống oxy hóa từ cà gai leo có thể được sử dụng để điều trị các bệnh lý liên quan đến oxy hóa như ung thư và bệnh tim mạch. Nghiên cứu cho thấy chúng có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

4.2. Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Thực Phẩm

Các hợp chất này cũng có thể được sử dụng như chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm. Chúng giúp kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất lượng sản phẩm.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Hoạt Chất Chống Oxi Hóa Từ Xạ Khuẩn

Nghiên cứu về hoạt chất chống oxy hóa từ xạ khuẩn nội sinh và cây cà gai leo mở ra nhiều triển vọng trong y học và công nghiệp. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của chúng. Việc phát triển các phương pháp nghiên cứu mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong việc xác định các hợp chất có hoạt tính.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Hoạt Chất Chống Oxi Hóa

Tương lai của nghiên cứu này rất hứa hẹn với sự phát triển của công nghệ sinh học. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp phát hiện ra nhiều hợp chất mới có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ.

5.2. Khuyến Khích Nghiên Cứu Thêm Về Xạ Khuẩn Nội Sinh

Cần khuyến khích các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh từ các loại cây dược liệu khác. Điều này sẽ giúp mở rộng hiểu biết về tiềm năng của chúng trong việc sản xuất các hợp chất có lợi cho sức khỏe.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Quá trình oxy hóa tế bào gắn liền với sự hình thành các gốc tự do (free radicals). Khi nồng độ các gốc tự do tích tụ quá mức trong cơ thể dưới tác động của môi trường sống ô nhiễm, căng thẳng kéo dài hoặc quá trình lão hóa sinh học, chúng sẽ gây tổn thương màng tế bào, biến đổi cấu trúc protein và làm biến đổi cấu trúc DNA, hoạt hóa các gen sinh ung và thúc đẩy các bệnh lý mạn tính như tiểu đường, tim mạch, suy giảm trí nhớ và ung thư. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết cho y dược học hiện đại trong việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, độ an toàn cao và hạn chế tối đa các tác dụng phụ không mong muốn.

Cà gai leo (Solanum procumbens Lour., thuộc họ Cà Solanaceae) là loài cây thân bò, cành có gai dẹp, lá có lông ở mặt dưới, hoa màu tím hoặc trắng nhạt, quả mọng đỏ khi chín. Trong y học cổ truyền, rễ và thân lá của cây thường được sử dụng để điều trị phong thấp, tiêu độc, trị mụn nhọt và rắn cắn. Các nghiên cứu hóa thực vật hiện đại đã xác định trong cây Cà gai leo chứa nhiều hợp chất tự nhiên có giá trị sinh học cao như alkaloid, glycoalkaloid (điển hình là solasodin, solanidin), saponin steroid và flavonoid. Những hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự nhân lên của virus viêm gan B, bảo vệ tế bào gan khỏi các chất độc hại, chống xơ gan và thể hiện hoạt tính gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư.

Bên cạnh việc khai thác trực tiếp sinh khối thực vật, xu hướng công nghệ sinh học y dược hiện nay tập trung khai thác hệ vi sinh vật nội sinh (endophytes). Xạ khuẩn nội sinh (endophytic actinomycetes) sống cộng sinh bên trong các mô thực vật mà không gây hại cho cây chủ; nhờ sự tương tác lâu dài với cấu trúc mô cây, chúng có khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc tương tự hoặc bổ trợ cho cây chủ với các hoạt tính sinh học đa dạng như kháng sinh, ức chế enzyme, chống oxy hóa và kháng khối u. Mặc dù chi Streptomyces và các chi xạ khuẩn khác đã được phân lập từ nhiều loài thảo dược, việc nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cộng sinh trên cây Cà gai leo tại Việt Nam vẫn chưa được công bố.

Khóa luận tốt nghiệp tập trung giải quyết mục tiêu tổng quát: Sàng lọc hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và một số hoạt tính sinh học khác từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.).

Để đạt được mục tiêu trên, nghiên cứu triển khai 8 nhiệm vụ cụ thể:

1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các bộ phận của cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.).
2. Khảo sát một số hoạt tính sinh học (sinh enzyme ngoại bào, khả năng tiêu huyết) từ các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập được.
3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ các chủng xạ khuẩn nội sinh.
4. Định danh chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học tiềm năng nhất bằng phương pháp sinh học phân tử.
5. Thu nhận cao chiết dược liệu tổng số từ cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.).
6. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn nội sinh và cao chiết Cà gai leo đối với một số chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh.
7. Khảo sát khả năng chống oxy hóa định tính và định lượng của cao chiết Cà gai leo.
8. Khảo sát khả năng ức chế dòng tế bào ung thư gan (HepG2) và khả năng kháng màng sinh học (biofilm) của cao chiết Cà gai leo và xạ khuẩn nội sinh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Các bộ phận rễ, thân, lá của cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.) thu hái tại tỉnh Bình Định, các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập được và các chủng vi khuẩn kiểm định gồm: Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus.
• Thời gian và địa điểm: Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2021 đến tháng 09/2022 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh; các thử nghiệm độc tính tế bào được phối hợp thực hiện tại Bộ môn Di truyền - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG-HCM) và giám định phân tử tại Công ty TNHH DV & TM Nam Khoa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở phân loại học vi sinh vật, hóa học các hợp chất thiên nhiên và phương pháp luận sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro.

Khung lý thuyết và các khái niệm khoa học sử dụng trong khóa luận:

• Xạ khuẩn (Actinobacteria): Nhóm vi khuẩn Gram dương hình sợi có hàm lượng G+C trong DNA cao (>50%), phát triển hệ sợi gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh, sinh sản bằng bào tử. Chi phổ biến nhất là Streptomyces, đóng vai trò chính trong sản xuất các chất kháng sinh tự nhiên.
• Vi sinh vật nội sinh: Quần xã vi sinh vật sống trong mô tế bào thực vật theo cơ chế cộng sinh không gây bệnh (định nghĩa theo De Bary 1866 và Petrini 1986).
• Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn thử nghiệm: Cơ chế kháng beta-lactam của MRSA qua gen mecA mã hóa protein PBP 2A, cơ chế sinh enzyme ESBL ở vi khuẩn Gram âm đường ruột E. coli, độc tính gây ngộ độc của Bacillus cereus, khả năng tạo sắc tố và đề kháng của Pseudomonas aeruginosa, độc lực gây bệnh thương hàn của Salmonella typhi.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Phương pháp xử lý và vô trùng bề mặt mô thực vật: Rửa sạch mẫu rễ, thân, lá dưới vòi nước chảy; ngâm lắc trong ethanol 70% (3-5 phút), xử lý khử trùng bằng dung dịch Natri hypoclorid 4% (5-10 phút), rửa lại bằng ethanol 70% (3-5 phút) và tráng rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng. Đánh giá độ vô trùng bề mặt bằng cách trải 100 µL nước rửa cuối cùng lên môi trường Nutrient Agar (NA).
• Phương pháp phân lập xạ khuẩn: Tiến hành so sánh song song 4 quy trình kỹ thuật:
  • Phương pháp 1: Đặt mẫu cắt đoạn trực tiếp lên môi trường thạch Gause I bổ sung acid nalidixic và nystatin.
  • Phương pháp 2: Tiền tăng sinh mẫu trong môi trường Gause I lỏng có bổ sung kháng sinh ở 28°C, lắc 200 vòng/phút trong 5-7 ngày trước khi trang lên đĩa thạch Gause I.
  • Phương pháp 3: Thay thế môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn bằng dịch xay và lọc vô trùng từ cây Cà gai leo tươi.
  • Phương pháp 4: Nghiền đồng thể mẫu mô thực vật trong dung dịch đệm phosphate rồi trang dịch huyền phù lên môi trường thạch.
• Phương pháp quan sát hình thái và bảo quản chủng: Nhuộm Gram quan sát vi thể dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000X; ghi nhận đặc điểm đại thể khuẩn lạc (màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, sắc tố hòa tan); giữ giống thuần trên thạch nghiêng Gause I và bảo quản sâu trong dung dịch glycerol ở -4°C.
• Phương pháp chiết xuất:
  • Chiết cao xạ khuẩn: Lên men lắc môi trường lỏng Gause I (180 vòng/phút, 28°C, 72 giờ), ly tâm lạnh 13000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch ngoại bào, chiết lỏng - lỏng bằng dung môi ethyl acetate tỷ lệ 1:1 (v/v), cô quay chân không ở 35°C-50°C để thu cao thô.
  • Chiết cao dược liệu Cà gai leo: Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi, xay mịn thành bột, ngâm chiết hồi lưu lạnh trong ethanol 96% trong 48 giờ, lọc bỏ bã và cô cạn thu cao chiết toàn phần.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:
  • Kháng khuẩn: Kỹ thuật khuếch tán giếng thạch (đường kính giếng 6 mm) trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) với nồng độ vi khuẩn chuẩn 0,5 McFarland (1 - 1,5 × 10⁸ CFU/mL), đo đường kính vòng kháng khuẩn (IDZ) sau 24-48 giờ ủ ở 37°C.
  • Thử nghiệm enzyme ngoại bào: Nuôi cấy chấm điểm trên đĩa thạch bổ sung 1% tinh bột (khảo sát amylase) và 1% casein (khảo sát protease).
  • Thử nghiệm tiêu huyết: Cấy ria trên môi trường thạch máu bổ sung 5% máu cừu (Blood Agar - BA), ủ 37°C trong 18-24 giờ để phát hiện dạng tiêu huyết alpha, beta hoặc gamma.
  • Khảo sát chống oxy hóa: Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản silica gel 60 với hệ dung môi giải ly toluene : ethyl acetate : formic acid (tỷ lệ 5:4:1, v/v), hiện màu bằng dung dịch DPPH 0,2% trong methanol và soi dưới đèn UV; định lượng khả năng quét gốc tự do DPPH ở bước sóng 517 nm, xác định giá trị phần trăm bắt gốc tự do I% và giá trị IC50 (đối chứng dương là acid ascorbic / vitamin C).
  • Khảo sát ức chế tạo màng biofilm: Thử nghiệm trên chủng MRSA trong đĩa microtiter 96 giếng chứa môi trường TSB bổ sung 2% glucose, nhuộm màng bằng dung dịch Crystal violet 0,4% và đo mật độ quang học ở bước sóng 570 nm.
  • Thử nghiệm độc tính tế bào in vitro: Xác định hàm lượng protein tổng số qua phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) trên dòng tế bào ung thư gan người HepG2; sử dụng Camptothecin làm đối chứng dương và DMSO 10% làm đối chứng âm; tính toán giá trị IC50 bằng phần mềm chuyên dụng.
• Phương pháp sinh học phân tử: Khuếch đại và giải trình tự gen 16S rRNA, tra cứu độ tương đồng chuỗi nucleotide bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI và xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến hai đối tượng nghiên cứu chính: xạ khuẩn nội sinh và cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.).

Về xạ khuẩn nội sinh, tác giả trình bày lịch sử nghiên cứu từ các định nghĩa nền tảng của De Bary (1866) và Petrini (1986). Văn bản tổng hợp các chi xạ khuẩn nội sinh đã được phân lập phổ biến gồm Streptomyces, Frankia, Nocardia, Micromonospora, Actinomadura, Pseudonocardia. Các số liệu thống kê cho thấy xạ khuẩn đóng góp khoảng 45-50% tổng số các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật và là nguồn gốc của 75% các loại thuốc kháng sinh tự nhiên ứng dụng trong y học. Về đặc điểm hình thái và phân loại học, chương tổng quan chi tiết cấu trúc khuẩn lạc thô ráp, các dạng cuống sinh bào tử (dạng thẳng, xoắn, chia thùy, chùm), thành phần hóa học thành tế bào (chia 4 nhóm dựa trên acid diaminopimelic, glycine và đường đặc trưng) cùng hàm lượng G+C vượt trội trong chuỗi 16S rRNA. Tình hình nghiên cứu trong nước điểm lại các công trình phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây nghệ vàng (Curcuma longa), cây bưởi Diễn, cây quế (Cinnamomum cassia) và cây xương khỉ. Đáng chú ý, chưa có công bố khoa học nào tại Việt Nam về hệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Cà gai leo.

Về cây Cà gai leo, chương tổng quan trình bày đầy đủ vị trí phân loại học thực vật (Giới Plantae, Bộ Solanales, Họ Solanaceae, Loài Solanum procumbens Lour.), đặc điểm hình thái học, vùng phân bố tự nhiên (chủ yếu tại các tỉnh Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Bắc Giang, Phú Thọ, Bình Định và một số vùng phía nam Trung Quốc). Về thành phần hóa học, các nghiên cứu trước đây đã phân lập được các glycoalkaloid, flavonoid, saponin steroid, các hợp chất anthraquinone, polyphenol (như ziganein, benzoic acid, salicylic acid, vanillic acid). Các dẫn liệu dược lý chứng minh dịch chiết cây có tác dụng bảo vệ gan khỏi độc tính TNT, chống oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế enzyme alpha-glucosidase.

Đối với vi sinh vật kiểm định, chương mô tả chi tiết cơ chế kháng thuốc của tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA qua trung gian gen mecA mã hóa PBP 2A), trực khuẩn E. coli kháng cephalosporin thế hệ ba và sinh ESBL, trực khuẩn thương hàn Salmonella typhi, trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa và vi khuẩn sinh độc tố gây nôn Bacillus cereus.

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương này mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện thí nghiệm, quy trình thu mẫu, hệ thống trang thiết bị và các phương pháp thao tác thực nghiệm từ khâu vô trùng đến các thử nghiệm sinh học phân tử.

Nguyên liệu thực vật thu hái tại Bình Định được phân chia thành 3 bộ phận rễ, thân, lá. Khóa luận mô tả chi tiết sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể gồm hai nhánh song song: nhánh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh (phân lập, làm thuần, khảo sát enzyme ngoại bào, tiêu huyết, kháng khuẩn, chống oxy hóa, định danh phân tử 16S rRNA) và nhánh nghiên cứu cao chiết dược liệu Cà gai leo (thu cao chiết cồn, khảo sát kháng khuẩn, chống oxy hóa, ức chế tạo màng biofilm trên MRSA, ức chế tế bào ung thư gan HepG2). Các thông số kỹ thuật nuôi cấy, nồng độ hóa chất thử nghiệm, hệ dung môi sắc ký bản mỏng và công thức toán học tính toán phần trăm bắt gốc tự do I%, phần trăm ức chế biofilm và phần trăm ức chế tế bào sống sót qua phép thử SRB được quy chuẩn hóa chi tiết.

Phần III: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương Kết quả và Thảo luận trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

1. Kết quả giám định thực vật: Mẫu cây thu thập tại Bình Định được định danh chính xác là Solanum procumbens Lour., thuộc họ Cà (Solanaceae).
2. Hiệu quả phân lập xạ khuẩn nội sinh: Kết quả so sánh 4 phương pháp phân lập trên các bộ phận rễ, thân, lá được tổng hợp trong Bảng 3.1. Phương pháp tiền tăng sinh trong môi trường lỏng Gause I (phương pháp 2) mang lại hiệu quả vượt trội, phân lập thành công tổng cộng 25 chủng xạ khuẩn nội sinh (gồm 24 chủng từ mô lá và 1 chủng từ mô rễ, không phân lập được chủng nào từ mô thân). Ba phương pháp còn lại (đặt mẫu trực tiếp, thay thế môi trường bằng dịch cây và nghiền dịch mô cây) hoàn toàn không phân lập được khuẩn lạc xạ khuẩn nào (0 chủng).

Phương pháp phân lập	Rễ	Thân	Lá	Tổng số chủng
Phương pháp 1 (Đặt mẫu trực tiếp)	0	0	0	0
Phương pháp 2 (Tiền tăng sinh)	1	0	24	25
Phương pháp 3 (Thay thế môi trường)	0	0	0	0
Phương pháp 4 (Nghiền dịch cây)	0	0	0	0

3. Đặc điểm hình thái: Các chủng xạ khuẩn phân lập ký hiệu từ XL1 đến XL25 biểu hiện sự đa dạng về màu sắc khuẩn ty khí sinh, bề mặt khuẩn lạc và khả năng sinh sắc tố hòa tan làm biến đổi màu môi trường nuôi cấy Gause I (như chủng XL9, XL10, XL19). Quan sát vi thể sau nhuộm Gram xác nhận các chủng mang đặc điểm hình thái điển hình của xạ khuẩn: vi khuẩn Gram dương, sợi phân nhánh bắt màu tím rõ rệt.
4. Khảo sát hoạt tính sinh học của xạ khuẩn nội sinh:

• Hoạt tính kháng khuẩn: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch cho thấy một số chủng thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, nổi bật là chủng XL21 thể hiện vòng kháng khuẩn rõ rệt đối với chủng vi khuẩn đa kháng MRSA.
• Hoạt tính chống oxy hóa: Sắc ký bản mỏng TLC hiện màu với DPPH dưới đèn UV ghi nhận sự xuất hiện của các vệt màu vàng trên nền tím, chứng minh sự hiện diện của các chất có khả năng khử gốc tự do trong dịch chiết xạ khuẩn. Đo quang phổ hấp thụ ở 517 nm xác định nồng độ ức chế IC50 của các chủng tiềm năng.
• Khả năng tiêu huyết và sinh enzyme: Khảo sát trên đĩa thạch máu cừu 5% và môi trường thạch bổ sung tinh bột 1%, casein 1% giúp phân loại mức độ an toàn sinh học và khả năng tiết enzyme ngoại bào (amylase, protease) của các chủng phân lập.
• Giám định sinh học phân tử: Chủng xạ khuẩn nội sinh thể hiện hoạt tính sinh học mạnh nhất được giải trình tự gen 16S rRNA, phân tích BLAST trên GenBank và dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining.

5. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết Cà gai leo:

• Cao chiết toàn phần từ bột cây Cà gai leo khô bằng dung môi ethanol 96% thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn kiểm định.
• Khả năng chống oxy hóa: Thể hiện rõ qua phép thử định tính sắc ký bản mỏng TLC và định lượng quang phổ DPPH với đường chuẩn vitamin C, xác định giá trị mật độ quang học OD và giá trị IC50.
• Kháng màng sinh học: Dịch chiết Cà gai leo nồng độ từ 5 đến 500 µg/mL thể hiện khả năng ức chế sự tạo màng biofilm của vi khuẩn MRSA.
• Hoạt tính độc tế bào ung thư: Thử nghiệm SRB in vitro trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 xác định phần trăm ức chế tế bào và giá trị IC50 của cao chiết dược liệu và dịch chiết xạ khuẩn so với đối chứng dương Camptothecin.

Phần IV: Kết luận và đề nghị

Phần này tóm lược toàn bộ kết quả phân lập, sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư; đồng thời đưa ra các đề xuất về việc tinh sạch hoạt chất và mở rộng quy mô khảo sát in vivo.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả thực nghiệm cụ thể và đóng góp học thuật rõ ràng:

1. Kết quả thực nghiệm định lượng:

• Phân lập thành công 25 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.) thu hái tại Bình Định bằng phương pháp tiền tăng sinh (24 chủng từ lá, 1 chủng từ rễ).
• Chứng minh phương pháp tiền tăng sinh trong môi trường lỏng Gause I đạt hiệu suất phân lập vượt trội so với phương pháp cấy mô trực tiếp hay phương pháp nghiền mô.
• Xác định chủng xạ khuẩn XL21 và một số chủng nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA), có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease) và bắt gốc tự do DPPH.
• Đánh giá khả năng chống oxy hóa định lượng, ức chế màng biofilm của MRSA và khả năng gây độc tế bào ung thư gan HepG2 bằng phép thử chuẩn SRB từ cả hai nguồn nguyên liệu: cao chiết cây Cà gai leo và dịch chiết xạ khuẩn nội sinh.
• Hoàn thành giải trình tự 16S rRNA và thiết lập cây phát sinh chủng loại cho chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh nhất.

2. Đóng góp khoa học so với các nghiên cứu trước:

• Đây là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam công bố dữ liệu về việc phân lập, tuyển chọn và định danh xạ khuẩn nội sinh từ cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.).
• Cung cấp cơ sở khoa học chứng minh xạ khuẩn nội sinh trên cây Cà gai leo là nguồn nguyên liệu sinh học mới có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất chống oxy hóa, kháng vi khuẩn đa kháng thuốc và ức chế tế bào ung thư, mở ra hướng khai thác hoạt chất thứ cấp từ vi sinh vật thay vì phụ thuộc hoàn toàn vào sinh khối thực vật tự nhiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số hạn chế gắn liền với phạm vi thực nghiệm:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở mức khảo sát hoạt tính của cao chiết thô và dịch nuôi cấy sơ cấp, chưa tiến hành tách chiết, tinh sạch để xác định công thức cấu tạo hóa học cụ thể của từng đơn chất có hoạt tính.
• Số lượng chủng xạ khuẩn phân lập được còn phân bố không đều giữa các mô, tập trung chủ yếu ở mô lá (24/25 chủng), mô rễ và mô thân thu được rất ít hoặc không thu được.
• Đánh giá độc tính tế bào ung thư mới thực hiện in vitro trên một dòng tế bào gan HepG2, chưa khảo sát trên các dòng tế bào ung thư khác và chưa tiến hành thử nghiệm độc tính trên mô hình động vật sống (in vivo).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tối ưu hóa các điều kiện lên men (nhiệt độ, pH, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy) của chủng xạ khuẩn nội sinh tiềm năng nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp hoạt chất.
• Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký cột hiện đại (HPLC, LC-MS, NMR) để phân lập và định danh cấu trúc hóa học của các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và kháng ung thư từ xạ khuẩn nội sinh.
• Mở rộng thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào ung thư khác và tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu học thuật có giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, CNSH Y Dược, Vi sinh vật học ứng dụng và Dược học cổ truyền.
• Các nhóm nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh mô thực vật có thể tham khảo chi tiết quy trình xử lý vô trùng bề mặt và kỹ thuật tiền tăng sinh mẫu mô lá/rễ trong môi trường lỏng để nâng cao tỷ lệ phân lập thành công xạ khuẩn.
• Các nhà nghiên cứu hóa sinh và dược liệu học có thể kế thừa quy trình sàng lọc song song hoạt tính chống oxy hóa (TLC - DPPH), phương pháp đánh giá ức chế màng sinh học biofilm trên MRSA và quy trình thử nghiệm độc tính tế bào bằng nhuộm Sulforhodamine B (SRB).

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp phân lập nào mang lại hiệu quả cao nhất đối với xạ khuẩn nội sinh cây Cà gai leo trong nghiên cứu này? Phương pháp tiền tăng sinh mẫu mô trong môi trường lỏng Gause I (có bổ sung nystatin và acid nalidixic, ủ lắc 200 rpm ở 28°C từ 5-7 ngày) cho hiệu quả cao nhất, thu nhận được toàn bộ 25 chủng xạ khuẩn nội sinh. Ba phương pháp còn lại (đặt mẫu trực tiếp, thay thế môi trường bằng dịch cây và nghiền mô cây) đều không phân lập được chủng nào (0 chủng).

2. Bộ phận nào của cây Cà gai leo chứa mật độ xạ khuẩn nội sinh phân lập được nhiều nhất? Mô lá là bộ phận cho hiệu quả phân lập cao nhất với 24 chủng xạ khuẩn nội sinh; mô rễ phân lập được 1 chủng; mô thân không phân lập được chủng nào.

3. Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử trong đề tài được kiểm tra bằng những phương pháp nào? Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá qua 2 bước: định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản silica gel 60 với hệ dung môi toluene : ethyl acetate : formic acid (5:4:1, v/v) và hiện màu bằng dung dịch DPPH 0,2% dưới đèn UV; định lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 517 nm với thuốc thử DPPH để tính phần trăm bắt gốc tự do I% và nồng độ ức chế IC50, sử dụng vitamin C (acid ascorbic) làm chất đối chứng dương.

4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trong khóa luận được thực hiện trên những chủng vi sinh vật kiểm định nào? Thí nghiệm kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch được thực hiện trên 5 chủng vi khuẩn kiểm định gồm: Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus cereus.

5. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư được thử nghiệm trên dòng tế bào nào và sử dụng phương pháp gì? Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư gan người HepG2 bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) xác định hàm lượng protein tổng số tại Bộ môn Di truyền - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, với chất đối chứng dương là Camptothecin và đối chứng âm là DMSO 10%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phan Thị Diễm Trinh đã phân lập thành công 25 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Cà gai leo (Solanum procumbens L.) thu hái tại Bình Định, chứng minh tính ưu việt của phương pháp tiền tăng sinh trong phân lập xạ khuẩn từ mô thực vật. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về đặc tính hình thái, khả năng sinh enzyme ngoại bào, hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng đa kháng MRSA, ức chế màng biofilm, chống oxy hóa và độc tính đối với dòng tế bào ung thư gan HepG2 của cả cao chiết dược liệu và dịch chiết xạ khuẩn nội sinh. Đây là công trình tiên phong tại Việt Nam về hệ vi sinh vật nội sinh trên cây Cà gai leo, đóng góp nguồn dẫn liệu khoa học giá trị cho định hướng khai thác các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học ứng dụng trong công nghệ sinh học y dược.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bên cạnh những lợi ích của oxy hóa, sự oxy hóa tế bào hay còn gọi là sự xuất hiện của các gốc tự do mang lại không ít những tác hại đáng báo động. Sự xuất hiện của các gốc tự do làm lão hóa, tổn thương các tế bào khác thậm chí là gây ảnh hưởng đến cấu trúc DNA đó là nguyên nhân dẫn đến các bệnh như tiểu đường, các bệnh về tim, mất trí nhớ và ung thư. Sự oxy hóa cấu trúc DNA làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt hóa các gen sinh ung (Pham và cs. Đặc biệt, khi môi trường sống bị ô nhiễm, căng thẳng hay lớn tuổi các gốc tự do sản sinh ra ngày càng nhiều làm ảnh hưởng đến sức khỏe.

Hiện nay, các nhà khoa học đang không ngừng nỗ lực tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa vì chúng được cho là không mang lại tác dụng phụ và an toàn. Là một loại thảo dược quý dùng trong điều trị bệnh về gan, cà gai leo thuộc họ cà (Solanaceae) tên khoa học là Solanum procumbens Lour, chúng có dạng thân bò, cành có gai dẹp, lá có lông chủ yếu ở mặt dưới, hoa có vành tím; quả tròn không lông, khi chín màu đỏ; hột màu vàng, dẹp. Chúng thường mọc thành bụi rải rác ven rừng, ven đường, bãi hoang (Hợp và cs. Trong dân gian người dân lấy rễ và trái trị mụt nhọt, lở, phong thấp (Hộ và cs.

Bên cạnh việc sử dụng theo liệu pháp dân gian truyền thống để chữa bệnh, thời gian gần đây các nhà khoa học cũng đã có những nghiên cứu sâu hơn về loài cây này. Trong cà gai leo (Solanum procumbens L.) có nhiều hợp chất tự nhiên như alkaloid, glycoalkaloid có vai trò ức chế sự nhân lên và làm bất hoạt virus viêm gan B; ngoài ra chúng có khả năng bắt các gốc tự do và ngừa xơ gan hiệu quả; toàn cây có chứa alkaloid, nhiều nhất là ở rễ có chứa solasodin và solasonidin (Hộ và cs. Cà gai leo (Solanum procumbens L.) rất giàu saponin steroid và flavonoid, đây là các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn và gây độc tế bào (Anh, 2017). Trong những nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng glycoalkaloid trong các cây họ cà có nhiều hoạt tính sinh học, có khả năng chống khối u, kháng nấm, kháng virus (Zha và cs., 2007; Blankemeyer và cs.

Sau khi được công bố về công dụng và hiệu quả trị bệnh thời gian gần đây người ta đã SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.DƯƠNG NHẬT LINH ThS. NGUYỄN VĂN MINH nghiên cứu để trồng trọt và thu hoạch chúng, tuy nhiên việc trồng trọt và thu hoạch còn nhiều bất cập do người dân chưa có nhiều kinh nghiệm trong việc chăm sóc cây dược liệu. Theo xu hướng phát triển y học hiện đại, các vi sinh vật nội sinh cây dược liệu được coi là nhiều triển vọng và là một nguồn cung cấp hợp chất quan trọng trong y học. Vi sinh vật nội sinh là nhóm vi sinh vật sống cộng sinh trong các mô tế bào thực vật mà không gây hại cho vật chủ.

Sự liên kết của những vi sinh vật nội sinh với các cấu trúc thực vật làm cho chúng cũng có khả năng sinh tổng hợp, chuyển hóa và sinh ra các chất giống cây chủ, vì vậy các vi sinh vật nội sinh có vai trò vô cùng lớn (Golinska và cs. Xạ khuẩn là cộng đồng vi sinh vật có nhiều đóng góp cho con người trong nhiều lĩnh vực, chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái dưới nước, trên cạn và đặc biệt là trong đất có vai trò quan trọng trong việc phân hủy sinh học tạo chất mùn cho cây, bên cạnh đó là khả năng phân hủy các thành phần như kitin, keratin, lignocelluloses và những chất khó phân hủy như polymer (Sharma, 2014). Trong tổng số hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi vi sinh vật xạ khuẩn chiếm 50% (Singh và cs., 2018); 75% trong số các loài xạ khuẩn là nguồn sản xuất ra lượng lớn chất kháng sinh tiềm năng cho nền y học bên cạnh đó là khả năng sản sinh ra chất ức chế enzyme, chống oxi hóa, kháng khuẩn và kháng ung thư (Golinska và cs. Trong nghiên cứu mới đây của Singh và cộng sự (2020) chủng xạ khuẩn nội sinh Streptomyces californicus ADR1 phân lập từ cây cà độc dược (Datura metel) sinh ra các hợp chất thứ cấp có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn rất hiệu quả với các vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Methicilline resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium và Enterococcus faecali.

Hiện nay các nghiên cứu về xạ khuẩn chưa nhiều và chưa có nghiên cứu nào về xạ khuẩn nội sinh trên cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được công bố ở Việt Nam. Dựa trên những tiềm năng của nguồn xạ khuẩn nội sinh cũng như hoạt tính sinh học của xạ khuẩn trong tự nhiên đặc biệt là trên cây dược liệu, với mong muốn tìm ra nguồn hợp chất chống oxi hóa và kháng ung thư phục vụ cho nền y học chúng tôi tiến SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.DƯƠNG NHẬT LINH ThS. NGUYỄN VĂN MINH hành thực hiện đề tài: “SÀNG LỌC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA MẠNH VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁC TỪ XẠ KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L. • Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh và một số hoạt tính sinh học khác từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.

• Nội dung nghiên cứu: - Phân lập xạ khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L. - Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L. - Khảo sát khả năng chống oxi hóa từ các chủng xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L. - Định danh chủng xạ khuản nội sinh cây cà gai lep (Solanum procumbens L.) tiểm năng nhất - Chiết cao dược liệu cây cà gai leo (Solanum procumbens L.

- Khảo sát khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh từ xạ khuẩn nội sinh và cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) - Khảo sát khả năng chống oxi hóa từ cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L. - Khảo sát khả năng kháng dòng tế bào ung thư từ cao chiết xạ khuẩn nội sinh cây cà gai leo và cao chiết cây cà gai leo (Solanum procumbens L. SVTH: PHAN THỊ DIỄM TRINH 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH ThS.

NGUYỄN VĂN MINH PHẦN I: TỔNG QUAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH ThS. TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN NỘI SINH 1. Sơ lược về xạ khuẩn nội sinh 1.

Xạ khuẩn nội sinh Định nghĩa đầu tiên về vi sinh vật nội sinh được đưa ra năm 1866 bởi De Bary, sau đó năm 1986 Petrini cũng sử dụng định nghĩa này, định nghĩa được đưa ra như sau: “ Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong các mô của thực vật”. Vi sinh vật nội sinh không gây hại tế bào cây ký chủ mà còn thúc đẩy sự phát triển, cung cấp nguồn dinh dưỡng và bảo vệ cây ký chủ khỏi các tác nhân sinh học (Pandey và cs. Xạ khuẩn nội sinh là vi sinh vật nội sinh được quan tâm đặc biệt với khả năng sinh ra chất có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Xạ khuẩn nội sinh được định nghĩa là những vi sinh vật sống trong phần bên trong của thực vật, không gây ra những thay đổi cho vật chủ của chúng.

Xạ khuẩn nội sinh đóng những vai trò cụ thể như bảo vệ cây chủ chống lại côn trùng và bệnh tật. Chúng là một phần lớn của sinh quyển, chúng cũng được tìm thấy bên trong thực vật, trong đó các loài được nghiên cứu rộng rãi là từ chi Frankia, có khả năng cố định đạm và một số loài thuộc chi Streptomyces (Benson và cs. Tóm lại, xạ khuẩn nội sinh chủ yếu thuộc chi Streptomyces, tuy nhiên một vài chi khác như: Streptoverticillium, Nocardia, Micromonospora, Kitasatospora, Pseudonocardia, Microbispora, Kibdelosporangium, Actinopolyspora, Nocardioides, Brevibromonospium, Actinomadura, Glycomyces cũng được tìm thấy trong thực vật như Palicourea longifolia, Calycophyllum acreanum, Monstera spruceana, Croton lechleri, Cantua buxifolia, Siparuna crassifolia, và Eucharis cyaneosperma (Ranjani Anandan và cs. Để giải quyết các vấn đề về vi khuẩn kháng kháng sinh và tìm ra loại kháng sinh mới cần phải nghĩ ra các cách tiếp cận mới để tìm kiếm các phân tử mới.

Một trong số đó là “sự phục hưng trong khám phá kháng khuẩn từ xạ khuẩn” (Baltz, 2008). Việc tìm kiếm các hệ sinh thái mới với các phương pháp phân lập mới của các chi / loài xạ khuẩn mới góp phần cho việc xác định các cụm gen mới và do đó tạo ra các sản phẩm mới (Xu và cs. Các nhà nghiên cứu hiện đang tập trung vào việc phân lập xạ khuẩn từ các môi trường sống đa dạng như đại dương (Subramani và 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH ThS.

NGUYỄN VĂN MINH Aalbersberg, 2013), môi trường khắc nghiệt (Tang và cs., 2003; Hamedi và cs., 2013), các mô bên trong của thực vật (Chankhamhaengdecha và cs., 2013), phân động vật (Cao và cs., 2012), tảo và địa y (González và cs., 2005; Yamamura và cs. Do đó, rất khuyến khích việc khám phá các xạ khuẩn sống trong các hệ sinh thái đặc biệt như thực vật ưa cực để phát hiện ra các chủng chưa được khai thác cho đến nay. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái dưới nước , trên cạn và đặc biệt là trong đất có vai trò quan trọng trong việc phân hủy sinh học tạo chất mùn cho cây, bên cạnh đó là khả năng phân hủy các thành phần như kitin, keratin, lignocelluloses và những chất khó phân hủy như polymer (Sharma M, 2014). Bên cạnh các loài vi sinh vật phổ biến như vi khuẩn và vi nấm, xạ khuẩn cũng góp phần không nhỏ trong đời sống của con người.

Xạ khuẩn chiếm 45% trong tổng số hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi vi sinh vật; 75% trong số các loài xạ khuẩn là nguồn sản xuất ra lượng lớn chất kháng sinh tiềm năng cho nền y học bên cạnh đó là khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn và kháng ung thư (Golinska P và cs. Trong số các loài xạ khuẩn thì Streptomyces là chi xạ khuẩn phổ biến nhất và được ứng dụng nhiều nhất, điển hình là thuốc kháng sinh streptomycin. Phần lớn các loài xạ khuẩn được phân lập từ đất, bên cạnh đó cũng được phân lập trên các loài cây dược liệu.