Đặt vấn đề Trong những n m qua, kinh nghiệm và tri thức sử dụng cây thuốc để chữa bệnh của ngƣời dân vùng núi cao đã đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Do áp lực khai thác không bền vững để đáp ứng nhu cầu ngày càng t ng cao về dƣợc phẩm nguyên, nhiều cây thuốc quý bị đe dọa và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Việc thực hiện chủ trƣơng chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp theo hƣớng sản xuất hàng hoá đa canh và bền vững, nhiều loại giống cây trồng đƣợc đƣa vào sản xuất nông nghiệp bằng những kỹ thuật mới đã và đang đƣợc ngƣời dân ủng hộ và đón nhận. Trong đó, nghiên cứu nhân giống và phát triển các loài cây dƣợc liệu có giá trị kinh tế cao đang là hƣớng đi mới, không những góp phần t ng thêm thu nhập, mà còn đóng góp vào công tác phòng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, đồng thời bảo tồn, phát triển đƣợc tri thức bản địa quý giá của các dân tộc thiểu số về sử dụng các loài cây thuốc Nam, trong đó có cây Ô đầu.
Ô đầu, Phụ tử chứa những thành phần có độc tính cao nhƣng vẫn đƣợc cho là những vị thuốc quý, đƣợc dùng phổ biến trong y dƣợc học cổ truyền phƣơng Đông. Vị thuốc Ô đầu là củ mẹ và Phụ tử là củ con của một số loài thuộc chi Aconitum [1], [3]. Hiện nay trên thế giới đang có nhiều nghiên cứu về chi Aconitum nhằm phát triển các sản phẩm theo hƣớng nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc chi này trong phòng và trị bệnh. Ở Việt Nam, cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) đƣợc tìm thấy mọc hoang ở vùng núi cao phía Bắc Việt Nam, nhƣ Yên Bái, Lào Cai, Lai Châu [3] và sau đó cây Ô đầu đã đƣợc đƣa vào trồng ở Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu từ những n m 70 thế kỷ XX.
Hiện nay, cây Ô đầu đƣợc trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng V n, tỉnh Hà Giang và đƣợc ngƣời dân địa phƣơng sử dụng theo kinh nghiệm làm thuốc chữa các loại bệnh về xƣơng khớp hoặc nấu cháo n để t ng cƣờng sức khoẻ. N m 2013, Thủ tƣớng Chính phủ đã phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dƣợc liệu đến n m 2020 và định hƣớng đến n m 2030, theo đó cây Ô đầu 2 đƣợc quy hoạch trồng tại tỉnh Hà Giang [19]. Để phát triển nguồn dƣợc liệu Ô đầu, ngoài chiến lƣợc mở rộng vùng trồng, t ng n ng suất và sản lƣợng, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong mục đích t ng sinh khối rễ và củ Ô đầu thông qua nuôi cấy rễ tơ phục vụ thu nhận các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mang tính thời sự và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. Flavonoid là các hợp chất thứ cấp chính đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng oxy hóa khử trong tế bào thực vật.
Nhiều loại flavonoid có đặc tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống ung thƣ [12]. Flavonoid trong chi Aconitum đƣợc quan tâm trong nghiên cứu phát triển dƣợc phẩm hiện đại, và flavonoid 3'5'- hydroxylase (F3'5'H) là một enzyme chìa khóa xúc tác các phản ứng cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp các hợp chất flavonoid ở cây Ô đầu. F3′5′H, một thành viên của họ Cytochrome P450, liên kết với phần màng microomal, phụ thuộc vào NADPH và O2, và nhạy cảm với chất ức chế [139], [106]. F3'5'H tham gia phản ứng chuyển naringenin thành flavonoid [5], [106], [139], [178].
Sự hydro hóa vị trí 5' bởi F3'5'H là một phản ứng quan trọng vì nó quyết định sản phẩm cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp flavonoid của thực vật [97], [178], do đó, việc t ng cƣờng biểu hiện gen F3 5 H sẽ làm t ng nồng độ và hoạt tính của enzyme F3’5’H và dẫn đến t ng tích lũy flavonoid trong thực vật. Cho đến nay, đã có một số báo cáo về phân tích biểu hiện của gen F3'5'H của một số loài thực vật khác nhau, nhƣ Dạ yến thảo [82], Bạch quả [170], Trà [95], [178].tuy nhiên, chƣa có báo cáo nào về kết quả phân tích biểu hiện gen F3 5 H của cây Ô đầu. Nhƣ vậy, hai cách tiếp cận làm t ng hàm lƣợng các chất có hoạt tính sinh học đƣợc lựa chọn là ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm t ng sinh khối và kỹ thuật biểu hiện gen chìa khóa làm t ng tích lũy hàm lƣợng hợp chất thứ cấp trong cây chuyển gen. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận án: ―Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và biểu hiện flavonoid 3’5’- hydroxylase nhằm tăng cƣờng tổng hợp flavonoid ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.
Mục tiêu nghiên cứu 2. Xác định đƣợc một số điều kiện thích hợp trong nuôi cấy in vitro và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây Ô đầu. Chứng minh đƣợc sự biểu hiện của gen mã hóa Flavonoid 3’5’ hydroxylase của cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) làm t ng sự tích lũy flavonoid trong cây chuyển gen. Nội dung nghiên cứu 1) Nghiên cứu định danh loài từ các mẫu Ô đầu thu tại một số địa phƣơng của tỉnh Hà Giang bằng phƣơng pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA.
Thu thập mẫu Ô đầu từ hai huyện Hoàng Su Phì và Quản Bạ (Hà Giang), trồng tại vƣờn thí nghiệm làm vật liệu nghiên cứu. Định danh loài Ô đầu (A.) bằng phƣơng pháp hình thái so sánh và tra cứu trên cơ sở dữ liệu thực vật quốc tế, kết hợp với một số chỉ thị phân tử DNA nhƣ ITS, matK, rpoC1, rpoB2. 2) Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây Ô đầu. Tạo nguyên liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro từ đoạn thân cây Ô đầu.
Cảm ứng tạo đa chồi và cây Ô đầu in vitro qua nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP và kinetin, ảnh hƣởng của α-NAA và IBA, ảnh hƣởng của giá thể. Nghiên cứu lựa chọn vật liệu nuôi cấy tạo rễ tơ và điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ cây Ô đầu. Khảo sát môi trƣờng nhân nuôi t ng sinh khối rễ tơ cây Ô đầu. 3) Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Flavonoid 3’5’hydroxylase và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen thực vật.
Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen A F3 5 H từ cây Ô đầu (A. Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật mang gen A F3 5 H từ cây Ô đầu và tạo vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen A F3 5 H. 4) Nghiên cứu biến nạp và biểu hiện gen A F3 5 H ở cây Thuốc lá.
4 Biến nạp di truyền gen A F3 5 H vào mô lá Thuốc lá và tạo cây Thuốc lá chuyển gen. Phân tích biểu hiện gen A F3 5 H của cây Ô đầu trên cây Thuốc lá chuyển gen, cụ thể là xác nhận sự có mặt và sự phiên mã, dịch mã của gen chuyển A F3 5 H trong cây chuyển gen; so sánh hàm lƣợng flavonoid giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen. 5) Nghiên cứu biến nạp và biểu hiện gen A F3 5 H ở cây Ô đầu. Nghiên cứu về ảnh hƣởng của các yếu tố đến hiệu quả chuyển gen cây Ô đầu thông qua biến nạp gen chỉ thị uidA vào cây Ô đầu.
Biến nạp di truyền gen A F3 5 H vào chồi Ô đầu thông qua A. tumefaciens và tạo cây Ô đầu chuyển gen. Phân tích biểu hiện gen A F3 5 H ở cây Ô đầu chuyển gen thông qua phân tích PCR, RT-PCR, Western blot và ELISA. Đánh giá sự tích lũy hàm lƣợng flavonoid trong cây chuyển gen.
Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh các mẫu Ô đầu thu thập ở Hà Giang đến thiết lập hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen đến cảm ứng tạo rễ tơ và nhân nuôi t ng sinh khối rễ tơ ở loài Ô đầu. Từ tách dòng phân tử gen A F3 5 H từ cây Ô đầu và thiết kế vector biểu hiện gen ở thực vật đến nghiên cứu biến nạp di truyền và phân tích biểu hiện gen A F3 5 H ở cây chuyển gen. Những đóng góp mới cho khoa học của luận án thể hiện cụ thể là: 1) Các mẫu Ô đầu thu tại huyện Quản Bạ và Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang, Việt Nam thuộc cùng loài A. carmichaelii, chi Aconitum, họ Hoàng Liên (Ranunculaceae) đƣợc định danh bằng sự kết hợp giữa phƣơng pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA.
2) Xác định đƣợc điều kiện thích hợp cho nuôi cấy in vitro và tạo đƣợc các dòng rễ tơ từ rễ cây Ô đầu in vitro làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ chuyển gen. 3) Lần đầu tiên trên thế giới gen A F3 5 H từ cây Ô đầu đƣợc biến nạp và biểu hiện thành công trên cây thuốc lá và cây Ô đầu. Sự biểu hiện mạnh của gen A F3 5 H đã làm t ng hàm lƣợng flavonoid trong cây chuyển gen. Kết quả nghiên cứu của luận án là báo cáo đầu tiên trên thế giới và ở Việt Nam về phân tích biểu hiện gen A F3 5 H của cây Ô đầu.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Cách tiếp cận cải thiện hàm lƣợng flavonoid bằng kỹ thuật chuyển gen mã hóa enzyme chìa khóa A F3 5 H trong quá trình tổng hợp flavonoid và tạo dòng rễ tơ in vitro ở cây Ô đầu có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn. Về mặt khoa học Kết quả phân tích biểu hiện gen trên cây Thuốc lá và cây Ô đầu là cơ sở cho các nghiên cứu t ng cƣờng biểu hiện gen A F3 5 H ở các loài dƣợc liệu khác trong mục đích làm t ng sự tích lũy flavonoid trong các bộ phận của thực vật. Gen A F3 5 H từ cây Ô đầu đƣợc nghiên cứu trong công trình này có thể đƣợc coi là một ứng cử viên để t ng cƣờng tích lũy flavonoid trong thực vật bằng công nghệ gen. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro và cảm ứng tạo rễ tơ là cơ sở ứng dụng công nghệ này vào việc nâng cao hàm lƣợng và hiệu quả thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học ở cây Ô đầu và một số loại cây dƣợc liệu khác.
Về mặt thực tiễn Các dòng rễ tơ và dòng cây Ô đầu chuyển gen làm vật liệu cho chọn giống Ô đầu có hàm lƣợng flavonoid cao.