Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ y học với đề tài "Nghiên cứu thực trạng ngộ độc, đặc điểm, độc tính của nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) tại Bắc Kạn và thử nghiệm thuốc điều trị trên động vật" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Ngô Thị Thanh Hải, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Hoàng Công Minh và TS. Bế Hồng Thu, thuộc chuyên ngành Dược lý và Độc chất (mã số: 9720118) tại Học viện Quân y (năm 2019). Luận án sử dụng một phần số liệu từ đề tài khoa học "Nghiên cứu đặc điểm sinh học, đặc tính của các loài nấm độc thường gặp tại tỉnh Bắc Kạn và đề xuất một số biện pháp dự phòng, cấp cứu và điều trị ngộ độc nấm độc".
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Việt Nam là quốc gia nhiệt đới nóng ẩm, sở hữu hệ nấm tự nhiên phong phú với khoảng 3.000 loài nấm, trong đó có 1.821 loài nấm lớn (Macro Fungi) thuộc 458 chi và 140 họ. Người dân ở các tỉnh miền núi phía Bắc thường có tập quán thu hái và sử dụng nấm rừng tự nhiên làm thực phẩm. Thói quen này dẫn đến nhiều vụ ngộ độc nấm tập thể có tỷ lệ tử vong cao, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng và an sinh xã hội.
Theo các khảo sát trước đó của Trung tâm Phòng chống nhiễm độc - Học viện Quân y, tại Hà Giang (2004 - 2007) ghi nhận 33 vụ ngộ độc với 165 người mắc, 24 người tử vong (tỷ lệ 14,5%); tại Cao Bằng (2003 - 2009) ghi nhận 29 vụ với 81 người mắc, 17 người tử vong (tỷ lệ 21%). Nguyên nhân tử vong chủ yếu do các loài nấm thuộc chi Amanita chứa độc tố amatoxin gây hoại tử tế bào gan cấp dẫn đến suy gan, suy đa tạng.
Tại tỉnh Bắc Kạn, báo cáo từ Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm (2004 - 2011) ghi nhận nhiều vụ ngộ độc nấm gây tử vong toàn bộ gia đình. Tuy nhiên, trước thời điểm nghiên cứu, địa phương còn thiếu các dữ liệu dịch tễ học chi tiết, chưa có danh mục đầy đủ các loài nấm độc bản địa, thiếu các thông số thực nghiệm về độc tính cấp của dịch nấm tươi Amanita virosa tại chỗ trên động vật, cũng như chưa có cơ sở thực nghiệm rõ ràng để so sánh hiệu quả bảo vệ gan của thuốc silibinin (dạng tiêm truyền tĩnh mạch) và silymarin (dạng uống) nhằm định hướng áp dụng lâm sàng.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:
- Mô tả thực trạng ngộ độc nấm độc tại tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016 và đặc điểm của một số loài nấm độc mọc tại địa phương nơi xảy ra ngộ độc.
- Xác định độc tính của loài nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) mọc tại tỉnh Bắc Kạn lên một số cơ quan của động vật thực nghiệm.
- Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của thuốc silibinin và silymarin trên động vật thực nghiệm ngộ độc nấm độc trắng hình nón.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu dịch tễ: Toàn bộ các vụ ngộ độc nấm, các nạn nhân và bệnh nhân ngộ độc nấm được ghi nhận tại địa bàn các huyện, thị xã thuộc tỉnh Bắc Kạn trong khoảng thời gian từ năm 2004 đến năm 2016.
- Đối tượng nghiên cứu thực vật học: Các mẫu nấm độc thu hái tại thực địa ở các địa phương xảy ra ngộ độc trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn, tập trung vào loài nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa).
- Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm dược lý - độc chất: Động vật thực nghiệm khỏe mạnh gồm thỏ, chuột nhắt trắng và chuột cống trắng; dịch nghiền nấm tươi Amanita virosa; thuốc thử nghiệm gồm silibinin (dạng tiêm) và silymarin (dạng uống).
- Không gian và thời gian: Nghiên cứu thực địa, điều tra dịch tễ học và thu thập mẫu thực vật tại tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến năm 2016; các nội dung thực nghiệm độc tính, sinh hóa, huyết học, giải phẫu bệnh và can thiệp dược lý được triển khai tại các phòng thí nghiệm của Học viện Quân y.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các thành tựu nghiên cứu về nấm độc trên thế giới và tại Việt Nam theo các nhóm nội dung chính:
1. Dịch tễ học ngộ độc nấm
- Thế giới: Báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 1990) ghi nhận ngộ độc nấm chiếm 2,1% tổng số ca ngộ độc; năm 1996 các trung tâm chống độc ghi nhận trên 12.000 ca (tỷ lệ 5 ca/100.000 dân). Thống kê của Hiệp hội Nấm Bắc Mỹ (2005 - 2007) và tác giả Beug M. cùng cộng sự (2006) phân tích 1.641 ca ngộ độc, chỉ ra amatoxin chiếm tỷ lệ tử vong 11%. Tại Thụy Sỹ (2016) có 446 cuộc gọi tư vấn độc học nấm; Thái Lan (Apiwat T. và CS, 2008 - 2017) ghi nhận 1.200 - 2.000 ca/năm với tỷ lệ mắc 1,86 - 3,34/100.000 dân. Tại Châu Âu (1982), ngộ độc A. phalloides gây tử vong 16,5% ở người lớn và 51,3% ở trẻ em. Tại Pháp, tác giả Lima A. ghi nhận 1.675 ca ngộ độc nấm mỗi năm.
- Việt Nam: Hoàng Công Minh và cộng sự đã công bố dữ liệu dịch tễ tại Hà Giang (2004 - 2007: 33 vụ, 165 người mắc, 24 tử vong) và Cao Bằng (2003 - 2009: 29 vụ, 81 người mắc, 17 tử vong). Các ghi nhận khác tại Lào Cai (2005 - 2011: 13 vụ, 36 người mắc, 8 tử vong), Sơn La (2007 - 2011: 19 vụ, 75 người mắc, 7 tử vong), Lạng Sơn (2001 - 2008: 20 vụ, 81 người mắc, 8 tử vong), cùng các vụ ngộ độc tại Phú Thọ, Yên Bái, Lai Châu và Hà Nội (như nấm vàng Cu Ba tại Phú Xuyên, nấm ô tán trắng phiến xanh tại Hoài Đức).
2. Hệ thống phân loại nấm độc
Luận án tổng kết các hệ thống phân loại nấm độc chính trong y học và độc chất học:
- Phân loại theo chất độc (Groves, 1979): Chia thành 7 nhóm (A. phalloides, A. pantherina, Inocybe & Clitocybe dealbata, Entoloma lividum, Russula & Lactarius, Discomycetes, Coprinus).
- Phân loại theo độc tố (Lincoff, 2007; Ukwuru M. và CS, 2018): Chia thành 8 đến 12 loại độc tố (Amatoxin, Gyromitrin, Orellanin, Muscarin, Ibotenic acid & muscimol, Coprin, Psilocybin & psilocin, Phallotoxin, Virotoxin, Arabitol, Bolesatine, Ergotamine...).
- Phân loại theo hội chứng lâm sàng (Goldfrank L.): Chia thành 14 nhóm dựa trên độc tố, thời gian xuất hiện triệu chứng đầu tiên và cơ quan tổn thương đích.
- Phân loại theo thời gian khởi phát tác dụng: Nấm tác dụng nhanh (triệu chứng xuất hiện trước 6 giờ, thường ít gây tử vong) và nấm tác dụng chậm (triệu chứng xuất hiện sau 6 - 40 giờ, trung bình 12 giờ, thường gây suy gan, suy thận và tử vong).
3. Độc chất học Amatoxin và nấm Amanita virosa
- Cấu trúc phân tử: Michael S. và cộng sự (2014) xác định amatoxin gồm 9 loại phân tử peptit vòng octapeptide liên kết bởi cầu nối tryptophan - cysteine, trong đó $\alpha$-amanitin và $\beta$-amanitin đóng vai trò độc lực chính.
- Cơ chế gây độc: Hấp thu qua đường tiêu hóa, được vận chuyển đặc hiệu vào tế bào gan thông qua polypeptide vận chuyển anion hữu cơ 1B3 (OATP 1B3) và đồng vận chuyển natri taurocholat (NTCP). Tại nhân tế bào gan, $\alpha$-amanitin liên kết mạnh với cầu nối helix tại lỗ rỗng 1 của enzyme RNA Polymerase II (Brueckner F.), làm tê liệt quá trình phiên mã và tổng hợp protein. Ngoài ra, amatoxin kích hoạt quá trình apoptosis thông qua con đường tích lũy protein p53 tại ty thể và giải phóng Cytochrome C, đồng thời kích thích quá trình peroxy hóa lipid tạo các gốc oxy hóa tự do.
- Dược động học: Jaeger A. và cộng sự (1990, 1993) chứng minh amatoxin đào thải qua nước tiểu từ 90 - 120 phút sau ăn, nồng độ trong nước tiểu cao gấp 20 - 40 lần (thậm chí 100 - 150 lần) trong huyết thanh. Độc tố có chu trình gan - ruột kéo dài đến ngày thứ 4 - 5, qua được hàng rào nhau thai (Kauffmann M., 1978) và bài tiết qua sữa mẹ.
4. Phác đồ điều trị và đối kháng đặc hiệu
- Loại bỏ độc chất: Than hoạt tính đa liều ($0,5\text{ g/kg}$ mỗi 4 giờ trong 4 ngày) giúp ngắt chu trình gan - ruột. Lọc máu hấp phụ, lọc tách huyết tương hấp phụ (FPSA), hệ thống tái tuần hoàn hấp phụ phân tử (MARS - Shi Y.), thay huyết tương.
- Thuốc ức chế hấp thu: Silibinin dihemisuccinate tiêm tĩnh mạch liều khởi đầu $5\text{ mg/kg}$, duy trì $20\text{ mg/kg/ngày}$ trong 6 ngày (Ganzert et al.); Penicillin G liều cao ($300.000\text{ UI/kg/ngày}$, tối đa 40 triệu UI); Ceftazidime; Silymarin đường uống ($50 - 100\text{ mg/kg}$ mỗi 8 giờ, tăng tối đa $200\text{ mg/kg/liều}$).
Bảng tổng hợp: Phân loại ngộ độc nấm theo hội chứng (Goldfrank L.)
| Thứ tự |
Hội chứng ngộ độc |
Độc tố chính |
Thời gian khởi phát |
Cơ quan tổn thương |
Loài nấm điển hình |
| 1 |
Kích thích dạ dày - ruột cấp |
Độc tố kích thích tiêu hóa |
$< 6\text{ giờ}$ ($< 3\text{ giờ}$) |
Dạ dày, ruột |
Chlorophyllum molybdites, Clitocybe nebularis |
| 2 |
Nhóm gây ảo giác |
Psilocybin, psilocin |
$30\text{ phút} - 2\text{ giờ}$ |
Thần kinh trung ương |
Psilocybe cubensis, Conocybe cyanopus |
| 3 |
Kích thích và ức chế TKTW |
Ibotenic acid, muscimol |
$30\text{ phút} - 2\text{ giờ}$ |
Não bộ, TKTW |
Amanita muscaria, Amanita pantherina |
| 4 |
Cường cholinergic |
Muscarine |
$30\text{ phút} - 2\text{ giờ}$ |
Thần kinh đối giao cảm |
Inocybe fastigiata, Boletus calopus |
| 5 |
Phản ứng giống Disulfiram |
Coprine |
$30\text{ phút} - 2\text{ giờ}$ (khi uống rượu) |
Chuyển hóa Aldehyd |
Coprinus atramentarius, Clitocybe clavipes |
| 6 |
Tổn thương thận xuất hiện muộn |
Allenic norleucine |
$30\text{ phút} - 3\text{ giờ}$ (ruột), $12 - 24\text{ giờ}$ (thận) |
Tiêu hóa, thận |
Amanita smithiana |
| 7 |
Tổn thương gan và tiêu hóa xuất hiện muộn |
Amatoxins, Phallotoxins |
$6 - 24\text{ giờ}$ |
Gan, thận, tiêu hóa |
Amanita virosa, A. phalloides, A. verna, Galerina autumnalis |
| 8 |
Co giật, tổn thương gan muộn |
Gyromitrin |
$4 - 10\text{ giờ}$ |
Gan, tiêu hóa, TKTW, máu |
Gyromitra esculenta, Sarcosphaera coronaria |
| 9 |
Suy thận xuất hiện muộn |
Orellanine, cortinarin |
$3 - 20\text{ ngày}$ |
Thận |
Cortinarius orellanus, Mycena pura |
| 10 |
Tiêu cơ vân |
Chưa xác định |
$24 - 72\text{ giờ}$ |
Cơ vân, tim |
Tricholoma equestre |
| 11 |
Đau bỏng rát đầu chi |
Acromelic acid |
$> 24\text{ giờ}$ |
Thần kinh ngoại vi, da |
Clitocybe acromelalga |
| 12 |
Bệnh lý não chậm |
Polyporic acid |
$> 12\text{ giờ} - \text{vài ngày}$ |
Não, gan, thận |
Pleurocybella porrigens, Hapalopilus rutilans |
| 13 |
Tan máu tự miễn |
Kháng thể tự miễn với nấm |
Tái xuất hiện khi ăn lại |
Hệ tạo máu |
Paxillus involutus |
| 14 |
Dị ứng đường hô hấp |
Bào tử nấm |
$< 6\text{ giờ}$ |
Phổi, phế quản |
Lycoperdon |
Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết
Luận án giải quyết mắt xích còn thiếu về dữ liệu thực địa tại tỉnh Bắc Kạn: cung cấp bộ số liệu dịch tễ học giai đoạn 2004 - 2016; xác lập đặc điểm nhận dạng thực vật học của nấm Amanita virosa tại địa phương bằng phản ứng hóa màu KOH $5 - 10%$; xác định chính xác các chỉ số độc tính cấp ($LD_{50}$, $LD_{100}$, $LD_{min}$) trên 3 loài động vật; đánh giá định lượng biến đổi huyết động học, các thông số sinh hóa tế bào gan, chức năng lọc cầu thận, đông máu, huyết học, trọng lượng tạng và tổn thương vi thể gan - thận; từ đó cung cấp bằng chứng thực nghiệm về hiệu quả điều trị của silibinin tiêm truyền và silymarin uống.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết
- Độc lực học phân tử: Cơ chế gắn chọn lọc của $\alpha$-amanitin vào RNA Polymerase II làm bất hoạt quá trình sao chép nucleotide, dẫn đến ngừng dịch mã protein tế bào gan và gây hoại tử tế bào gan diện rộng. Cơ chế phối hợp của virotoxin và phallotoxin gây rối loạn tính thấm màng tế bào với ion $\text{Ca}^{2+}$ và gắn bất thường vào sợi actin.
- Cơ chế tác dụng của thuốc bảo vệ gan: Silibinin (chất chiết xuất từ cây Silybum marianum) ức chế cạnh tranh với amatoxin tại vị trí thụ thể OATP 1B3 và NTCP trên màng tế bào gan, ngăn cản độc tố xâm nhập vào nội bào; đồng thời kích thích RNA Polymerase I thúc đẩy tổng hợp protein tái tạo tế bào gan và dọn dẹp gốc tự do. Silymarin dạng uống đóng vai trò cung cấp tiền chất silibinin qua đường tiêu hóa khi không có sẵn chế phẩm tiêm truyền tĩnh mạch.
Phương pháp nghiên cứu thực tế
Nghiên cứu kết hợp phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang, điều tra thực địa và thực nghiệm dược lý - độc chất học trên động vật:
-
Phương pháp điều tra dịch tễ học:
- Thu thập thông tin hồi cứu và tiến cứu về các vụ ngộ độc nấm tại Bắc Kạn giai đoạn 2004 - 2016 qua hồ sơ lưu trữ tại Trung tâm Y tế dự phòng, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm và các bệnh viện, trạm y tế trên địa bàn.
- Thống kê các biến số: số vụ, số người mắc, số ca tử vong, phân bố theo năm, tháng, đơn vị hành chính, lứa tuổi, giới tính, dân tộc, quy mô vụ ngộ độc, triệu chứng lâm sàng, thời gian ủ bệnh và can thiệp xử trí y tế ban đầu.
-
Phương pháp nghiên cứu thực vật học và định danh nấm:
- Khảo sát thực địa tại các địa phương xảy ra ngộ độc ở Bắc Kạn, thu thập nguyên mẫu nấm tươi, chụp ảnh, bảo quản mẫu trong túi giấy lạnh.
- Phân tích đặc điểm hình thái học (mũ nấm, phiến nấm, cuống nấm, vòng cuống, bao gốc hình đài hoa) và tiến hành nghiệm pháp hóa học nhỏ dung dịch $\text{KOH } 5 - 10%$ lên mũ nấm (chuyển màu vàng đặc trưng đối với Amanita virosa).
-
Phương pháp thực nghiệm xác định độc tính cấp:
- Chuẩn bị dịch nghiền nấm độc trắng hình nón tươi mọc tại Bắc Kạn.
- Xác định liều gây chết $LD_{50}$, $LD_{100}$, $LD_{min}$ bằng đường uống/đưa vào dạ dày trên chuột nhắt trắng, chuột cống trắng và thỏ.
- Đo đạc liên tục các chỉ số huyết động (tần số mạch, huyết áp tâm thu HATT, huyết áp tâm trương HATr) trên chuột cống trắng gây ngộ độc.
-
Phương pháp đánh giá các chỉ số sinh học và tổn thương tạng trên thỏ:
- Sinh hóa huyết thanh: Đo hoạt độ men gan (GOT, GPT, GGT), nồng độ Bilirubin toàn phần; đánh giá chức năng thận và chuyển hóa (ure, creatinin, điện giải đồ $\text{Na}^+, \text{K}^+, \text{Cl}^-$, canxi toàn phần, CPK, protein, albumin, glucose).
- Huyết học và đông máu: Đo số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, nồng độ huyết sắc tố (HST); xác định thời gian máu đông, thời gian máu chảy.
- Trọng lượng tạng và mô bệnh học: Cân trọng lượng gan, thận, lách vào ngày thứ 6 sau ngộ độc; mổ tử thiết lấy bệnh phẩm gan, thận làm tiêu bản nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) để đọc tổn thương đại thể và vi thể dưới kính hiển vi quang học.
-
Phương pháp khảo sát hiệu quả điều trị của thuốc:
- Bố trí các lô thỏ thực nghiệm gây ngộ độc bằng dịch nghiền Amanita virosa:
- Lô chứng bệnh lý (gây ngộ độc không điều trị).
- Lô điều trị bằng Silibinin tiêm truyền theo sơ đồ thực nghiệm chuyên biệt.
- Lô điều trị bằng Silymarin đường uống theo các mức liều khảo sát.
- Đánh giá sự hồi phục của các chỉ số sinh hóa, huyết học, đông máu, tỷ lệ sống sót và hình ảnh vi thể gan - thận giữa các lô.
-
Phương pháp xử lý số liệu và đạo đức nghiên cứu:
- Xử lý số liệu bằng các thuật toán thống kê y sinh học thông dụng. Nghiên cứu tuân thủ các quy chuẩn đạo đức trong nghiên cứu y sinh học và thực nghiệm trên động vật.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 trình bày tổng quan hệ thống lý thuyết và y văn cập nhật về nấm độc:
- Phân tích các chi nấm độc lớn trên thế giới và tại Việt Nam.
- Trình bày chi tiết đặc điểm sinh thái, nhận dạng hình thái của nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa): mũ nấm màu trắng (đường kính $4 - 10\text{ cm}$), đỉnh nhọn hình nón, phản ứng $\text{KOH } 5 - 10%$ hóa vàng; phiến nấm và cuống nấm màu trắng, có vòng cuống, chân phình dạng củ và có bao gốc dạng đài hoa.
- Phân tích cấu trúc phân tử của 9 loại amatoxin và sự phân bố hàm lượng amatoxin, phallotoxin, virotoxin, amaninamid theo các vùng địa lý khác nhau (châu Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ, Việt Nam).
- Phân tích cơ chế bệnh sinh ở mức độ tế bào: ức chế RNA Polymerase II, con đường chết tế bào apoptosis phụ thuộc p53, quá trình stress oxy hóa màng lipid.
- Trình bày diễn tiến lâm sàng ngộ độc nấm amatoxin qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 ($6 - 12\text{ giờ}$ sau ăn): Viêm dạ dày - ruột cấp, đau bụng, nôn ói dữ dội, tiêu chảy toàn nước phân nhầy máu giống tả, mất nước, rối loạn điện giải toan chuyển hóa.
- Giai đoạn 2 ($24 - 36\text{ giờ}$ sau ăn): Giai đoạn "lui bệnh giả", triệu chứng tiêu hóa giảm nhưng men gan (GOT, GPT), bilirubin bắt đầu tăng nhanh, đạt đỉnh lúc $60 - 72\text{ giờ}$.
- Giai đoạn 3 ($48 - 96\text{ giờ}$ sau ăn): Hoại tử tế bào gan tối cấp, suy gan mất bù, rối loạn đông máu, hôn mê gan, suy thận cấp, suy đa tạng và tử vong từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 16.
- Tổng hợp các phác đồ điều trị hồi sức tích cực, tăng cường thải độc (than hoạt đa liều, bài niệu, dẫn lưu mật mũi qua hỗng tràng, FPSA, MARS) và sử dụng thuốc đối kháng chọn lọc (Silibinin, Penicillin G, Silymarin).
Bảng cấu trúc phân tử các loại Amatoxin (Michael S. và CS)
| Loại Amatoxin |
$\text{R}_1$ |
$\text{R}_2$ |
$\text{R}_3$ |
$\text{R}_4$ |
$\text{R}_5$ |
| $\alpha$-amanitin |
$\text{NH}_2$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
| $\beta$-amanitin |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
| $\gamma$-amanitin |
$\text{NH}_2$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{H}$ |
$\text{OH}$ |
| $\varepsilon$-amanitin |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{H}$ |
$\text{OH}$ |
| Amaninamide |
$\text{NH}_2$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{H}$ |
| Amanullin |
$\text{NH}_2$ |
$\text{OH}$ |
$\text{H}$ |
$\text{H}$ |
$\text{OH}$ |
| Proamanullin |
$\text{NH}_2$ |
$\text{H}$ |
$\text{H}$ |
$\text{H}$ |
$\text{OH}$ |
| Amanin |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{H}$ |
| Amanullinic acid |
$\text{OH}$ |
$\text{OH}$ |
$\text{H}$ |
$\text{H}$ |
$\text{OH}$ |
Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết thiết kế nghiên cứu:
- Nghiên cứu dịch tễ: Thiết kế nghiên cứu dịch tễ học mô tả cắt ngang toàn bộ các ca ngộ độc nấm tại 8 đơn vị hành chính cấp huyện/thị xã của tỉnh Bắc Kạn từ năm 2004 đến 2016.
- Nghiên cứu thực nghiệm:
- Mẫu nấm Amanita virosa tươi thu hái tại Bắc Kạn, bảo quản lạnh đúng quy chuẩn và chế dịch nghiền nồng độ xác định.
- Hóa chất và thuốc: Dung dịch chuẩn Silibinin tiêm truyền tĩnh mạch; chế phẩm viên nang Silymarin đường uống chứa $50%$ silibinin; dung dịch $\text{KOH } 5 - 10%$; bộ kit xét nghiệm sinh hóa, đông máu, huyết học tự động.
- Thiết lập 2 sơ đồ thí nghiệm can thiệp:
- Sơ đồ 1: Khảo sát tác dụng của Silibinin đường tiêm trên thỏ gây ngộ độc nấm độc trắng hình nón.
- Sơ đồ 2: Khảo sát tác dụng của Silymarin đường uống trên thỏ gây ngộ độc nấm độc trắng hình nón.
- Đánh giá động học huyết áp trên chuột cống; đo hoạt độ enzyme gan, chức năng thận, protein, đông máu ở các thời điểm trước và sau ngộ độc (ngày 1, 2, 3, 6); xác định trọng lượng gan, lách, thận vào ngày thứ 6 và lấy bệnh phẩm mô học.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
Chương 3 trình bày các kết quả định lượng:
1. Thực trạng ngộ độc nấm tại Bắc Kạn (2004 - 2016) và các loài nấm độc
- Dữ liệu dịch tễ học ghi nhận diễn biến số vụ ngộ độc, số người mắc và số ca tử vong qua 13 năm tại các huyện của tỉnh Bắc Kạn.
- Phân bố ngộ độc tập trung chủ yếu vào các tháng mùa xuân và đầu hè (thời điểm nấm rừng phát triển mạnh).
- Đối tượng mắc bệnh phân bố ở nhiều lứa tuổi, cả hai giới, phần lớn là đồng bào các dân tộc thiểu số tại địa phương (Tày, Nùng, Dao, Mông).
- Triệu chứng xuất hiện đầu tiên chủ yếu là rối loạn tiêu hóa cấp; thời gian xuất hiện triệu chứng đầu tiên có mối tương quan chặt chẽ với tỷ lệ sống sót hoặc tử vong (các ca ủ bệnh kéo dài $> 6\text{ giờ}$ có tỷ lệ tổn thương gan nặng và tử vong cao).
- Tỷ lệ người bị ngộ độc được xử trí cấp cứu ban đầu tại trạm y tế xã trước khi chuyển tuyến và tỷ lệ được điều trị tại bệnh viện tỉnh/huyện.
- Định danh các loài nấm độc có mặt tại Bắc Kạn: Nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa), nấm xốp gây nôn, nấm ma, nấm mực nhỏ mọc cụm, nấm phiến đốm bướm, nấm phiến đốm chuông, nấm phiến đốm xanh.
2. Độc tính của nấm Amanita virosa trên động vật thực nghiệm
- Xác định các ngưỡng liều gây chết $LD_{50}$, $LD_{100}$, $LD_{min}$ của dịch nghiền nấm tươi trên chuột nhắt trắng, chuột cống trắng và thỏ.
- Ghi nhận sự biến đổi chỉ số mạch, tụt huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương trên chuột cống trắng nhiễm độc.
- Trên thỏ ngộ độc không điều trị:
- Tăng vọt hoạt độ GOT, GPT, GGT và Bilirubin toàn phần trong huyết thanh, đạt đỉnh vào ngày thứ 2 - thứ 3.
- Suy giảm chức năng thận: Nồng độ ure, creatinin huyết thanh tăng cao; biến đổi nồng độ điện giải ($\text{Na}^+, \text{K}^+, \text{Cl}^-$, canxi toàn phần) và enzyme CPK.
- Giảm protein toàn phần, giảm albumin huyết thanh, biến đổi nồng độ glucose máu.
- Huyết học và đông máu: Rối loạn số lượng bạch cầu, tiểu cầu, hồng cầu và huyết sắc tố; kéo dài rõ rệt thời gian máu đông và thời gian máu chảy.
- Trọng lượng cơ quan: Thay đổi khối lượng gan, thận, lách vào ngày thứ 6 sau ngộ độc.
3. Hiệu quả điều trị của Silibinin và Silymarin
- Nhóm điều trị bằng Silibinin đường tiêm: Cải thiện rõ rệt các chỉ số men gan (GOT, GPT, GGT), giảm bilirubin toàn phần; kiểm soát mức tăng ure và creatinin; duy trì ổn định protein và albumin máu; rút ngắn thời gian máu đông và máu chảy về gần giới hạn bình thường; giảm tỷ lệ tử vong ở động vật thực nghiệm.
- Nhóm điều trị bằng Silymarin đường uống: Giảm đáng kể hoạt độ transaminase gan (GOT, GPT) và GGT; cải thiện nồng độ ure, creatinin và CPK huyết thanh; hạn chế rối loạn đông máu so với nhóm không điều trị.
- Kết quả giải phẫu bệnh đại thể và vi thể:
- Nhóm không điều trị: Gan hoại tử tế bào gan diện rộng, thoái hóa mỡ nặng, xung huyết tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy; thận tổn thương hoại tử biểu mô ống lượn, phù nề mô kẽ.
- Nhóm điều trị Silibinin tiêm và Silymarin uống: Mức độ tổn thương mô gan và biểu mô ống thận giảm rõ rệt, cấu trúc bè gan được bảo tồn tốt hơn, giảm mức độ thâm nhiễm viêm và hoại tử tế bào.
Bảng danh mục bảng biểu và số liệu chính trong Chương 3 của luận án
| Số hiệu bảng |
Tên bảng số liệu trong luận án |
Nội dung số liệu thể hiện |
| Bảng 3.1 |
Số vụ ngộ độc nấm độc, số người bị và tử vong theo năm |
Thống kê số liệu dịch tễ Bắc Kạn giai đoạn 2004 - 2016 |
| Bảng 3.2 |
Số vụ ngộ độc nấm độc, số người bị và tử vong tại các huyện |
Phân bố dịch tễ theo địa bàn hành chính cấp huyện |
| Bảng 3.3 |
Số lượng và tỷ lệ người ngộ độc nấm điều trị tại bệnh viện |
Tỷ lệ tiếp cận điều trị tuyến bệnh viện |
| Bảng 3.4 |
Số lượng và tỷ lệ người được xử trí tại trạm y tế xã |
Đánh giá năng lực cấp cứu ban đầu tại y tế cơ sở |
| Bảng 3.5 |
Tương quan thời gian xuất hiện triệu chứng và tỷ lệ sống |
Mối liên hệ giữa thời gian ủ bệnh và tiên lượng sống |
| Bảng 3.6 |
Danh mục các loài và nơi phát hiện nấm độc tại Bắc Kạn |
Danh mục thực vật học các loài nấm độc tại thực địa |
| Bảng 3.7 |
$LD_{50}$, $LD_{100}$, $LD_{min}$ của nấm độc trắng hình nón tươi |
Ngưỡng liều độc tính cấp trên thỏ, chuột nhắt, chuột cống |
| Bảng 3.8 |
Thay đổi mạch, HATT, HATr ở chuột cống trắng |
Động học huyết động học khi ngộ độc nấm |
| Bảng 3.9 |
Thay đổi GOT, GPT, GGT, Billirubin TP trên thỏ |
Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan của nấm |
| Bảng 3.10 |
Thay đổi urê, creatinin, điện giải, CPK trên thỏ |
Đánh giá suy giảm chức năng thận và hủy hoại cơ |
| Bảng 3.11 |
Thay đổi protein, albumin, glucose trên thỏ |
Đánh giá chức năng tổng hợp của gan |
| Bảng 3.12 |
Thay đổi hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu, HST trên thỏ |
Đánh giá biến đổi huyết học |
| Bảng 3.13 |
Thay đổi thời gian máu đông, máu chảy trên thỏ |
Đánh giá rối loạn đông máu |
| Bảng 3.14 |
Thay đổi trọng lượng gan, lách, thận ngày thứ 6 trên thỏ |
Đánh giá biến đổi khối lượng cơ quan đích |
| Bảng 3.15 - 3.20 |
Các chỉ số sinh hóa, huyết học, đông máu khi điều trị Silibinin tiêm |
Hiệu quả phục hồi của phác đồ Silibinin tiêm truyền |
| Bảng 3.21 - 3.24 |
Các chỉ số sinh hóa, đông máu, trọng lượng tạng khi điều trị Silymarin uống |
Hiệu quả phục hồi của phác đồ Silymarin đường uống |
Chương 4: Bàn luận
Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các phát hiện nghiên cứu với y văn trong nước và quốc tế:
- Bàn luận về dịch tễ học: Phân tích quy luật mùa vụ ngộ độc nấm tại Bắc Kạn (trùng khớp với mùa sinh trưởng của nấm rừng vùng Đông Bắc); đặc điểm phân bố theo dân tộc thiểu số và tập quán đi rừng; phân tích nguyên nhân các vụ ngộ độc cả gia đình do cùng ăn một bữa nấm; thời gian ủ bệnh kéo dài ($> 6\text{ giờ}$) là yếu tố then chốt dẫn đến chẩn đoán muộn và tổn thương gan tiến triển nặng.
- Bàn luận về độc tính học: So sánh độc lực của nấm Amanita virosa Bắc Kạn với các mẫu nấm Amanita tại châu Âu và Bắc Mỹ; phân tích tác động làm tụt huyết áp và loạn nhịp tim; cơ chế tăng vọt men gan transaminase do hoại tử tế bào gan cấp tính; sự suy giảm albumin và rối loạn các yếu tố đông máu do suy chức năng tổng hợp gan; cơ chế tổn thương thận thứ phát do độc tố trực tiếp và do hội chứng gan - thận.
- Bàn luận về hiệu quả can thiệp thuốc:
- Khẳng định vai trò của Silibinin tiêm truyền trong việc ức chế cạnh tranh kênh vận chuyển OATP 1B3 và NTCP, giúp bảo vệ tế bào gan còn lại và kích thích tái tạo nhu mô.
- Phân tích cơ sở khoa học của việc sử dụng Silymarin đường uống liều cao như một giải pháp thay thế khả thi tại các cơ sở y tế tuyến huyện/tỉnh khi chưa có sẵn Silibinin đường tiêm.
- Bàn luận về mối tương quan giữa sự cải thiện các chỉ số sinh hóa, đông máu với sự phục hồi vi thể trên tiêu bản giải phẫu bệnh gan - thận.
- Các hạn chế của đề tài: Tác giả phân tích các hạn chế thực tế gồm: việc định lượng nồng độ amatoxin trực tiếp trong dịch sinh học (máu, nước tiểu) bệnh nhân bằng kỹ thuật ELISA hoặc HPLC chưa triển khai được thường quy tại tuyến cơ sở; các khó khăn trong việc thu thập nguyên vẹn mẫu nấm thức ăn thừa tại các hộ gia đình vùng sâu vùng xa; và những giới hạn nhất định khi ngoại suy liều điều trị từ mô hình động vật thực nghiệm sang cơ thể người.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp về mặt khoa học lý luận và thực tiễn
- Dữ liệu dịch tễ học toàn diện: Luận án cung cấp bộ số liệu dịch tễ học hệ thống về ngộ độc nấm tại tỉnh Bắc Kạn trong giai đoạn 13 năm (2004 - 2016), làm rõ mối liên quan giữa thời gian xuất hiện triệu chứng, tập quán sinh hoạt của các dân tộc và tiên lượng tử vong.
- Định danh thực vật học tại thực địa: Xác định danh mục các loài nấm độc tại Bắc Kạn; khẳng định sự hiện diện của nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) chứa độc tố amatoxin; đưa ra quy trình nhận dạng hình thái kết hợp phản ứng hóa học nhanh với dung dịch $\text{KOH } 5 - 10%$ (đổi sang màu vàng đặc trưng) giúp phân biệt tại chỗ với các loài nấm ăn thông thường.
- Bộ dữ liệu thực nghiệm độc tính cấp: Xác định chính xác các thông số $LD_{50}$, $LD_{100}$, $LD_{min}$ của dịch nấm tươi Amanita virosa bản địa trên ba loài động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng, chuột cống trắng, thỏ); mô tả đầy đủ các biến đổi huyết động, men gan, chức năng thận, công thức máu, đông máu và tổn thương giải phẫu bệnh đại thể - vi thể.
- Bằng chứng dược lý điều trị bảo vệ tế bào gan: Chứng minh trên thực nghiệm hiệu quả bảo vệ tế bào gan, cải thiện các chỉ số sinh hóa máu, chức năng đông máu và cấu trúc vi thể gan - thận của Silibinin đường tiêm và Silymarin đường uống; tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc xây dựng phác đồ điều trị ngộ độc nấm Amanita tại các cơ sở y tế.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất
- Tăng cường công tác truyền thông, giáo dục sức khỏe cộng đồng cho người dân các xã vùng sâu, vùng xa tại Bắc Kạn về cách nhận biết nấm độc, khuyến cáo không thu hái và ăn nấm rừng tự nhiên có hình thái màu trắng có bao gốc dạng đài hoa.
- Trang bị kiến thức và quy trình chẩn đoán sớm ngộ độc nấm cho cán bộ y tế tuyến xã, huyện: khi phát hiện ca ngộ độc có thời gian ủ bệnh kéo dài $> 6\text{ giờ}$, cần xử trí ngay than hoạt đa liều, truyền dịch bồi phụ nước - điện giải và chuyển tuyến điều trị kịp thời.
- Dự trữ thuốc đối kháng đặc hiệu: Khuyến cáo các cơ sở điều trị dự trữ Silibinin đường tiêm; trong điều kiện chưa có Silibinin tiêm truyền, có thể áp dụng phác đồ Silymarin đường uống liều cao kết hợp điều trị hồi sức tích cực.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Chưa thực hiện được xét nghiệm định lượng chuyên biệt nồng độ $\alpha$-amanitin và $\beta$-amanitin trong máu và nước tiểu của bệnh nhân và động vật thực nghiệm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc miễn dịch gắn enzyme (ELISA) do điều kiện trang thiết bị tại thực địa còn hạn chế.
- Việc thu thập mẫu nấm trong các vụ ngộ độc thực tế tại cộng đồng gặp nhiều khó khăn do nấm thường đã bị chế biến hết hoặc bị dập nát, ảnh hưởng đến việc định danh hình thái nguyên bản.
- Nghiên cứu can thiệp thuốc mới dừng lại ở mô hình động vật thực nghiệm (thỏ), chưa thể tiến hành thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng trên người do tính chất cấp cứu và đạo đức y sinh học trong ngộ độc cấp.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Hoàn thiện và chuyển giao quy trình kỹ thuật xét nghiệm nhanh độc tố amatoxin trong dịch sinh học ứng dụng tại các trung tâm chống độc và bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh.
- Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa liều lượng và phác đồ phối hợp giữa Silymarin đường uống với các biện pháp lọc máu hiện đại (FPSA, MARS, thay huyết tương) trong điều trị suy gan cấp do ngộ độc nấm amatoxin trên lâm sàng.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao đối với nhiều nhóm đối tượng:
- Bác sĩ Hồi sức cấp cứu và Chống độc: Cung cấp cơ sở khoa học để chẩn đoán phân biệt, đánh giá giai đoạn bệnh và chỉ định kịp thời các biện pháp giải độc (than hoạt đa liều, Silibinin tiêm truyền, Silymarin uống liều cao).
- Cán bộ Y tế dự phòng và Quản lý An toàn vệ sinh thực phẩm: Cung cấp dữ liệu dịch tễ học và các đặc điểm nhận dạng thực vật học của các loài nấm độc tại miền núi phía Bắc để xây dựng các tài liệu truyền thông phòng chống ngộ độc sát với thực tế địa phương.
- Giảng viên, Nghiên cứu sinh và Học viên ngành Y - Dược: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu độc chất học thực nghiệm, thiết kế mô hình đánh giá chức năng gan - thận - đông máu trên động vật và phương pháp xử lý số liệu y sinh học.
Câu hỏi thường gặp
1. Dấu hiệu nhận dạng đặc trưng nhất của nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa) là gì?
Nấm độc trắng hình nón có toàn thân màu trắng muốt, mũ nấm hình nón hoặc chóp nón (đường kính $4 - 10\text{ cm}$), thịt nấm có mùi khó chịu. Cuống nấm màu trắng, có vòng cuống màu trắng, chân cuống phình dạng củ và có bao gốc hình đài hoa ôm lấy chân nấm. Phản ứng hóa học đặc trưng là khi nhỏ dung dịch $\text{KOH } 5 - 10%$ lên mũ nấm, vùng tiếp xúc sẽ chuyển ngay sang màu vàng tươi (giúp phân biệt với nấm độc tán trắng Amanita verna).
2. Độc tố Amatoxin gây tổn thương và hoại tử tế bào gan theo những cơ chế phân tử nào?
Độc tố amatoxin (chủ yếu là $\alpha$-amanitin) thâm nhập vào tế bào gan qua thụ thể OATP 1B3 và NTCP. Tại nhân tế bào, độc tố gắn chặt vào lỗ rỗng 1 của enzyme RNA Polymerase II, ức chế quá trình phiên mã tổng hợp mRNA, làm ngừng trệ hoàn toàn quá trình tổng hợp protein nội bào. Ngoài ra, độc tố còn phosphoryl hóa làm chậm phân hủy protein p53, thúc đẩy giải phóng Cytochrome C từ ty thể vào bào tương kích hoạt quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis), kết hợp với việc gia tăng quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào tạo ra các gốc tự do hủy hoại cấu trúc tế bào gan.
3. Diễn tiến lâm sàng của bệnh nhân ngộ độc nấm chứa amatoxin diễn ra qua các giai đoạn nào?
Bệnh cảnh lâm sàng diễn biến điển hình qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 ($6 - 12\text{ giờ}$ sau ăn): Đau quặn bụng, nôn ói nhiều, tiêu chảy ồ ạt phân toàn nước lẫn nhầy máu gây mất nước và rối loạn điện giải nặng.
- Giai đoạn 2 ($24 - 36\text{ giờ}$ sau ăn): Giai đoạn thuyên giảm triệu chứng tiêu hóa tạm thời nhưng men gan (GOT, GPT) và bilirubin bắt đầu tăng nhanh, đạt đỉnh lúc $60 - 72\text{ giờ}$.
- Giai đoạn 3 ($48 - 96\text{ giờ}$ sau ăn): Suy gan tối cấp, hôn mê gan, rối loạn đông máu, suy thận cấp, suy đa tạng dẫn đến tử vong trong vòng $6 - 16\text{ ngày}$.
4. Phác đồ sử dụng Silibinin và Silymarin được khuyến cáo như thế nào trong điều trị?
- Silibinin dihemisuccinate (đường tiêm): Là thuốc đối kháng lựa chọn hàng đầu, tiêm tĩnh mạch liều khởi đầu $5\text{ mg/kg}$, sau đó truyền tĩnh mạch liên tục với liều $20\text{ mg/kg/ngày}$ trong 6 ngày liên tục hoặc cho đến khi chức năng gan hồi phục.
- Silymarin (đường uống): Áp dụng khi không có sẵn chế phẩm Silibinin tiêm truyền; liều khởi đầu $50 - 100\text{ mg/kg}$ (tối đa $2\text{ g}$) mỗi 8 giờ, có thể tăng lên tối đa $200\text{ mg/kg/liều}$ (tối đa $3\text{ g/lần}$) trong 6 ngày, cần phối hợp với thuốc chống nôn (như ondansetron) và bồi phụ nước - điện giải đầy đủ.
5. Tại sao than hoạt đa liều lại là biện pháp bắt buộc trong điều trị ngộ độc nấm amatoxin?
Amatoxin sau khi hấp thu vào cơ thể sẽ được bài tiết qua mật vào ruột và tiếp tục được tái hấp thu trở lại tuần hoàn (chu trình gan - ruột) kéo dài đến ngày thứ 4 - 5 sau khi ăn nấm. Việc sử dụng than hoạt đa liều ($0,5\text{ g/kg}$ mỗi 4 giờ liên tục trong 4 ngày) giúp hấp phụ toàn bộ lượng độc tố được bài tiết qua mật vào lòng ruột, cắt đứt chu trình gan - ruột, tăng cường đào thải chất độc qua phân và làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong.
Kết luận
Luận án tiến sĩ y học của tác giả Ngô Thị Thanh Hải đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu về thực trạng dịch tễ học ngộ độc nấm tại tỉnh Bắc Kạn giai đoạn 2004 - 2016 và xác định được danh mục các loài nấm độc bản địa nguy hiểm, đặc biệt là nấm độc trắng hình nón (Amanita virosa). Công trình đã xây dựng thành công bộ dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về độc tính cấp, biến đổi huyết động, sinh hóa gan - thận, đông máu, huyết học và bệnh học vi thể của dịch nấm tươi trên động vật. Đồng thời, nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả bảo vệ tế bào gan của Silibinin đường tiêm và Silymarin đường uống, cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn có giá trị cao cho công tác dự phòng, chẩn đoán cấp cứu và điều trị ngộ độc nấm độc trong ngành y tế.
