CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10 1. Cấu tạo của Coenzyme Q10 Coenzyme Q10 (CoQ10) có công thức phân tử C59H90O4, trọng lượng phân tử 863,34 g/mol.
CoQ10 có cấu trúc dạng chuỗi dài nằm trên màng sinh chất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực [1]. Đầu của CoQ10 là đầu quinone, nó có chức năng chuyển giao điện tử. Đuôi của CoQ10 là một chuỗi isoprenoid dài, giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [2]. Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [2].
Đặc tính của Coenzyme Q10 1. Đặc tính lý hóa Tính chất vật lý CoQ10 là một chất tinh thể dạng bột có màu vàng đến màu cam, không mùi, không vị. Nhiệt độ nóng chảy của CoQ10 từ 48 -52 oC, tương đối ổn định ở 37 oC [3] và nó bị nhiệt phân (pyrolysis) từ từ khi bị đun lên ở nhiệt độ 120 oC hoặc cao hơn. Hàm lượng CoQ10 không bị thay đổi khi được gói trong giấy bạc do tránh khỏi sự tác động của ánh sáng.
Vì vậy, trong quá trình tách chiết CoQ10 cần bảo vệ mẫu tránh tiếp xúc với ánh sáng và định lượng CoQ10 có thể được tiến hành trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm với thời gian không quá 2 giờ [1]. CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo phức với β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20 % khi có sự kết hợp chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [4, 5]. Tính chất hóa học: CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [6, 7]. Nó rất dễ tan trong luan an 4 chloroform và carbontetra chloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane, tan một phần trong acetone, hầu như không tan trong nước, methanol và ethanol.
CoQ10 kỵ với các tác nhân oxy hóa mạnh, khi tiếp xúc với các hợp chất kiềm tính CoQ10 có thể tạo ra ubichromenol, là một dạng sản phẩm phân hủy.Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ. CoQ10 đóng vai trò chính trong việc chuyển điện tử giữa các phức hợp hô hấp của chuỗi vận chuyển điện tử, nằm trong màng trong ty thể, mà sản phẩm cuối cùng là adenosine triphosphate (ATP). Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp. Chuỗi vận chuyển điện tử [8] Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của Coenzyme Q có thể di chuyển dễ dàng trong lớp màng lipid.
Trong chuỗi hô hấp, CoQ10 chịu trách nhiệm vận chuyển điện tử từ phức hợp protein I (NADH dehydrogenase) đến phức hợp protein II (succinate dehydrogenase) và từ phức hợp II đến phức hợp III (phức hợp bc1) [9]. Khi nhận các electron từ cả phức I và phức II, nó luan an 5 vẫn ở dạng khử là ubiquinol và sau khi chuyển các electron sang phức III, nó trở lại dạng oxy hóa thành ubiquinone [8] (Hình 1. Chính sự khuếch tán của CoQ cùng với Cytochrome C trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quan trọng trong việc luân chuyển các điện tử đến các phức hợp kế nhau trong chuỗi chuyển điện tử [2]. Các cơ quan đòi hỏi nhu cầu năng lượng cao hơn như não, tim, thận và gan có hàm lượng CoQ10 cao hơn.
Chức năng chống oxy hóa CoQ10 là chất chống oxy hóa hòa tan lipid duy nhất được tìm thấy ở người và nó tập trung vào hầu hết mọi màng, từ màng ty thể đến màng lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) [9]. Nhờ tính hòa tan này CoQ10 có thể bảo vệ lipoprotein và lipid khỏi sự peroxy hóa và tổn thương oxy hóa [10]. CoQ10 có thể kết hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác, chẳng hạn như vitamin C và vitamin E để chống lại tác hại của các gốc tự do phát sinh từ các phản ứng trong ty thể tạo ra năng lượng [11]. CoQ10 có khả năng dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống kém hiệu quả hơn so với các vitamin.
Tuy nhiên CoQ10 lại là một chất chống oxy hóa có khả năng tái tạo vitamin E [12]. CoQ10 còn có chức năng bảo vệ màng tế bào, protein và các acid nucleic (DNA, RNA) khỏi quá trình oxy hóa bằng cách trực tiếp ngăn cản tia UV, làm sạch các gốc tự do hoặc gián tiếp bằng cách tái tạo thành α- tocopherol [13, 14]. CoQ10 cũng ức chế collagenase - một loại enzyme phá hủy các mô liên kết của da [8], trao đổi các proton và Ca 2+ qua màng sinh học [15]. CoQ10 có vai trò trong các quá trình sinh lý khác, bao gồm quá trình hình thành liên kết disulfide, oxy hóa sulfide, chuyển hóa pyrimidine [16].
Nguồn thu Coenzyme Q10 CoQ10 được sản xuất từ 3 nguồn thu: từ vi sinh vật (tổng hợp sinh học), các mô động vật và thực vật, tổng hợp từ các chất hóa học (tổng hợp hóa học). Tổng hợp hóa học CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [17]. Phương pháp này sử dụng solanesol một chất nền khởi đầu cho quá trình tổng luan an 6 hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone, sau đó được chuyển đổi thành CoQ10. Solanesol có thể được tổng hợp hoặc dễ dàng thu được bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây [18, 19].
Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl- 4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone. Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [18]. Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này thường trải qua nhiều bước và tốn kém rất nhiều chi phí liên quan đến các phản ứng xúc tác năng lượng cao do sử dụng chất nền đắt tiền và gây ra nhiều ảnh hưởng tới môi trường bởi các chất thải hóa học được tạo ra nhiều từ quá trình sản xuất [18]. Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.
Coenzyme từ động vật và thực vật CoQ10 có trong nhiều loại thực phẩm nhưng với hàm lượng ít, nhưng hàm lượng CoQ10 đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu nành. CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [20]. Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [8, 21]. Ngoài ra, CoQ10 cũng có trong cây thuốc lá (360 μg/g CoQ10), lúa (600 μg/g), các loại quả và các loại rau củ (nhiều nhất là trong bông cải xanh, rau bina, dầu đậu nành, cải dầu, dầu cọ, các loại hạt và cây họ đậu) [22, 23].
Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao. Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế. luan an 7 Bảng 1. Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm [24] Thịt & Cá Rau củ quả Dầu và các loại hạt Tuần lộc 157,9 Trái bơ 9,5 Dầu ô liu (EV) 114-160 Tim bò 113,3 Cây cải dầu 6,7- Dầu đậu phộng 77 (Hoa) 7,4 Tim lợn 118,1-282 Bông cải 5,9- Dầu hạt cải 63,5-73,4 xanh 8,6 Gan gà 116,2- Khoai lang 3,0- Đậu phộng (rang) 26,7 132,2 3,6 Tim cá trích 120,0- Cây me 3,6 Hạt hồ trăn (rang) 20,1 148,4 chua Tim cá thu 105,5- Ớt ngọt 3,3 Quả óc chó 19,0 109,8 (nguyên) 1.
Coenzyme Q10 từ vi sinh vật Cho đến gần đây, sản xuất CoQ10 dựa trên quá trình lên men vi sinh vật được coi là phương pháp khả thi vì khả năng sản xuất các chất đồng phân tự nhiên mạnh về mặt sinh học của CoQ10 với chi phí giảm so với phương pháp tổng hợp hóa học [25, 26]. Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 như Cryptococcus laurentii, Trichosporon sp., Sporobolomyces salmonicolor, và R. sphaeroides và các loại nấm men khác như Candida, Rhodotorula và Saitoella [25, 37]. Các loài nấm men như Sporidiobolus johnsonii, tích lũy CoQ10 nội bào từ 0,8 đến 3,3 μg/g khối lượng tế bào khô [28].
Schizosaccharomyces pombe cũng là một loại nấm phổ biến để sản xuất protein và CoQ10 [29]. Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu về các điều kiện tối ưu quá trình sản xuất CoQ10 [30]. Trong một số loài luan an 8 nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [31]. Coenzyme Q10 từ vi khuẩn Các vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10 nhiều chủ yếu tập trung ở các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Paracoccus denitrificans và Rhodopseudomonas sphaeroides [25, 26, 27, 32].
Agrobacterium tumefaciens cho thấy năng suất tổng hợp CoQ10 cao nhất [26]. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 Tách chiết bằng phương pháp cơ học Có thể dùng các phương pháp như siêu âm hoặc dùng áp suất để phá vỡ tế bào và thu nhận CoQ10. Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens 1.2554 theo quy trình: sinh khối sau ly tâm bổ sung đệm 2 mM Tris HCl (pH 7,5), tiến hành siêu âm (12 giây on, 10 giây off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút [33]. Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), sử dụng biện pháp cơ học để tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào thô được trộn với 5 mL nước cất và bị phá vỡ ở các áp suất khác nhau (5,5; 16,5; 27,5 hoặc 38,5 MPa) bằng cách sử dụng máy đồng nhất hóa cao (Constant, England) [34].
Tách chiết bằng phương pháp nhiệt độ Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào ướt (0,5 g DCW) được trộn đều với nước cất (2 mL) và để đông lạnh ở -75 oC trong 30 phút, sau đó được làm nóng ở 100 oC trong 30 phút, thêm 5 ml HCl 4N vào dung dịch mẫu. Hỗn hợp được lắc votex trong 20 phút ở 30 oC, sau đó được chiết xuất với 28 ml hỗn hợp n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) và lắc đều trong 5 phút ở 40 oC. Mẫu chiết sau đó được hòa tan trong ethanol 95 %.