Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển aplysia dactylomela và dendrodoris fumata ở vùng biển miền trung việt nam

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata tại miền Trung Việt Nam.

• Tác giả: Phạm Thị Mai Hương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Thanh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Ung Thư Từ Sên Biển Aplysia dactylomela Và Dendrodoris fumata
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ MẪU SÊN BIỂN
• 4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LOÀI SÊN BIỂN A. DACTYLOMELA THU TẠI BIỂN LĂNG CÔ TỈNH THỪA THIÊN HUẾ
• 5. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Ung Thư

Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào từ các nguồn tự nhiên, đặc biệt là từ các sinh vật biển, đang ngày càng thu hút sự quan tâm của giới khoa học. Ung thư là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, và việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, hiệu quả hơn là vô cùng cấp thiết. Sên biển, với sự đa dạng sinh học và khả năng sản xuất các hợp chất độc đáo, đã trở thành một nguồn tiềm năng trong việc phát triển các loại dược phẩm kháng ung thư tự nhiên. Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá hoạt tính sinh học biển từ hai loài sên biển: Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata, nhằm xác định các hợp chất có khả năng gây độc tế bào ung thư và cơ chế gây độc của chúng. Các kết quả hứa hẹn sẽ mở ra những hướng đi mới trong việc điều trị ung thư.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Ung Thư Sên Biển

Nghiên cứu sên biển trong lĩnh vực ung thư mang lại nhiều tiềm năng. Các loài sên biển như Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata chứa các hoạt chất sinh học biển có thể gây độc cho tế bào ung thư. Việc nghiên cứu này giúp khám phá các hợp chất từ sên biển, từ đó phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới và hiệu quả hơn.

1.2. Đa Dạng Sinh Học Sên Biển Và Dược Liệu Biển

Sên biển là một nguồn dược liệu biển phong phú. Sự đa dạng sinh học của chúng tạo ra nhiều cơ hội để tìm kiếm các hoạt chất sinh học biển mới. Các hợp chất từ sên biển có thể có hoạt tính gây độc tế bào ung thư tiềm năng, mở ra hướng nghiên cứu và phát triển các dược phẩm.

II. Thách Thức Khám Phá Cơ Chế Gây Độc Tế Bào Ung Thư

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ sên biển cũng đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là xác định chính xác cơ chế gây độc tế bào ung thư của các hợp chất từ sên biển. Hiểu rõ cơ chế gây độc này là rất quan trọng để phát triển các phương pháp điều trị ung thư hiệu quả và an toàn. Bên cạnh đó, việc phân lập và xác định cấu trúc của các hoạt chất sinh học biển từ Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata cũng đòi hỏi các kỹ thuật hiện đại và phức tạp.

2.1. Xác Định Cơ Chế Gây Độc Tế Bào Ung Thư

Xác định cơ chế gây độc tế bào ung thư là một thách thức quan trọng. Điều này đòi hỏi các nghiên cứu về tế bào học ung thư và hoạt tính gây độc của các hợp chất từ sên biển. Việc hiểu rõ cơ chế giúp tối ưu hóa ứng dụng sên biển trong điều trị ung thư.

2.2. Phân Lập Và Xác Định Cấu Trúc Hóa Học

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hoạt chất sinh học biển là một quy trình phức tạp. Cần sử dụng các phương pháp phân tích hóa học và phổ khối lượng để xác định cấu trúc của các hợp chất từ sên biển. Điều này giúp hiểu rõ hơn về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chúng.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Và Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp chiết xuất hiện đại để thu được các chiết xuất sên biển gây độc tế bào từ Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata. Sau khi chiết xuất, các chiết xuất sên biển này được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, sử dụng kỹ thuật MTT. Các hợp chất có hoạt tính gây độc mạnh sẽ được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các phương pháp tế bào học ung thư được sử dụng để xác định cơ chế gây độc của các hợp chất này, bao gồm việc đánh giá khả năng gây apoptosis (cơ chế gây độc tế bào ung thư).

3.1. Quy Trình Chiết Xuất Sên Biển Gây Độc Tế Bào

Quy trình chiết xuất sên biển gây độc tế bào cần được thực hiện cẩn thận để bảo toàn hoạt tính sinh học của các hợp chất từ sên biển. Sử dụng các dung môi phù hợp và các kỹ thuật chiết xuất hiệu quả giúp thu được các chiết xuất sên biển giàu hoạt chất sinh học biển.

3.2. Kỹ Thuật Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào MTT

Kỹ thuật MTT là một phương pháp phổ biến để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào. Kỹ thuật này đo lường khả năng sống sót của tế bào ung thư sau khi tiếp xúc với các chiết xuất sên biển. Kết quả MTT giúp xác định các hợp chất từ sên biển có hoạt tính gây độc mạnh.

3.3. Phân Lập Và Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Hợp Chất

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ sên biển là bước quan trọng để hiểu rõ cơ chế gây độc tế bào ung thư. Sử dụng các phương pháp sắc ký và phổ khối lượng giúp xác định cấu trúc của các hoạt chất sinh học biển.

IV. Kết Quả Hoạt Tính Gây Độc Từ Aplysia Dendrodoris

Nghiên cứu đã xác định được một số hợp chất từ sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata có hoạt tính gây độc tế bào ung thư đáng kể. Các hợp chất này thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư gan, ung thư vú và ung thư phổi. Một số hợp chất đặc biệt hiệu quả trong việc gây ra quá trình apoptosis trong tế bào ung thư, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư dựa trên dược liệu biển. Các dữ liệu nghiên cứu khoa học cũng chỉ ra rằng hoạt tính độc tính tế bào ung thư sên biển có thể khác nhau tùy thuộc vào vị trí địa lý thu thập sên biển.

4.1. Hoạt Tính Gây Độc Của Aplysia Dactylomela

Aplysia dactylomela hoạt tính sinh học thể hiện độc tính tế bào ung thư sên biển trên nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là tế bào ung thư gan. Các hợp chất từ Aplysia dactylomela có khả năng ức chế sự phát triển và gây apoptosis cho tế bào ung thư.

4.2. Hoạt Tính Gây Độc Của Dendrodoris Fumata

Dendrodoris fumata hoạt tính sinh học cũng cho thấy độc tính tế bào ung thư sên biển trên một số dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư vú. Các hợp chất từ Dendrodoris fumata có thể là một nguồn tiềm năng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Dược Phẩm Từ Sên Biển Điều Trị Ung Thư

Kết quả nghiên cứu này mở ra tiềm năng lớn cho việc phát triển các loại dược phẩm từ sên biển để điều trị ung thư. Các hợp chất từ sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata có thể được sử dụng làm tiền chất cho các loại thuốc mới hoặc được phát triển thành các liệu pháp kháng ung thư tự nhiên. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các hợp chất này trên mô hình động vật và con người trước khi chúng có thể được đưa vào sử dụng trong thực tế. Các nghiên cứu khoa học cần tập trung vào đánh giá chính xác độc tính tế bào ung thư sên biển để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng.

5.1. Phát Triển Dược Phẩm Kháng Ung Thư Từ Tự Nhiên

Việc phát triển dược phẩm kháng ung thư tự nhiên từ sên biển là một hướng đi đầy hứa hẹn. Các hoạt chất sinh học biển có thể cung cấp các giải pháp điều trị ung thư hiệu quả và ít tác dụng phụ hơn so với các phương pháp truyền thống.

5.2. Nghiên Cứu Tiền Lâm Sàng Về Hoạt Tính Kháng Ung Thư

Các nghiên cứu khoa học cần tập trung vào đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất từ sên biển trên mô hình động vật. Điều này giúp xác định liều lượng an toàn và hiệu quả trước khi thử nghiệm trên con người.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Độc Tế Bào

Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata đã cung cấp những bằng chứng quan trọng về tiềm năng của các dược liệu biển trong việc điều trị ung thư. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc khám phá sâu hơn cơ chế gây độc của các hợp chất từ sên biển, cũng như đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trên mô hình lâm sàng. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về sàng lọc hoạt tính sinh học quy mô lớn để tìm kiếm thêm các hoạt chất sinh học biển có hoạt tính gây độc tiềm năng.

6.1. Khám Phá Cơ Chế Gây Độc Tế Bào Chi Tiết

Nghiên cứu cần tập trung vào việc khám phá chi tiết cơ chế gây độc tế bào ung thư của các hợp chất từ sên biển. Điều này giúp tối ưu hóa việc sử dụng chúng trong điều trị ung thư.

6.2. Sàng Lọc Hoạt Tính Sinh Học Quy Mô Lớn

Cần có các nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học quy mô lớn để tìm kiếm thêm các hoạt chất sinh học biển có hoạt tính gây độc tiềm năng từ các loài sên biển khác.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền Trung Việt Nam" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Phạm Thị Mai Hương, chuyên ngành Hóa sinh học (mã số 9.16), dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Văn Thanh và PGS. TS. Đỗ Thị Thảo tại Viện Hóa sinh biển thuộc Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hà Nội, 2022).

Thống kê giai đoạn 1946–2019 cho thấy 13,5% thuốc chống ung thư được phê duyệt có nguồn gốc tự nhiên và 25,1% là dẫn xuất của các sản phẩm tự nhiên. Tính đến cuối năm 2020, có chín loại thuốc chống ung thư nguồn gốc từ biển được cấp phép lưu hành, trong đó bốn loại thuốc chứa hoạt chất là dẫn xuất từ sên biển (tiêu biểu như dẫn xuất monomethyl auristatin E từ dolastatin 10 của sên biển Dolabella auricularia). Việt Nam có bờ biển dài trên 3.200 km với nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú. Hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata có trữ lượng lớn tại vùng biển miền Trung nhưng trước thời điểm thực hiện đề tài, các nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ sên biển còn rất hạn chế (mới chỉ có một công bố bước đầu trên loài Phyllidiella pustulosa). Khoảng trống nghiên cứu này đòi hỏi việc khảo sát hệ thống thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư nhằm khai thác nguồn dược liệu biển phục vụ định hướng nghiên cứu hóa dược.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm:

1. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất của ba mẫu thuộc hai loài sên biển thu tại vùng biển Việt Nam.
2. Phát hiện các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào từ các hợp chất phân lập được và nghiên cứu tác động của hoạt chất đến tế bào ung thư trong điều kiện in vitro.

Nhiệm vụ nghiên cứu được văn bản xác định cụ thể theo 4 nội dung:

1. Phân lập các hợp chất từ ba mẫu sên biển thuộc hai loài A. dactylomela và D. fumata bằng phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học.
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được.
4. Đánh giá tác động cảm ứng apoptosis trong tế bào của một số hợp chất tiêu biểu trên một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Ba mẫu sinh vật biển thuộc hai loài:
  • Mẫu sên biển Aplysia dactylomela Rang, 1828 thu thập tại vùng biển Lăng Cô, tỉnh Thừa Thiên Huế (ký hiệu mẫu ASP).
  • Mẫu sên biển Aplysia dactylomela Rang, 1828 thu thập tại vùng biển đảo Hòn Mê, tỉnh Thanh Hóa (ký hiệu mẫu AD).
  • Mẫu sên biển Dendrodoris fumata Rüppell & Leuckart, 1831 thu thập tại vùng biển đảo Hòn Mê, tỉnh Thanh Hóa (ký hiệu mẫu DN).
• Phạm vi không gian: Vùng biển ven bờ và hải đảo thuộc miền Trung Việt Nam (Lăng Cô – Thừa Thiên Huế và đảo Hòn Mê – Thanh Hóa).
• Phạm vi thời gian và thực nghiệm: Mẫu vật tự nhiên được xử lý chiết xuất, phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro hoàn thành năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các nghiên cứu quốc tế và trong nước về sinh học sên biển, các hợp chất tự nhiên và cơ chế tác động chống ung thư:

• Lịch sử nghiên cứu apoptosis: Carl Vogt (1842) mô tả nguyên tắc tự chết của tế bào; Rudolph Virchow (1858) đặt tên hiện tượng chết hoại sinh (necrobiosis); Walther Flemming (1885) mô tả quá trình tiêu sắc chất (chromatolysis); John F. Kerr (1965, 1972) đề xuất thuật ngữ "shrinkage necrosis" và chính thức định danh "apoptosis"; Sydney Brenner, Robert Horvitz và John Sulston nhận giải Nobel Y học năm 2002 về các cơ chế di truyền và sinh hóa điều hòa apoptosis.
• Các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh từ sên biển trên thế giới:
  • Thuốc Cytarabine (Cytosar-U® của Pfizer), Eribulin mesylate (Halaven® của Eisai Inc.);
  • Monomethyl auristatin E (MMAE, dẫn xuất của dolastatin 10 phân lập từ sên biển Dolabella auricularia của Pettit và cộng sự) có trong các thuốc liên hợp kháng thể Brentuximab vedotin, Polatuzumab vedotin, Enfortumab vedotin; dẫn xuất MMAF trong thuốc Belantamab mafodotin;
  • Jorumycin từ sên biển Jorunna funebris thể hiện giá trị $\text{IC}_{50}$ 12,5 ng/mL trên các dòng tế bào P388, A549, HT29, MEL28, phát triển thành dẫn xuất PM00104 (Zalypsis®) thử nghiệm lâm sàng pha II;
  • Kahalalide F phân lập từ Elysia rufescens và dẫn xuất tổng hợp elisidepsin ($\text{IC}_{50}$ 0,9 µM trên 23 dòng tế bào ung thư);
  • Kulokekahilide-1 và Kulokekahilide-2 từ Philinopsis speciosa (Takada và cộng sự) gây độc tế bào P388 ($\text{IC}{50}$ 2 µM và 4 nM), HeLa ($\text{IC}{50}$ 16 và 3,91 nM), SK-OV-3, MDA-MB-435;
  • Dịch chiết và các hợp chất từ chi Aplysia: Aplyronines A–H từ A. kurodai (đặc biệt Aplyronine A và D có $\text{IC}{50}$ lần lượt là 0,039 ng/mL và 0,039 nM trên HeLa-S3); các C15-acetogenin như dactylyne (ức chế chuyển hóa pentobarbital), dactylallene, (+)-laurenyne ($\text{LC}{50}$ 467,7 µg/mL trên tôm), pinnatifidenyne (Emiliano Manzo, 2005); các alkaloid dactylamides A–B (David R. Appleton, 2001); các polyhalogenated monoterpene (Wessels, 2000); các sesquiterpene khung chamigrane gồm obtusol, cartilagineol, elatol, 9-acetylisoobtusol, dactylone (Fedorov, 2001, 2007; Shubina, 2007 chứng minh dactylone kích nổ apoptosis sớm trên tế bào HL-60 và THP-1); các dẫn xuất bisabolane, cuparane, laurane, snyderane (aplysistatin, palisadin A–B); diterpene parguerol, isoparguerol, dactylomelol, 14-bromoobtus-1-ene-3,11-diol; triterpene squalene như aplysiol A–B, thyrsiferol, aplysqualenol A–B;
  • Chi sên biển Dendrodoris: Đặc điểm không có lưỡi bào (radula), tuyến tiêu hóa nguyên vẹn, sinh vật ăn thịt (ăn hải miên), tiết hóa chất thứ cấp tự vệ.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Trước luận án, các nghiên cứu trong nước chủ yếu tập trung vào các nhóm sinh vật biển khác (hải miên, san hô mềm, cỏ biển, hải sâm như nghiên cứu saponin triterpen cercodemasoide A từ Cercodemas anceps). Đối với sên biển, mới chỉ ghi nhận một công bố ban đầu trên loài Phyllidiella pustulosa.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết là thực hiện nghiên cứu chuyên sâu, có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về thành phần hóa học (phân lập, làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất mới và hợp chất đã biết) từ hai loài Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata thu thập tại vùng biển miền Trung (Thừa Thiên Huế và Thanh Hóa), đồng thời sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên 8 dòng tế bào người và chứng minh cơ chế cảm ứng apoptosis của các hợp chất tiềm năng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng cơ sở lý thuyết về hóa học các hợp chất thiên nhiên biển và sinh học phân tử ung thư:

• Cơ chế phân chia tế bào bất thường, sự né tránh apoptosis của tế bào ung thư thông qua 3 cơ chế: (1) mất cân bằng protein pro-apoptotic và anti-apoptotic, (2) suy giảm chức năng enzyme caspase, (3) suy giảm tín hiệu thụ thể chết.
• Các con đường kích hoạt apoptosis: con đường nội bào (qua màng ty thể giải phóng cytochrome c), con đường ngoại bào (qua các thụ thể màng DISC) và con đường lưới nội chất.
• Vai trò trung tâm của enzyme caspase-3: caspase thực hiện phân cắt cơ chất đặc hiệu chứa đoạn tetrapeptide Asp-Glu-Val-Asp (DEVD), kích hoạt caspase-activated DNase (CAD) gây cắt phân mảnh DNA và ngưng tụ chất nhiễm sắc.
• Sự chuyển vị của phospholipid phosphatidylserine (PS) từ mặt trong ra mặt ngoài màng tế bào ở giai đoạn sớm của apoptosis làm cơ sở định lượng tế bào chết theo chương trình.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp hóa học và hóa lý phân tích:

   • Chiết xuất phân bố lỏng - lỏng: Mẫu sên biển được xay nhỏ, ngâm chiết hồi lưu nhiều lần bằng dung môi methanol (MeOH) ở nhiệt độ phòng, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu dịch chiết tổng, sau đó phân bố phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ($n$-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, nước).
   • Kỹ thuật phân lập: Sắc ký cột pha thường (Silicagel 60, kích thước hạt 0,040–0,063 mm), sắc ký cột pha đảo (YMC Gel ODS-A, 12 nm, S-50 µm), sắc ký rây phân tử (Sephadex LH-20), sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC pha đảo trên cột chuyên dụng).
   • Xác định cấu trúc hóa học:
     • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, $^1\text{H-}^1\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY) đo trên máy Bruker AVANCE.
     • Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử (HR-ESI-MS) xác định công thức phân tử chính xác.
     • Phổ lưỡng sắc tròn (CD) và tính toán phổ ECD lý thuyết để xác định cấu hình tuyệt đối.
     • Phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (X-ray diffraction) để xác định cấu trúc lập thể tuyệt đối của các tinh thể hợp chất mới.

2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:

   • Nuôi cấy tế bào: Sử dụng môi trường DMEM bổ sung 10% FBS và kháng sinh ở 37°C, 5% $\text{CO}_2$. 8 dòng tế bào ung thư người thử nghiệm gồm: HepG2 (ung thư biểu mô gan), HL-60 (ung thư bạch cầu cấp), KB (ung thư biểu mô màng miệng), LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), MDA-MB-231 (ung thư vú), SK-Mel-2 (ung thư hắc tố da), LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt).
   • Thử nghiệm MTT: Đánh giá độ sống sót của tế bào dựa trên phản ứng khử muối tetrazolium màu vàng bởi enzyme dehydrogenase ty thể thành tinh thể formazan màu tím, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm để tính toán giá trị $\text{IC}_{50}$.
   • Thử nghiệm nhuộm nhân Hoechst 33342: Quan sát sự co đặc chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân tế bào apoptotic dưới kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 40X.
   • Thử nghiệm định lượng cảm ứng enzyme caspase-3: Tế bào sau xử lý hợp chất được ly giải, ủ với cơ chất peptide Ac-DEVD-pNA; caspase-3 hoạt hóa sẽ cắt giải phóng phân tử mang màu $p$-nitroaniline (pNA), đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 405 nm.
   • Kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry): Sử dụng bộ kit Alexa Fluor® 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis (Invitrogen) kết hợp chất nhuộm nhân Propidium Iodide (PI) trên hệ thống máy Novocyte (ACE Biosciences Inc.) và xử lý số liệu bằng phần mềm NovoExpress. Phân tích bốn góc phần tư: Q2-3 (tế bào sống: $\text{Annexin V}^-/\text{PI}^-$), Q2-4 (apoptosis sớm: $\text{Annexin V}^+/\text{PI}^-$), Q2-2 (apoptosis muộn: $\text{Annexin V}^+/\text{PI}^+$), Q2-1 (hoại tử tế bào: $\text{Annexin V}^-/\text{PI}^+$).

Phương pháp / Kỹ thuật	Mục đích sử dụng	Thiết bị / Hóa chất / Chuẩn đo lường
Sắc ký cột (CC, HPLC)	Chiết tách, tinh chế hợp chất sạch	Silicagel 60, RP-18, Sephadex LH-20, HPLC
HR-ESI-MS	Xác định khối lượng phân tử chính xác	Hệ phổ khối phân giải cao phun mù điện tích
NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, 2D)	Xác định khung carbon, liên kết hóa học	Máy đo phổ NMR (Bruker), dung môi đo phổ
X-ray, CD / ECD	Xác định cấu hình không gian tuyệt đối	Máy nhiễu xạ tia X đơn tinh thể, máy quang phổ CD
Thử nghiệm MTT	Xác định hoạt tính gây độc tế bào ($\text{IC}_{50}$)	8 dòng tế bào ung thư người, máy đo ELISA 540 nm
Nhuộm Hoechst 33342	Nhận diện hình thái nhân apoptotic	Thuốc nhuộm Hoechst 33342, kính hiển vi huỳnh quang 40X
Hoạt tính Caspase-3	Đo mức độ hoạt hóa enzyme caspase-3	Cơ chất Ac-DEVD-pNA, đo quang phổ bước sóng 405 nm
Flow Cytometry	Định lượng tỷ lệ tế bào apoptosis / hoại tử	Kít Alexa Fluor® 488 Annexin V/PI, máy Novocyte

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày bối cảnh nghiên cứu bệnh ung thư và nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên biển có khả năng kích hoạt apoptosis. Tác giả luận giải việc lựa chọn hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata phân bố tại vùng biển Thừa Thiên Huế và Thanh Hóa; xác định mục tiêu, đối tượng, 4 nội dung nhiệm vụ nghiên cứu và ý nghĩa khoa học của đề tài.

Chương 1. Ung thư và mối liên quan giữa tế bào ung thư với quá trình apoptosis

Chương 1 tổng thuật các cơ sở lý luận và y sinh học:

• Khái niệm về bệnh ung thư, đặc trưng tăng sinh vô hạn, xâm lấn và di căn của tế bào u.
• Bản chất quá trình apoptosis: vai trò sinh lý học trong phát triển cá thể và cân bằng nội môi; phân biệt hình thái học giữa hoại tử (tế bào trương phình, vỡ màng gây viêm) và apoptosis (tế bào co rút, màng tạo túi, nhân ngưng tụ, phân mảnh DNA không gây viêm).
• Chi tiết các con đường truyền tín hiệu apoptosis gồm con đường ty thể (nội bào, điều hòa bởi họ protein Bcl-2 như Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-xL), con đường thụ thể tử vong (ngoại bào qua FasL/FasR, TNF-$\alpha$/TNFR1, TRAIL) và con đường lưới nội chất.
• Cơ chế hoạt hóa của hệ enzyme caspase (caspase khởi động 8, 9, 10 và caspase thực thi 3, 6, 7).
• Nguyên lý và ứng dụng của các kỹ thuật đo lường sinh học: phương pháp MTT, nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342, phương pháp đo màu hoạt độ caspase-3 qua phản ứng thủy phân liên kết peptide DEVD-pNA, và kỹ thuật flow cytometry sử dụng chất nhuộm kép Annexin V-FITC/PI.
• Tổng quan sinh học, phân loại phát sinh loài của phân lớp Chân mang sau (Heterobranchia) và phân bộ Nudibranchia; tổng quan thành phần hóa học (macrolide, C15-acetogenin, alkaloid, sterol, monoterpene, sesquiterpene, diterpene, triterpene) và hoạt tính sinh học từ hai chi Aplysia và Dendrodoris.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu và các quy trình thực nghiệm:

• Mẫu sên biển A. dactylomela (ASP) thu tại rạn đá Lăng Cô, Thừa Thiên Huế; mẫu sên biển A. dactylomela (AD) và D. fumata (DN) thu tại vùng biển đảo Hòn Mê, Thanh Hóa. Mẫu vật được định danh sinh học, bảo quản lạnh sâu -20°C trước khi chiết xuất.
• Quy trình chiết mẫu với dung môi MeOH, phân tách đoạn chiết bằng hệ dung môi phân cực tăng dần.
• Thiết lập quy trình sắc ký phân lập các chất trên hệ thống sắc ký cột Silicagel pha thường, pha đảo RP-18, sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 và HPLC.
• Điều kiện đo phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz), $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz), các phổ 2D (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ HR-ESI-MS, phổ CD và tinh thể học tia X.
• Quy trình bảo quản và duy trì 8 chủng tế bào ung thư người chuẩn ATCC; quy trình thử nghiệm độc tính tế bào MTT (thời gian ủ 48–72h); quy trình nhuộm Hoechst 33342; quy trình đo phổ hấp thụ caspase-3; quy trình cố định và phân tích tế bào trên máy Novocyte Flow Cytometer.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính:

1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập:

   • Từ mẫu sên biển A. dactylomela Lăng Cô (ASP): Phân lập và xác định cấu trúc 16 hợp chất (ký hiệu từ ASP01 đến ASP16), trong đó có 10 hợp chất mới gồm ASP01, ASP02, ASP03, ASP05, ASP06, ASP08, ASP09, ASP12, ASP14, ASP15 và 6 hợp chất đã biết (ASP04, ASP07, ASP10, ASP11, ASP13, ASP16). Cấu trúc của hợp chất mới ASP01 được khẳng định bằng nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
   • Từ mẫu sên biển A. dactylomela Hòn Mê (AD): Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất, trong đó phát hiện 3 hợp chất mới là AD01, AD02, AD03. Cấu trúc lập thể của AD01 được xác định chính xác qua phân tích phổ tia X; cấu trúc không gian của AD03 được giải đoán bằng phổ CD thực nghiệm kết hợp tính toán phổ ECD lý thuyết.
   • Từ mẫu sên biển D. fumata Hòn Mê (DN): Phân lập và xác định cấu trúc chuỗi hợp chất từ DN01 đến DN11, trong đó DN11 là hợp chất mới; DN01 được xác định cấu trúc liên quan đến khung chaxine A thông qua phân tích tương tác phổ 2D NMR ($^1\text{H-}^1\text{H}$ COSY, HMBC, NOESY) và phổ CD.

2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư:

   • Dữ liệu thử nghiệm trên 8 dòng tế bào ung thư người cho thấy các hợp chất nhóm sesquiterpene halogen hóa thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư.
   • Hợp chất mới AD02 thể hiện hoạt tính gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 với giá trị $\text{IC}_{50}$ thấp.
   • Hợp chất DN01 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao trên dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp HL-60.

3. Kết quả nghiên cứu cơ chế cảm ứng apoptosis:

   • Tác động của hợp chất AD02 trên dòng tế bào HepG2:
     • Nhuộm Hoechst 33342 ở nồng độ 0,73 µg/mL (5 µM) sau 48h cho thấy rõ các hình thái đặc trưng của apoptosis: tế bào co đặc lại, chất nhiễm sắc ngưng tụ và nhân phân mảnh rõ rệt dưới kính hiển vi 40X so với đối chứng âm (0 µg/mL).
     • Phân tích dòng chảy tế bào (Flow cytometry với Alexa Fluor® 488 Annexin V/PI) cho thấy tỷ lệ quần thể tế bào apoptosis tăng theo nồng độ xử lý hợp chất AD02 ($P < 0,05$).
     • Hoạt độ enzyme caspase-3 tăng rõ rệt sau 24h xử lý AD02 ở nồng độ 0,73 µg/mL (**$P < 0,0001$ so với đối chứng âm).
   • Tác động của hợp chất DN01 trên dòng tế bào HL-60:
     • Nhuộm Hoechst 33342 ở các mức nồng độ 5 µg/mL và 10 µg/mL (và 1,73 µg/mL) sau 48h làm biến đổi sâu sắc hình thái nhân, tăng tỷ lệ nhân sáng cô đặc và nhân vỡ mảnh.
     • Kết quả flow cytometry ghi nhận sự chuyển dịch đáng kể của quần thể tế bào HL-60 từ vùng tế bào sống sang vùng apoptosis sớm (Q2-4) và apoptosis muộn (Q2-2).
     • Thử nghiệm đo hoạt độ caspase-3 ghi nhận khả năng cảm ứng sản sinh caspase-3 mạnh mẽ sau 24h xử lý (*$P < 0,01$ so với đối chứng âm).

Mẫu sinh vật / Vùng thu	Hợp chất tiêu biểu	Cấu trúc / Dạng chất	Hoạt tính & Dòng tế bào đích	Cơ chế tác động xác định
A. dactylomela (Lăng Cô, Huế)	ASP01–ASP16 (10 chất mới: ASP01, 02, 03, 05, 06, 08, 09, 12, 14, 15)	Sesquiterpene, Diterpene halogen hóa	Gây độc 8 dòng tế bào ung thư người	Ức chế sinh trưởng tế bào ung thư in vitro
A. dactylomela (Hòn Mê, Thanh Hóa)	AD01, AD02, AD03 (Hợp chất mới)	Halogenated terpenoid	Gây độc mạnh trên dòng ung thư gan HepG2	Kích hoạt Caspase-3 ($P < 0,0001$), ngưng tụ nhân, tăng Annexin $\text{V}^+$
D. fumata (Hòn Mê, Thanh Hóa)	DN01–DN09, DN11 (DN11 là chất mới; DN01)	Terpenoid có liên hệ cấu trúc chaxine A	Gây độc mạnh trên ung thư bạch cầu HL-60	Tăng Caspase-3 ($P < 0,01$), phân mảnh nhân, chuyển dịch PS màng

Chương 4. Bàn luận kết quả nghiên cứu

Chương 4 tập trung biện giải các phát hiện:

• Biện luận chi tiết cấu trúc hóa học của các hợp chất mới dựa trên sự phân tích tương quan giữa các tín hiệu phổ NMR 1D ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT), tương tác spin qua liên kết (COSY, HMBC) và tương tác không gian qua hiệu ứng Overhauser hạt nhân (NOESY). Đối chiếu dữ liệu nhiễu xạ tia X của ASP01, AD01 và so sánh đường cong CD thực nghiệm với phổ tính toán lượng tử ECD của AD03.
• So sánh mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR): sự hiện diện và vị trí gắn của các nguyên tử halogen (Brom, Clo), nhóm hydroxyl (-OH), nhóm keto hoặc ester hóa trên khung carbon sesquiterpene làm thay đổi đáng kể mức độ gây độc tế bào và khả năng cảm ứng apoptosis.
• Phân tích cơ chế cảm ứng apoptosis của AD02 trên HepG2 và DN01 trên HL-60: việc gia tăng hoạt độ caspase-3 đi kèm với sự lộ diện phosphatidylserine trên màng tế bào (tăng tín hiệu Annexin V) và biến đổi hình thái nhân khẳng định các hợp chất tiêu diệt tế bào ung thư thông qua kích hoạt con đường apoptosis tự nhiên chứ không đơn thuần gây độc hoại tử.

Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả đạt được về phân lập hóa học, xác định cấu trúc các hợp chất mới và dữ liệu hoạt tính sinh học; kiến nghị các định hướng nghiên cứu tiếp theo về thử nghiệm in vivo và hóa dược.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Về hóa học:

   • Là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về thành phần hóa học của hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata thu tại vùng biển Lăng Cô (Thừa Thiên Huế) và đảo Hòn Mê (Thanh Hóa).
   • Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất mới từ nguồn sên biển Việt Nam:
     • 10 hợp chất mới từ loài Aplysia dactylomela thu tại Lăng Cô (ASP01, ASP02, ASP03, ASP05, ASP06, ASP08, ASP09, ASP12, ASP14, ASP15).
     • 3 hợp chất mới từ loài Aplysia dactylomela thu tại đảo Hòn Mê (AD01, AD02, AD03).
     • 1 hợp chất mới từ loài Dendrodoris fumata thu tại đảo Hòn Mê (DN11).
   • Thiết lập bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đầy đủ ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, phổ CD/ECD và cấu trúc tinh thể tia X đơn tinh thể cho các hợp chất mới.

2. Về hoạt tính sinh học và cơ chế dược lý:

   • Cung cấp dữ liệu sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập trên hệ thống 8 dòng tế bào ung thư người (HepG2, HL-60, KB, LU-1, MCF-7, MDA-MB-231, SK-Mel-2, LNCaP).
   • Chứng minh cơ chế gây độc tế bào ung thư thông qua con đường cảm ứng apoptosis của hai hợp chất đại diện:
     • Hợp chất mới AD02 cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư gan người HepG2 thông qua kích hoạt làm tăng biểu hiện enzyme caspase-3 ($P < 0,0001$), làm thay đổi hình thái nhân tế bào (nhân cô đặc, phân mảnh trên nhuộm Hoechst 33342) và làm tăng tỷ lệ tế bào apoptosis theo nồng độ (phân tích Annexin V/PI trên flow cytometry).
     • Hợp chất DN01 cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư bạch cầu cấp HL-60 thông qua hoạt hóa enzyme caspase-3 ($P < 0,01$), biến đổi hình thái nhân và gia tăng quần thể tế bào apoptosis trên flow cytometry.

Kiến nghị và đề xuất

• Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các con đường truyền tín hiệu nội bào và các phân tử mục tiêu chuyên biệt (như biểu hiện của các gen/protein họ Bcl-2, Bax, Cytochrome c, thụ thể màng) liên quan đến quá trình apoptosis do hợp chất AD02 và DN01 tạo ra.
• Mở rộng đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và thử nghiệm hiệu quả ức chế khối u trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
• Nghiên cứu bán tổng hợp hoặc tối ưu hóa cấu trúc hóa học từ các khung chất tiềm năng (như AD02, DN01) nhằm nâng cao hiệu lực sinh học và độ tan, định hướng phát triển tiền chất làm thuốc chống ung thư.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Luận án mới chỉ dừng lại ở phạm vi nghiên cứu thực nghiệm in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy trong phòng thí nghiệm; chưa tiến hành đánh giá trên mô hình khối u in vivo trên động vật sống. Các thử nghiệm cơ chế apoptosis tập trung chủ yếu vào hoạt độ enzyme caspase-3, hình thái nhân và đo lường phosphatidylserine màng bằng flow cytometry, chưa khảo sát toàn diện toàn bộ các chuỗi tương tác protein chuyên sâu trong mạng lưới tín hiệu tế bào.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Mở rộng khảo sát thành phần hóa học của các loài sên biển khác tại các vùng biển sinh thái khác nhau của Việt Nam.
  2. Thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo đối với hai hợp chất tiềm năng AD02 và DN01 trên chuột mang khối u ghép dị loài.
  3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để làm rõ chi tiết đích phân tử tác động và con đường chuyển hóa thuốc trong tế bào ung thư.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa sinh học, Hóa hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Công nghệ sinh học: Cung cấp phương pháp luận chuẩn mực về quy trình chiết tách, sắc ký phân lập và phương pháp giải đoán cấu trúc các hợp chất tự nhiên biển phức tạp thông qua phân tích phổ NMR đa chiều, phổ CD/ECD và tinh thể học tia X.
• Giảng viên và các nhà nghiên cứu dược liệu biển: Tham khảo nguồn dữ liệu thực nghiệm phong phú về phổ cấu trúc hóa học và các quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học (in vitro MTT, nhuộm Hoechst 33342, đo hoạt độ enzyme caspase, phân tích dòng chảy tế bào flow cytometry).
• Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phát triển dược phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học và danh mục các hoạt chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư tiềm năng từ nguồn sinh vật biển Việt Nam phục vụ công tác sàng lọc, phát triển các ứng dụng thuốc trong tương lai.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện bao nhiêu hợp chất mới và từ những nguồn mẫu sên biển nào?
Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 14 hợp chất mới, bao gồm: 10 hợp chất mới từ mẫu sên biển Aplysia dactylomela thu tại Lăng Cô, Thừa Thiên Huế (ASP01, ASP02, ASP03, ASP05, ASP06, ASP08, ASP09, ASP12, ASP14, ASP15); 3 hợp chất mới từ mẫu Aplysia dactylomela thu tại đảo Hòn Mê, Thanh Hóa (AD01, AD02, AD03); và 1 hợp chất mới từ mẫu Dendrodoris fumata thu tại đảo Hòn Mê, Thanh Hóa (DN11).

2. Hợp chất nào được chứng minh cấu trúc không gian bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể?
Cấu trúc không gian và cấu hình tuyệt đối của hợp chất mới ASP01 (thu từ mẫu Lăng Cô) và hợp chất mới AD01 (thu từ mẫu Hòn Mê) đã được khẳng định chính xác bằng phương pháp phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (X-ray diffraction).

3. Cơ chế gây độc tế bào ung thư gan HepG2 của hợp chất mới AD02 được chứng minh qua những bằng chứng thực nghiệm nào?
Cơ chế của AD02 trên tế bào HepG2 được chứng minh qua 3 bằng chứng thực nghiệm: (1) Nhuộm Hoechst 33342 cho thấy tế bào bị co đặc, chất nhiễm sắc ngưng tụ và nhân phân mảnh; (2) Phân tích flow cytometry (nhuộm Annexin V/PI trên hệ thống Novocyte) ghi nhận sự gia tăng tỷ lệ quần thể tế bào rơi vào giai đoạn apoptosis sớm và muộn ($P < 0,05$); (3) Gây tăng sinh và kích hoạt có ý nghĩa thống kê hoạt tính enzyme caspase-3 sau 24h điều trị (**$P < 0,0001$ so với đối chứng âm).

4. Hợp chất DN01 tác động lên dòng tế bào ung thư nào và làm thay đổi hoạt độ caspase-3 ra sao?
Hợp chất DN01 (phân lập từ loài Dendrodoris fumata) thể hiện hoạt tính gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp ở người HL-60, làm thay đổi hình thái nhân, tăng tỷ lệ apoptosis trên flow cytometry và cảm ứng làm tăng đáng kể hoạt tính của enzyme caspase-3 sau 24h xử lý (*$P < 0,01$ so với đối chứng âm).

5. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được đánh giá trên bao nhiêu dòng tế bào ung thư người?
Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT trên hệ thống 8 dòng tế bào ung thư ở người gồm: HepG2 (ung thư biểu mô gan), HL-60 (ung thư bạch cầu cấp), KB (ung thư biểu mô màng miệng), LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), MDA-MB-231 (ung thư vú), SK-Mel-2 (ung thư hắc tố da) và LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Thị Mai Hương là công trình nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata tại vùng biển miền Trung Việt Nam. Đề tài đã phân lập, làm sáng tỏ cấu trúc của nhiều hợp chất tự nhiên, trong đó có 14 hợp chất mới với các bằng chứng phổ học NMR đa chiều, MS, CD và nhiễu xạ tia X tin cậy. Đồng thời, nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư người và làm sáng tỏ cơ chế cảm ứng apoptosis thông qua hoạt hóa caspase-3 của các hợp chất tiềm năng AD02 và DN01. Kết quả luận án đã bổ sung nguồn dữ liệu khoa học mới, khẳng định tiềm năng to lớn của tài nguyên sinh vật biển Việt Nam trong nghiên cứu hóa sinh và phát triển hóa dược.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Ung thư và mối liên quan giữa tế bào ung thư với quá trình apoptosis 1. Khái niệm chung về ung thư Ung thư là một nhóm gồm khoảng 200 loại bệnh có liên quan tới sự phân chia tế bào một cách không có tổ chức và những tế bào này có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô bên cạnh hoặc di chuyển đến mô xa (di căn) [5, 6]. Theo Viện Ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ thì các tế bào khối u đều xuất phát từ những tế bào của cơ thể, nhưng chúng không ngừng tăng sinh và lan rộng; có thể do sự mất cân bằng sinh lý, các tế bào già nua, bị lỗi hoặc bị hư tổn vẫn tiếp tục sống khi chúng cần phải chết và trong khi các tế bào mới hình thành khi cơ thể không cần đến chúng.

Những sự bất thường này có thể xảy ra ở bất cứ tế bào nào trong hàng tỉ tế bào của cơ thể [7]. Phân chia tế bào bình thường và ung thư [8] 1. Apoptosis và tầm quan trọng của apoptosis Mục đích của hầu hết các loại thuốc hóa trị liệu ung thư hiện đang được sử dụng hỗ trợ hoặc điều trị ung thư là tiêu diệt các tế bào khối u ác tính bằng cách ức chế một số cơ chế liên quan tới quá trình phân chia tế bào. Một trong những cơ chế của thuốc chống ung thư hiện đang được nghiên cứu là tìm hướng tác động kích hoạt quá trình tự chết của tế bào (apoptosis).nam luan an tien si TIEU LUAN MOI download : [e-mail] moi nhat (LUAN.nam 4 Apoptosis là quá trình (hay chương trình) tự chết của tế bào ở dạng đã được lập trình từ trước.

“Apoptosis” có nghĩa cây rụng lá vào mùa thu trong tiếng Hy Lạp. Sự ức chế apoptosis có thể là nguyên nhân của nhiều loại bệnh như bệnh tự miễn dịch, bệnh do nhiễm virus, bệnh sưng viêm, và ung thư. Ban đầu các khối u được tạo ra là do sự tăng sinh của tế bào, tuy nhiên theo các công bố trước đây cho thấy sự làm giảm tốc độ chết của tế bào cũng được xem xét như nguyên nhân của hiện tượng này. Hay là sự biểu hiện quá mức của protein ức chế apoptosis của tế bào (IAP).

Do vậy, định hướng nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay là tìm kiếm các hợp chất có khả năng điều trị theo cơ chế cảm ứng và kích hoạt quá trình apoptosis. Từ thế kỷ XIX apoptosis đã nhận được sự quan tâm của các nhà sinh học. Năm 1842, Carl Vogt người Đức là nhà khoa học đầu tiên mô tả về các nguyên tắc về apoptosis [9]. Năm 1858, Rudolph Virchow đã mô tả một dạng tế bào chết tự nhiên khác biệt với hoại tử (necrosis) và gọi nó là necrobiosis [10].

Việc mô tả chính xác hơn về apoptosis xuất hiện vào năm 1885 bởi Walther Flemming và đặt tên là tế bào chết tự nhiên chromatolysis [9]. Năm 1965, nhà nghiên cứu bệnh học người Úc John F. Kerr đã quan sát thấy một dạng tế bào chết bất thường sau chấn thương thiếu máu cục bộ của mô gan, nơi các thành phần của tế bào dường như vẫn còn nguyên vẹn. Ông đã sử dụng thuật ngữ hoại tử co rút (shrinkage necrosis) để xác định dạng chết tế bào này và đã bắt đầu sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát hình thái sớm của các dạng ngưng tụ của tế bào chất và chất nền nhân.

Ông cũng cho rằng những tế bào chết tự nhiên này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo phôi và phát triển của động vật có xương sống [12]. Sau đó đến năm 1972, Kerr và cộng sự lần đầu tiên sử dụng tên apoptosis như một quá trình của sự chết tế bào tự nhiên [13]. Năm 2002, giải Nobel y học đã được trao cho Sydney Brenner, Robert Horvitz và John Suston bởi những đóng góp của họ trong nghiên cứu về apoptosis. Điều này cho thấy tầm quan trọng của những kết quả nghiên cứu trong hai thập kỷ về các quá trình di truyền và sinh hóa liên quan đến quá trình apoptosis và ý nghĩa của nó với nền y học thế giới.nam luan an tien si TIEU LUAN MOI download : [e-mail] moi nhat (LUAN.nam 5 Cơ chế của quá trình apoptosis rất phức tạp và liên quan đến nhiều con đường sinh hóa.

Hiểu cơ chế quá trình apoptosis là rất quan trọng, cần thiết giúp ích cho điều trị bệnh ung thư và nghiên cứu các loại thuốc điều trị, hỗ trợ trị bệnh ung thư chứa các hoạt chất hướng đích vào con đường apoptosis.2 minh họa khái quát các con đường bên trong và bên ngoài của apoptosis. Các con đường bên ngoài và bên trong của apoptosis [14] Caspase đóng vai trò quan trọng và trung tâm trong cơ chế apoptosis vì chúng tham gia vào cả hai vai trò là khởi đầu/khởi động và thực hiện. Cả ba con đường apoptosis mà đều có mặt caspase: hai con đường chính là con đường nội bào (con đường ty thể) và con đường ngoại bào (các thụ thể chết); con đường thứ ba là con đường lưới nội chất nội bào [15]. Một số gen liên quan đến quá trình apoptosis được phát hiện là bị biển đổi trong tế bào ung thư (đặc biệt là gen họ BCL2 và caspase).

Apoptosis được gây ra bởi một nhóm cysteine là các protease cụ thể là caspase, phân cắt cơ chất của chúng tại các gốc axit aspartic. Caspase được tạo ra dưới dạng không hoạt động, được kích hoạt bằng phản ứng thủy phân tại các vị trí Asp. Mối liên quan giữa apoptosis và tế bào ung thư Các tế bào ung thư có nguồn gốc là các tế bào bình thường biến tính dưới một tác động hay nhiều tác động. Nếu apoptosis có hiệu quả với tế bào ung thư thì chúng sẽ tự mất đi như các tế bào bình thường khác.

Tuy nhiên, bản chất của các tế bào ung (LUAN.nam luan an tien si TIEU LUAN MOI download : [e-mail] moi nhat (LUAN.nam 6 thư không chịu tác động của apoptosis, do đó chúng không bao giờ tự chết đi. Năm 1951 ở Hoa Kỳ tại một phòng thí nghiệm đã thu thập mẫu tế bào ung thư đốt sống và cho đến ngày nay tế bào đó vẫn tiếp tục sống và sử dụng rộng rãi với mục đích nghiên cứu khác nhau. Tế bào ung thư có thể phát sinh trong bất kỳ một bước nào trên con đường của apoptosis. Tế bào ác tính có thể có nhiều cơ chế tránh quá trình apoptosis và được chia thành: (1) phá vỡ sự cân bằng của protein prooptotic và chống apoptosis, (2) giảm chức năng caspase và (3) suy giảm tín hiệu thụ thể gây chết.

Tóm tắt các cơ chế góp phần tránh quá trình apoptosis và gây ung thư được trình bày ở Hình 1. Các cơ chế làm giảm quá trình apoptosis và gây ung thư [16] Vì vậy, apoptosis có thể là nguồn gốc cũng là giải pháp của vấn đề. Hiện nay nhiều nhà nghiên cứu tập trung tìm kiếm các loại thuốc mới hướng đích vào các khía cạnh khác nhau của apoptosis [17, 18]. Ngay từ năm 1970, Kerr và cộng sự đã liên kết apoptosis với việc loại bỏ các tế bào ác tính tiềm tàng, tăng sản và tiến triển khối u [19].

Do đó, tìm kiếm hoạt chất có hoạt tính gây ra quá trình apoptosis là hết sức cần thiết. Nói cách khác là sử dụng các hoạt chất đó nhằm đẩy nhanh tốc độ tự chết của tế bào ung thư đã cài đặt sẵn trong gen. Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Thử nghiệm sinh học (bioassay) là một phương pháp phân tích để đánh giá nồng độ hoặc hiệu lực của một chất bằng cách thử ảnh hưởng của nó lên hệ thống sinh học phù hợp như tế bào, mô, vi khuẩn, động vật, thực vật v. Thử nghiệm sinh (LUAN.nam luan an tien si TIEU LUAN MOI download : [e-mail] moi nhat (LUAN.nam 7 học được dùng để ước tính hiệu lực của các tác nhân bằng cách quan sát ảnh hưởng của chúng lên động vật sống (in vivo) hoặc hệ thống nuôi cấy mô/tế bào (in vitro).

Các phép thử sinh học quy mô phòng thí nghiệm có vai trò quan trọng trong việc định hướng phân tách các hợp chất có hoạt tính từ nhiều nguồn tự nhiên khác nhau. Các phép thử sinh học được lựa chọn dựa vào bản chất và hoạt tính sinh học cần đánh giá của mẫu thử [20]. Thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng kỹ thuật MTT Trong hệ thống nuôi cấy tế bào quy mô phòng thí nghiệm, thuật ngữ “gây độc tế bào” (cytotoxicity) dùng để chỉ khả năng làm thay đổi hình thái, tốc độ sinh trưởng hoặc làm chết tế bào của hợp chất thử hoặc tác nhân thử [20]. Các phép thử gây độc tế bào là cách hữu hiệu nhất trong việc sàng lọc phát hiện những hợp chất có hoạt tính từ nguồn tự nhiên làm tiền đề cho những nghiên cứu phát triển thuốc cũng như đánh giá thuốc tổng hợp.

Phương pháp tetrazolium (MTT-mô tả bởi Tim Mosmann (1983) tạp chí Immunological Methods) nhằm đánh giá khả năng tăng sinh, ức chế tăng sinh tế bào [13]. Vòng tetrazolium bám vào ty thể của tế bào hoạt động, sau đó dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành formazan có màu tím. Như vậy so sánh màu sẽ tính toán được số lượng tế bào sống sót trong các mẫu thí nghiệm [21]. Trong nghiên cứu của Takada sử dụng phương pháp MTT để ủ tế bào ung thư bạch cầu ở chuột P388 và ung thư biểu mô cổ tử cung ở người HeLa với hợp chất kulokekahilide ‐ 2 (là hợp chất trước đó đã được tìm thấy từ sên biển Philinopsis speciose [22]) trong 96 giờ, kết quả là kulokekahilide ‐ 2 có hoạt tính gây độc mạnh lên hai dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 lần lượt là 16 và 3.

Thử nghiệm xác định khả năng gây apoptosis thông qua sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33342 Nhân của các tế bào bình thường có hình cầu và DNA phân bố đều. DNA trở nên đặc lại trong quá trình apoptosis, nhưng không xảy ra trong quá trình hoại tử. Do đó, tế bào bị co rút lại và nhân tế bào bị phân chia thành từng mảng nhỏ, chất nhiễm sắc cũng bị co lại có thể được dùng để phân biệt tế bào apoptotic với tế bào khỏe mạnh hoặc tế bào hoại tử. Vì vậy, thử nghiệm sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33342 làm cơ sở phát hiện tế bào chết theo apoptosis.

Hoechst nhuộm DNA của cả tế bào (LUAN.nam luan an tien si TIEU LUAN MOI download : [e-mail] moi nhat (LUAN.nam 8 sống và tế bào chết, tương thích với các ứng dụng hóa mô miễn dịch. Khi sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33342, có thể quan sát thấy nhân tế bào bắt màu nhuộm đều và khuếch tán ở tế bào khỏe mạnh.