Nghiên Cứu Phân Lập Gen Liên Quan Đến Con Đường Sinh Tổng Hợp IAA Ở Vi Khuẩn Bacillus Megaterium

Tài liệu nghiên cứu Nghiên cứu phân lập một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp iaa ở vi khuẩn bacillus, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về

• Tác giả: Nguyễn Siêu Tuấn Vũ
• Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Một Số Gen Liên Quan Đến Con Đường Sinh Tổng Hợp IAA Ở Vi Khuẩn Bacillus Megaterium
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Mục đích, yêu cầu
• 1.2. Tổng quan tài liệu
• 1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus megaterium
• 1.2.2. Một số con đường, các gen sinh tổng hợp IAA trên thực vật và vi khuẩn
• 1.2.3. Các con đường trao đổi chất trên Bacillus megaterium 1TM7 từ cơ sở dữ liệu KEGG
• 1.2.4. Sinh tổng hợp IAA trên Bacillus megaterium
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp
• 2.1.1. Phương pháp khai thác cơ sở dữ liệu gen
• 2.1.2. Phương pháp tách DNA genome (gDNA) của Bacillus megaterium
• 2.1.3. Phương pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả dự đoán con đường sinh tổng hợp IAA trên vi khuẩn Bacillus megaterium 1TM7
• 3.2. Xác định các gen tiềm năng tham gia vào con đường chuyển hóa IAA
• 3.3. Khuếch đại 1TM7-03404, ysnE và yclC từ gDNA của Bacillus megaterium 1TM7
• 3.4. Kết quả giải trình tự 1TM7_03404, ysnE và yclC
• 3.4.1. Trình tự ysnE
• 3.4.2. Trình tự 1TM7_03404
• 3.4.3. Trình tự yclC
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Giới Thiệu Nghiên Cứu Gen Sinh Tổng Hợp IAA ở Bacillus

Nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA ở Bacillus megaterium mở ra hướng đi mới trong nông nghiệp bền vững. IAA (indole-3-acetic acid) là một auxin quan trọng, điều hòa sự phát triển của thực vật. Bacillus megaterium, một loại vi khuẩn Bacillus phổ biến trong vùng rễ, có khả năng sinh tổng hợp IAA. Việc hiểu rõ con đường sinh tổng hợp IAA trong Bacillus giúp tối ưu hóa việc ứng dụng vi khuẩn này trong sản xuất nông nghiệp, giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định các gen liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Mục tiêu là làm sáng tỏ cơ chế sinh tổng hợp IAA và tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn này trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Khóa luận tốt nghiệp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam năm 2022, đây là một hướng đi đầy hứa hẹn, đặc biệt khi nhu cầu lương thực ngày càng tăng cao.

1.1. Bacillus megaterium Vai Trò và Tiềm Năng Sinh Học

Bacillus megaterium là một vi khuẩn Bacillus Gram dương phổ biến, được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau. Nó nổi tiếng với khả năng sản xuất nhiều enzyme và chất chuyển hóa quan trọng, bao gồm cả IAA. Theo Vary et al., nhiệt độ phát triển tối ưu của B. megaterium là khoảng 30°C, cho thấy khả năng thích nghi cao trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Bacillus megaterium có bộ gen Bacillus megaterium kích thước khoảng 5,1 Mb, chứa nhiều plasmid. Khả năng sinh tổng hợp IAA của Bacillus megaterium có thể được ứng dụng để thúc đẩy sự phát triển của cây trồng và cải thiện năng suất cây trồng.

1.2. Tầm Quan Trọng của IAA Trong Nông Nghiệp Hiện Đại

IAA (indole-3-acetic acid) đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa sinh trưởng thực vật, ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý như kéo dài tế bào, phân chia tế bào, hình thành rễ và phát triển quả. Theo Spartz and Gray (2008), IAA là một chất trung tâm điều hòa quá trình sinh học. Việc sử dụng Bacillus megaterium để sinh tổng hợp IAA có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học và thuốc trừ sâu, đồng thời tăng cường sức khỏe của đất. Ứng dụng của Bacillus megaterium trong nông nghiệp có thể giúp tạo ra một hệ thống canh tác bền vững và thân thiện với môi trường.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Con Đường Sinh Tổng Hợp IAA

Mặc dù tiềm năng của Bacillus megaterium trong sinh tổng hợp IAA là rõ ràng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn này. Các gen sinh tổng hợp IAA và enzyme sinh tổng hợp IAA liên quan chưa được xác định đầy đủ. Việc phân lập và định danh gen gặp khó khăn do sự phức tạp của bộ gen Bacillus megaterium. Hơn nữa, việc điều hòa gen sinh tổng hợp IAA còn chưa được hiểu rõ, gây khó khăn cho việc tối ưu hóa quá trình sản xuất IAA. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào cơ chế sinh tổng hợp IAA ở thực vật và vi khuẩn Gram âm, bỏ qua vi khuẩn Gram dương như Bacillus.

2.1. Sự Khác Biệt Giữa Vi Khuẩn Gram Âm và Gram Dương

Các nghiên cứu về sinh tổng hợp IAA chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm. Con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn Gram dương, như Bacillus megaterium, vẫn còn ít được biết đến. Sự khác biệt về cấu trúc tế bào và cơ chế di truyền giữa vi khuẩn Gram âm và Gram dương đòi hỏi các phương pháp tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu gen sinh tổng hợp IAA. Việc áp dụng kết quả nghiên cứu từ vi khuẩn Gram âm sang vi khuẩn Gram dương cần được thực hiện cẩn thận, do sự khác biệt về enzyme sinh tổng hợp IAA và điều hòa gen sinh tổng hợp IAA.

2.2. Khó Khăn Trong Phân Lập và Định Danh Gen IAA

Việc phân lập và định danh gen mã hóa enzyme liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium gặp nhiều khó khăn. Bộ gen Bacillus megaterium có kích thước lớn và phức tạp, gây khó khăn cho việc xác định các marker gen đặc hiệu. Các phương pháp phân tích gen truyền thống có thể không đủ nhạy để phát hiện các gen sinh tổng hợp IAA có biểu hiện thấp. Cần có các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến, như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và phân tích trình tự gen, để giải quyết những thách thức này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tiếp Cận Sinh Học Phân Tử

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để phân tích gen liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Các phương pháp bao gồm: (1) Khai thác cơ sở dữ liệu NCBI và KEGG để xác định các gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA; (2) Phân lập Bacillus megaterium và tách chiết DNA genome (gDNA); (3) Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR; (4) Giải trình tự gen và phân tích trình tự gen để xác định các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp IAA. Các kết quả này sẽ giúp làm sáng tỏ cơ chế sinh tổng hợp IAA và tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn này.

3.1. Khai Thác Dữ Liệu Từ Cơ Sở Dữ Liệu NCBI và KEGG

Việc khai thác dữ liệu từ cơ sở dữ liệu NCBI và KEGG là bước quan trọng để xác định các gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA. Cơ sở dữ liệu NCBI cung cấp thông tin về trình tự gen và biểu hiện gen của nhiều loài vi sinh vật, bao gồm cả Bacillus megaterium. Cơ sở dữ liệu KEGG cung cấp thông tin về các con đường trao đổi chất và các enzyme liên quan. Việc kết hợp thông tin từ hai cơ sở dữ liệu này giúp xác định các gen ứng viên và enzyme có khả năng tham gia vào sinh tổng hợp IAA.

3.2. Khuếch Đại Gen Bằng Phản Ứng PCR Chi Tiết Quy Trình

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng để khuếch đại các đoạn gen cụ thể. Trong nghiên cứu này, PCR được sử dụng để khuếch đại các gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA từ gDNA của Bacillus megaterium. Quá trình PCR bao gồm các bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài. Mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được xác định từ cơ sở dữ liệu NCBI và KEGG.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Định Danh Gen và Phân Tích Trình Tự

Kết quả nghiên cứu đã định danh gen thành công ba gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium: gen ysnE, gen yclC, và gen 1TM7_03404. Phân tích trình tự gen cho thấy các gen này có sự tương đồng cao với các gen tương ứng trong các loài vi khuẩn khác. Gen ysnE mã hóa cho enzyme tryptophan acetyltransferase, gen yclC mã hóa cho enzyme phenolic acid decarboxylase, và gen 1TM7_03404 mã hóa cho enzyme phenylacetaldehyde dehydrogenase. Các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong con đường sinh tổng hợp IAA.

4.1. Gen ysnE Vai Trò Trong Sinh Tổng Hợp IAA

Gen ysnE mã hóa cho enzyme tryptophan acetyltransferase, một enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp IAA. Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa tryptophan, tạo ra một chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp IAA. Phân tích trình tự gen cho thấy gen ysnE trong Bacillus megaterium có sự tương đồng cao với gen ysnE trong các loài vi khuẩn khác. Điều này cho thấy gen ysnE có vai trò bảo tồn trong sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn.

4.2. Gen yclC Liên Quan Đến Quá Trình Chuyển Hóa Phenolic Acid

Gen yclC mã hóa cho enzyme phenolic acid decarboxylase, một enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa phenolic acid. Mối liên hệ giữa enzyme này và sinh tổng hợp IAA cần được nghiên cứu thêm. Enzyme này có thể ảnh hưởng đến con đường sinh tổng hợp IAA thông qua việc điều chỉnh nồng độ các chất trung gian. Phân tích trình tự gen của gen yclC trong Bacillus megaterium cung cấp thông tin quan trọng về chức năng và vai trò của enzyme này trong sinh tổng hợp IAA.

V. Ứng Dụng và Tiềm Năng Của Bacillus megaterium Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp. Việc sử dụng Bacillus megaterium làm phân bón sinh học có thể giúp thúc đẩy tăng trưởng thực vật, cải thiện năng suất cây trồng, và giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học. Vai trò của IAA ở Bacillus megaterium trong việc tương tác với thực vật là rất quan trọng. Ảnh hưởng của IAA đến sự phát triển thực vật cũng như tầm quan trọng của IAA trong nông nghiệp ngày càng được khẳng định. Công nghệ sinh học có thể được sử dụng để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium, tăng cường hiệu quả của phân bón sinh học.

5.1. Phát Triển Phân Bón Sinh Học Từ Bacillus megaterium

Bacillus megaterium có thể được sử dụng để sản xuất phân bón sinh học giàu IAA. Phân bón sinh học từ Bacillus megaterium có thể giúp cải thiện sức khỏe của đất, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng, và bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh. Việc sử dụng phân bón sinh học từ Bacillus megaterium là một giải pháp bền vững cho nông nghiệp, giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

5.2. Tối Ưu Hóa Quá Trình Sinh Tổng Hợp IAA Bằng Công Nghệ

Công nghệ sinh học có thể được sử dụng để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Các kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật biến đổi gen có thể được sử dụng để tăng cường biểu hiện gen của các gen sinh tổng hợp IAA. Các điều kiện nuôi cấy cũng có thể được tối ưu hóa để tăng cường sinh tổng hợp IAA. Việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA sẽ giúp tăng cường hiệu quả của phân bón sinh học từ Bacillus megaterium.

VI. Kết Luận Hướng Đi Mới Cho Nghiên Cứu và Ứng Dụng

Nghiên cứu về gen liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium đã mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp. Các kết quả nghiên cứu đã định danh gen ba gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA, cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về điều hòa gen sinh tổng hợp IAA và cơ chế tương tác giữa Bacillus megaterium và thực vật là cần thiết để tối ưu hóa ứng dụng của vi khuẩn này trong nông nghiệp.

6.1. Các Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Trong Tương Lai

Trong tương lai, cần có các nghiên cứu sâu hơn về điều hòa gen sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Cần tìm hiểu các yếu tố môi trường và di truyền ảnh hưởng đến biểu hiện gen của các gen sinh tổng hợp IAA. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về cơ chế tương tác giữa Bacillus megaterium và thực vật, để hiểu rõ hơn về cách Bacillus megaterium thúc đẩy tăng trưởng thực vật.

6.2. Đề Xuất Các Ứng Dụng Thực Tiễn Trong Sản Xuất Nông Nghiệp

Các kết quả nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium có thể được ứng dụng để phát triển các sản phẩm nông nghiệp mới. Có thể phát triển các chế phẩm sinh học chứa Bacillus megaterium để cải thiện sức khỏe của đất và tăng cường khả năng kháng bệnh của cây trồng. Các sản phẩm này có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học và thuốc trừ sâu, góp phần vào một nền nông nghiệp bền vững.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Bối cảnh và thực trạng ngành nông nghiệp sinh học

Trong xu thế phát triển nông nghiệp bền vững toàn cầu, việc giảm thiểu phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật là ưu tiên chiến lược. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), thị trường chế phẩm vi sinh kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - PGPR) đạt tốc độ tăng trưởng kép (CAGR) trên 12,5%/năm. Trong số các hoạt chất sinh học do vi sinh vật tiết ra, Indole-3-acetic acid (IAA, công thức phân tử $\text{C}_{10}\text{H}_9\text{NO}_2$) giữ vai trò là phytohormone trung tâm nhóm auxin, điều hòa kéo dài tế bào, phân chia mô phân sinh, kích thích phát triển rễ phụ và nâng cao sức chống chịu bất lợi phi sinh học của cây trồng.

Vấn đề nghiên cứu cụ thể (Problem Statement)

Mặc dù khả năng sinh tổng hợp IAA đã được chứng minh rộng rãi ở các chủng vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas, Azospirillum), các cơ chế di truyền và con đường trao đổi chất tương ứng ở vi khuẩn Gram dương hình thành nội bào tử—đặc biệt là chi Bacillus (nhóm Bacillus megaterium, gần đây tái phân loại thành Priestia megaterium)—vẫn còn nhiều khoảng trống học thuật. Chủng nội sinh Bacillus megaterium 1TM7 sở hữu bộ gen kích thước 5,1 Mb (hàm lượng GC 38,2%), sinh trưởng nhanh và có hoạt tính sinh IAA cao, nhưng các gen mã hóa enzyme xúc tác các phản ứng giới hạn vận tốc (rate-limiting steps) trong mạng lưới chuyển hóa tryptophan sang IAA chưa được xác định và phân lập cụ thể.

                  [ L-Tryptophan ]
   [ IPyA ]           [ IAM ]            [ TAM ]
         (1TM7_03404 ALDH)

Mục tiêu dự án

1. Khai thác dữ liệu hệ gen (genome-mining) trên nền tảng KEGG-KAAS và NCBI Conserved Domains để giải mã mạng lưới con đường sinh tổng hợp IAA ở Bacillus megaterium 1TM7.
2. Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và thiết lập quy trình nhân gen tối ưu bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) cho 03 gen mục tiêu: ysnE (tryptophan acetyltransferase), yclC (phenolic acid decarboxylase) và 1TM7_03404 (phenylacetaldehyde dehydrogenase).
3. Tách chiết gDNA chất lượng cao, khuếch đại, tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự nucleotide bằng phương pháp Sanger nhằm đối soát, đánh giá mức độ tương đồng di truyền với các chủng Bacillus chuẩn quốc tế.

Giải pháp và kết quả kỳ vọng

• Giải pháp tiếp cận: Kết hợp công cụ tin sinh học (dry-lab) phân tích ontology/domain với kỹ thuật sinh học phân tử thực nghiệm (wet-lab) khuếch đại gen ái lực cao bằng enzyme Phusion/DreamTaq Polymerase.
• Chỉ số đo lường kỳ vọng:
  • Tách chiết gDNA độ sạch cao (tỷ số $A_{260}/A_{280} = 1,8 - 2,0$, nồng độ $> 100\text{ ng/}\mu\text{L}$).
  • Tối ưu phản ứng PCR đạt băng điện di đơn bản, kích thước chính xác: 1TM7_03404 (408 bp), yclC (970 bp), ysnE (~550 bp).
  • Trình tự Sanger đạt chất lượng Phred score $QV > 30$, độ tương đồng đồng nhất $> 75 - 99%$ so với dữ liệu GenBank.

Phạm vi và giới hạn

• Phạm vi: Phân lập, định danh phân tử và đối chiếu cấu trúc miền chức năng của 03 gen ứng viên trên chủng B. megaterium 1TM7.
• Giới hạn: Nghiên cứu tập trung vào phân lập gen ở mức độ DNA cấu trúc; việc tạo đột biến bất hoạt knockout (CRISPR/Cas9) và định lượng động học enzyme in vivo thuộc giai đoạn tiếp theo.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí so sánh	Tổng hợp hóa học (IAA nhân tạo)	Chủng Gram âm (A. brasilense)	Bacillus megaterium 1TM7 (Nghiên cứu này)
Tính bền vững	Thấp, dư lượng tồn dư độc hại	Trung bình, kém bền ngoài đồng ruộng	Rất cao, tạo nội bào tử chịu nhiệt/hạn
Chi phí sản xuất	Cao, phụ thuộc tiền chất dầu mỏ	Trung bình	Thấp, lên men môi trường rỉ mật/nông sản
Cơ chế di truyền	Không áp dụng	Đã rõ (con đường IPyA phụ thuộc ipdC)	Hệ thống đa nhánh (IPyA, IAM, TAM, bypass ysnE)
Khả năng chỉnh sửa gen	Không	Phức tạp, dễ mất plasmid	Dễ thao tác biến nạp di truyền

Phân loại yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW

• Must have: Dự đoán chính xác vị trí locus gen trên hệ gen 1TM7; thiết kế mồi PCR đặc hiệu không tạo dimer; tách chiết gDNA không lẫn tạp chất protein/RNA.
• Should have: Giải trình tự Sanger cả 2 chiều (forward/reverse); phân tích so sánh miền bảo tồn (conserved domains) bằng NCBI CD-Search.
• Could have: Đánh giá cây phát sinh loài (phylogenetic tree) phân loại phân tử Priestia/Bacillus.
• Won't have: Biểu hiện protein tái tổ hợp quy mô công nghiệp trong pha này.

Thiết kế hệ thống sinh học và tin sinh học

graph TD
    A[PacBio Sequel Genome Assembly 5.1 Mb] --> B[KEGG-KAAS Annotation: GHOSTZ Engine]
    B --> C[Tryptophan Metabolism Map: ko00380]
    C --> D[Candidate Gene Identification]
    D --> D1[1TM7_03535: ysnE]
    D --> D2[1TM7_00770: yclC]
    D --> D3[1TM7_03404: ALDH]
    D1 & D2 & D3 --> E[NCBI Conserved Domain Validation]
    E --> F[Primer3 Specific Design]
    F --> G[Wet-Lab PCR & Sanger Verification]

Technology Stack và Công cụ chuyên dụng

• Giải trình tự hệ gen thô: Hệ máy Pacific Biosciences (PacBio) Sequel System (công nghệ SMRT sequencing).
• Hệ thống chú giải con đường trao đổi chất: KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) sử dụng thuật toán GHOSTZ với tập dữ liệu chuẩn Priestia megaterium QM B1551 và DSM 319.
• Phân tích miền protein: NCBI Conserved Domain Database (CDD v3.20), InterProScan v94.0 (mô hình HMM).
• Thiết kế và kiểm tra mồi: OligoCalc, Primer-BLAST, SnapGene v6.0.
• Hóa chất khuếch đại: DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, #K1081), Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, #M0530).
• Giải trình tự mao quản: ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems).

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

[Tuần 1-3: Genome Mining & In silico Analysis] 
[Tuần 4-6: Thiết kế mồi & Tối ưu hóa phản ứng]
[Tuần 7-11: Thực nghiệm Wet-lab]
[Tuần 12-16: Tinh sạch, Sanger Sequencing & Phân tích dữ liệu]

Ma trận quản trị rủi ro kỹ thuật

• Rủi ro 1: Vách tế bào vi khuẩn Gram dương khó phá vỡ: Sử dụng đệm CTAB 2% (w/v) nồng độ muối cao ($1,4\text{ M NaCl}$) kết hợp biến tính ở 65°C trong 120 phút; chiết phân đoạn 2 lần bằng dung môi hữu cơ Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (PCI 25:24:1).
• Rủi ro 2: Sản phẩm PCR xuất hiện băng phụ không đặc hiệu: Tăng nhiệt độ bắt mồi ($T_a = 55^\circ\text{C}$), bổ sung đệm HF (High-Fidelity) và kiểm soát chu kỳ biến tính ở 98°C khi dùng Phusion Polymerase.

---

Triển khai thực nghiệm và kết quả

Quy trình triển khai thực nghiệm

1. Quy trình tách chiết gDNA tối ưu hóa

Canh trường B. megaterium 1TM7 nuôi cấy 16 giờ trong môi trường Luria-Bertani (LB) ở 37°C, lắc 200 rpm. Thu sinh khối tế bào bằng ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút.

Thành phần đệm tách chiết CTAB Lysis Buffer:
- CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide): 2% (w/v)
- Tris-HCl (pH 8.0): 100 mM
- EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid): 20 mM
- NaCl: 1.4 M

Dịch chiết được xử lý với PCI (25:24:1, v/v/v), ly tâm $12.000 \times g$ ở 4°C thu pha nước, tiếp tục tinh sạch bằng CI (Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1). Kết tủa gDNA bằng Isopropanol lạnh (-20°C, 30 phút), rửa cặn bằng Ethanol 70% và hòa tan trong $30\text{ }\mu\text{L}$ đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).

2. Thiết kế mồi và thông số phản ứng PCR

# Bảng tổng hợp trình tự cặp mồi đặc hiệu
1. Gen 1TM7_03404 (Kích thước dự kiến: 408 bp):
   - Primer Forward (03404-F): 5'-CCGATGAAGCAGGATTCCCA-3' (Tm: 58.4°C, GC: 55%)
   - Primer Reverse (03404-R): 5'-CAAGCGGACCCATTGTTGTC-3' (Tm: 57.8°C, GC: 50%)

2. Gen ysnE / 1TM7_03535 (Kích thước dự kiến: ~550 bp):
   - Primer Forward (YsnE-F1): 5'-AGATGAGCACCACGGAGAAA-3' (Tm: 56.2°C, GC: 50%)
   - Primer Reverse (YsnE-R1): 5'-TAGAAAACGGTTCGCACTCG-3' (Tm: 56.5°C, GC: 50%)

3. Gen yclC / 1TM7_00770 (Kích thước dự kiến: 970 bp):
   - Primer Forward (YclC-F):  5'-ACCTTTTGCCATTGTTCCGC-3' (Tm: 58.1°C, GC: 50%)
   - Primer Reverse (YclC-R):  5'-CTTGTTTCTGGTGCAACCGG-3' (Tm: 59.3°C, GC: 55%)

Chu trình nhiệt PCR (Thermal Cycling Profile - 35 chu kỳ):

Kết quả kiểm định và phân tích trình tự

1. Kiểm định điện di sản phẩm khuếch đại

Điện di trên gel Agarose 1.0% (w/v) nhuộm chất huỳnh quang RedSafe 1X dưới ánh sáng UV cho thấy:

• Gen 1TM7_03404: Xuất hiện một băng sáng rõ, đồng nhất, kích thước chính xác 408 bp.
• Gen ysnE: Băng PCR đặc hiệu nét, không hiện tượng kéo vệt (smear) hoặc primer-dimer.
• Gen yclC: Khuếch đại thành công phân đoạn kích thước 970 bp tương ứng khung đọc mở mục tiêu.

    Marker 1kb    1TM7_03404        yclC          ysnE
       [M]           [1]            [2]           [3]

2. Dữ liệu giải trình tự Sanger và căn hàng sinh tin học (BLAST Alignment)

Query: ysnEseq (Bacillus megaterium 1TM7) vs Subject: Priestia aryabhattai ysnE
Identities = 99%, Gaps = 0%
Query  1   ATGCACCACGGAGAAATTGCCGTTTTGACAGATGAAGCCGTTCAAGCGCTTGAACTGGCA  60
           ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1   ATGCACCACGGAGAAATTGCCGTTTTGACAGATGAAGCCGTTCAAGCGCTTGAACTGGCA  60

Query: 1TM7_03404 vs Subject: Priestia flexa phenylacetaldehyde dehydrogenase
Identities = 80%, Positives = 89%, Gaps = 1%

• Gen ysnE (1TM7_03535): Sản phẩm mã hóa tryptophan acetyltransferase thuộc siêu họ GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT). Trình tự nucleotide đạt độ tương đồng 99% so với Priestia aryabhattai, 86% so với B. subtilis 168, và tương đồng 56% so với chủng chuẩn công nghiệp B. amyloliquefaciens SQR9.
• Gen yclC (1TM7_00770): Chứa trọn vẹn miền chức năng bảo tồn TIGR00148 thuộc họ UbiD-like decarboxylase, xúc tác phản ứng khử carboxyl không oxy hóa của indole-3-pyruvic acid (IPyA) thành indole-3-acetaldehyde (IAAld).
• Gen 1TM7_03404: Xác nhận thuộc họ Aldehyde Dehydrogenase (ALDH), tương đồng 80% với Priestia flexa và 75% so với Bacillus vallismortis / Bacillus tequilensis.

---

Đổi mới và đóng góp khoa học

Cải tiến kỹ thuật và phát hiện mới

1. Làm sáng tỏ mạng lưới chuyển hóa đa nhánh: Khác với mô hình đơn kênh ở vi khuẩn Gram âm, nghiên cứu chứng minh B. megaterium 1TM7 đồng thời duy trì 03 con đường sinh tổng hợp phụ thuộc L-tryptophan: con đường IPyA (thông qua yclC và 1TM7_03404), con đường IAM (thông qua monooxygenase 1TM7_03013 và amidase 1TM7_02571), cùng con đường TAM.
2. Vai trò then chốt của ysnE: Dữ liệu phân tích chứng minh enzyme N-acetyltransferase do ysnE mã hóa tham gia vào chu trình chuyển hóa trung gian liên kết giữa indole-3-lactate và tryptophol. Theo các bằng chứng từ B. amyloliquefaciens SQR9, khi đột biến bất hoạt ysnE, sản lượng IAA suy giảm tới 86%, và khi mất gen yclC, mức sụt giảm đạt 56%. Việc phân lập thành công cụm gen này ở 1TM7 tạo tiền đề trực tiếp để điều hòa tăng cường (overexpression) nồng độ IAA ngoại bào.

Mức độ suy giảm sản lượng IAA khi mất chức năng gen liên quan (Benchmark Evidence):
- Chủng 1TM7 WT (Wild-Type phân lập)      : 100% (Hoạt tính tổng hợp tự nhiên duy trì)

---

Ứng dụng thực tế và triển khai sản xuất

Kịch bản ứng dụng trong nông nghiệp chính xác

• Sản xuất phân bón vi sinh PGPR: Bào tử B. megaterium 1TM7 có khả năng chịu nhiệt độ sấy tầng sôi lên đến 60°C và bảo quản ổn định trong cơ chất than bùn/cám gạo trong hơn 24 tháng mà không giảm mật độ tế bào ($> 10^9\text{ CFU/g}$).
• Kích kháng và phát triển bộ rễ: Chế phẩm chứa 1TM7 áp dụng cho cây lúa và cây ăn quả giúp gia tăng sinh khối rễ từ 18% - 25%, giảm thiểu 20% lượng phân đạm bón lót nhờ khả năng kích hoạt hấp thu dinh dưỡng khoáng.

Quy trình công nghệ lên men vi sinh quy mô bán công nghiệp (Pilot 50L):
1. Môi trường nuôi cấy: Cao nấm men 0.5%, Peptone 1%, Glucose 1%, L-Tryptophan 0.1% (w/v).
2. Thông số vận hành: Nhiệt độ 30°C, pH 7.0 ± 0.2, Tốc độ khuấy 250 rpm, Độ bão hòa oxy DO = 30%.
3. Thu hoạch: Sau 36 giờ (pha sinh bào tử > 90%), ly tâm thu sinh khối phối trộn chất mang.

Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit Analysis)

• Chi phí sản xuất 1 lít chế phẩm đậm đặc ($10^{10}\text{ CFU/mL}$): ~25.000 VNĐ.
• Liều lượng sử dụng: 1 lít pha loãng tưới cho 2.000 $\text{m}^2$ đất canh tác.
• Tỷ suất lợi nhuận trên chi phí đầu tư (ROI): Đạt hoàn vốn trong vòng 01 vụ canh tác (3-4 tháng) nhờ tiết kiệm 300.000 - 500.000 VNĐ/ha chi phí phân bón vô cơ và kích thích tăng năng suất mùa vụ từ 10% đến 15%.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Phản ứng PCR và giải trình tự Sanger mới dừng lại ở việc xác thực cấu trúc DNA của các đoạn gen đơn lẻ, chưa khảo sát mức độ phiên mã (mRNA transcription level) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR trong các điều kiện bổ sung nồng độ tryptophan khác nhau.
• Chưa tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp để đo hằng số động học enzyme ($K_m$, $V_{\max}$).

Kế hoạch phát triển tiếp theo

1. Ứng dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9: Thiết kế cassette sgRNA đặc hiệu nhắm đích promoter của ysnE và yclC nhằm tích hợp các promoter mạnh cấu tạo (như $P_{veg}$ hoặc $P_{43}$) để gia tăng hiệu suất tổng hợp IAA lên gấp 2 - 3 lần.
2. Phân tích chuyển hóa định lượng: Sử dụng sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) để theo dõi động học tích lũy các chất chuyển hóa trung gian (IPyA, IAM, IAAld, IAA) theo thời gian lên men.

---

Đối tượng hưởng lợi

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để nhân bản thành công các gen từ gDNA vi khuẩn Gram dương là gì?

Cần đảm bảo mẫu gDNA được tinh sạch loại bỏ hoàn toàn polysaccharide và protein tạp thông qua quy trình ly giải nhiệt với CTAB kết hợp trích ly PCI kép. Tỷ số quang phổ $A_{260}/A_{280}$ phải đạt $1,8 - 2,0$. Sử dụng enzyme DNA Polymerase có hoạt tính đọc sửa (proofreading) như Phusion High-Fidelity nhằm giảm thiểu sai hỏng nucleotide ở mức $< 4,4 \times 10^{-7}$.

2. Sự khác biệt căn bản giữa con đường IPyA và con đường IAM ở chủng 1TM7 là gì?

Con đường IPyA là con đường 3 bước thông qua các chất trung gian IPyA và IAAld, đòi hỏi sự tham gia của aminotransferase, enzyme khử carboxyl yclC và dehydrogenase 1TM7_03404. Ngược lại, con đường IAM chỉ gồm 2 bước: tryptophan được chuyển hóa trực tiếp thành IAM nhờ tryptophan 2-monooxygenase (1TM7_03013), sau đó enzyme amidase (1TM7_02571) thủy phân IAM giải phóng IAA và gốc amoniac.

3. Tại sao gen ysnE lại đóng vai trò tối quan trọng dù không nằm trong sơ đồ IPyA truyền thống?

Gen ysnE mã hóa acetyltransferase thuộc họ GNAT. Nghiên cứu gần đây chứng minh ysnE kiểm soát nhánh chuyển hóa bổ trợ giữa indole-3-lactate và tryptophol, tạo ra mạng lưới đệm cân bằng nồng độ các tiền chất indole aldehyde nội bào, đảm bảo quá trình tổng hợp IAA liên tục không bị ức chế ngược bởi sản phẩm.

4. Bào tử vi khuẩn Bacillus megaterium có ưu thế gì vượt trội so với vi khuẩn vùng rễ Pseudomonas?

Bacillus megaterium có khả năng sinh nội bào tử (endospore) chịu được điều kiện nhiệt độ cao ($> 60^\circ\text{C}$), áp suất thẩm thấu lớn, chống chịu tia cực tím và thời gian bảo quản kéo dài nhiều năm mà không mất hoạt tính. Ngược lại, Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử, tỷ lệ sống sót suy giảm nhanh chóng khi phối trộn vào cơ chất phân bón thương phẩm.

5. Dự án cần bao lâu để chuyển giao thành sản phẩm phân bón thương mại trên thị trường?

Lộ trình thương mại hóa hoàn chỉnh mất khoảng 12 - 18 tháng, bao gồm: 3 tháng tối ưu môi trường lên men quy mô bioreactor 100L; 6 tháng khảo nghiệm đồng ruộng diện hẹp trên cây trồng mục tiêu; và 6 tháng hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành phân bón vi sinh theo tiêu chuẩn quốc gia.

---

Kết luận

Nghiên cứu đã ứng dụng thành công phương pháp tiếp cận tích hợp giữa tin sinh học và sinh học phân tử thực nghiệm để giải mã và phân lập 03 gen cấu trúc trọng yếu (ysnE, yclC, 1TM7_03404) tham gia vào mạng lưới sinh tổng hợp phytohormone IAA ở chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 1TM7. Kết quả giải trình tự khẳng định độ tin cậy và sự bảo tồn chức năng cao của các enzyme phenolic acid decarboxylase và tryptophan acetyltransferase, cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền vững chắc cho các định hướng chỉnh sửa hệ gen, tối ưu hóa quá trình lên men vi sinh phục vụ ngành nông nghiệp công nghệ cao và phát triển bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Indole 3-acetic acid (tên IUPAC: 2-(1H-indol-3-yl) acetic acid, viết tắt: IAA) là một axit monocacboxylic có công thức phân tử C10H9NO2. IAA lần đầu tiên được phát hiện trên thực vật vào cuối thế kỷ 19 và khám phá này đã đặt nền móng cho lĩnh vực “auxinology” (Spartz and Gray 2008). IAA như một chất trung tâm điều hòa quá trình sinh học, có tác dụng kích thích kéo dài tế bào bằng cách thay đổi các điều kiện sinh lý của cây như tăng tính thấm nước, tính thấm lọc, giảm áp lực tế bào xuống mức thấp v. IAA còn ngăn chặn và trì hoãn hiện tượng sinh lý của lá, thúc đẩy sự ra hoa, tạo quả, ra rễ, phân chia tế bào v.

Do đó, việc sinh tổng hợp IAA là hết sức quan trọng trong việc điều hòa sinh trưởng của cây. Với những tác dụng như vậy, IAA là chất được hướng đến tổng hợp để hỗ trợ sự sinh trưởng và phát triển của các loài cây lương thực trong ngành nông nghiệp, đặc biệt trong bối cảnh nhu cầu lương thực ngày càng gia tăng như hiện nay. Trong tự nhiên, IAA được tổng hợp bởi cả thực vật lẫn vi sinh vật vùng rễ của thực vật. Trong đó, Bacillus megaterium là vi khuẩn khá phổ biến trong vùng rễ của thực vật.

Bacillus megaterium đã được chứng minh là có khả năng sản sinh IAA với lượng lớn. Nó có hệ gen nhỏ và đã được giải trình tự, thời gian sinh trưởng và phát triển nhanh cộng với khả năng thao tác trên gen dễ dàng. megaterium là một loài vi khuẩn tiềm năng trong việc sản xuât IAA ứng dụng vào nông nghiệp". Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp IAA trên Bacillus cũng như các vi khuẩn Gram dương khác vẫn chưa được nghiên cứu kỹ càng.

Người ta mới chỉ tập trung làm rõ con đường sinh tổng hợp IAA ở thực vật và một số vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên, để có thể tối ưu hóa sự sản xuất IAA ở B. megaterium để ứng dụng, điều đầu tiên là hiểu rõ các con đường sinh tổng hợp IAA trên loài này. Vì những lý do 1 đó, tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu phân lập một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn Bacillus megaterium”.2 Mục đích, yêu cầu 1.1 Mục đích Nghiên cứu dự đoán các con sinh tổng hợp IAA có thể có trên chủng vi khuẩn B.

Phân lập các gen mã hóa cho enzyme quan trọng trong các con đường được dự đoán.2 Yêu cầu Dự đoán các con đường tiềm năng quan trọng sinh tổng hợp IAA có thể có trên vi khuẩn B. Phân lập thành công gen ysnE mã hóa cho enzyme tryptophan acetyltransferase, yclC mã hóa cho enzyme phenolic acid decarboxylase và gen 1TM7_03404 mã hóa cho enzyme phenylacetaldehyde dehydrogenase. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus megaterium Vi khuẩn B. megaterium (gần đây đã được đổi tên thành Priestia megaterium) thuộc lớp Bacilli, họ Bacillaceae, chi Bacillus.

megaterium là vi khuẩn Gram dương, thuộc trực khuẩn, đa số là vi khuẩn hiếu khí, hình thành dạng bào tử, được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau (như đất, nước biển, trầm tích, ruộng lúa, mật ong, cá và thực phẩm khô). Có chiều dài tế bào lên đến 4 µm và đường kính 1,5 µm là một trong những vi khuẩn lớn nhất được biết đến. Nó có kích thước bộ gen khoảng 5,1 Mb, với hàm lượng G + C trung bình là 38,2%, có nhiều plasmid có các kích thước từ 56kb-174kb. Nhiệt độ phát triển trong khoảng 3°C - 45°C, nhiệt độ tối thích khoảng 30°C (Vary et al.

megaterium tạo ra các sản phẩm có các protein như penicilin acylase (được sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp (Martín 1995; Suga et al. 1990), các amylase khác nhau (được dùng để biến tính tinh bột trong ngành công nghiệp bánh), glucose dehydrogenase được sử dụng để tái tạo cofactor NADH/NADPH (Nicotinamid adenin dinucleotid), trong các phản ứng sinh hóa và xét nghiệm glucose trong máu). Hơn nữa, nó được sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, độc tố diệt nấm và oxetanocin, chất ức chế vi rút HIV (vi rút suy giảm miễn dịch ở người), vi rút viêm gan B và loét giác mạc ngứa sẩn đơn do vi rút mụn rộp (herpes simplex corneal ulcers).2 Một số con đường, các gen sinh tổng hợp IAA trên thực vật và vi khuẩn. Hai con đường sinh tổng hợp IAA chính được đề xuất ở thực vật và vi khuẩn là con đường với tiền chất tryptophan và con đường với các tiền chất khác.

Với con đường sinh tổng hợp IAA không phụ thuộc tryptophan, còn chưa được biết đến 3 nhiều, các tiền chất được dự đoán có thể là indole-3-glycerol phosphate hoặc indole (Idris et al. 2007; Mano and Nemoto 2012). Với tiền chất là tryptophan có bốn con đường sinh tổng hợp IAA trên thực vật và vi khuẩn đã được các nhà khoa học đề xuất: con đường indole-3-pyruvic acid (IPyA), indole-3-acetaminde (IAM), indole-3-acetonitrile (IAN), tryptamine (TAM). (Duca et al.

Con đường indole-3-pyruvic acid. Ký hiệu: trp – tryptophan, IPyA – indole-3-pyruvic acid, IAAld – indole-3-acetaldehyde (Duca et al. 2014b) Con đường IPyA được cho là tồn tại ở thực vật, vi khuẩn có lợi và có hại. Các nhà khoa học đã chứng minh, khi con đường này bị bất hoạt quá trình sinh tổng hợp IAA bị giảm đi 90% ở loài Azospirillum Brasilense, Enterobacter cloacae , và Pseudomonas putida (Nascimento et al.

Do đó, con đường IPyA là con đường rất quan trọng trong quá trình tổng hợp IAA với tiền chất là tryptophan. Tuy nhiên, các gen mã hóa trên vi khuẩn chịu trách nhiệm cho bước oxy hóa aldehyde của con đường IPyA vẫn chưa được biết đến nhiều. Sự có mặt của con đường IPyA trên thực vật và vi khuẩn được đề xuất dựa trên việc xác định các chất trung gian tương ứng. Ban đầu, tryptophan sẽ bị khử thành indole-3-pyruvic acid (IPyA) bởi enzyme aminotransferase.

Tiếp sau đó, một enzyme decarboxylase chuyển hóa IPyA tạo ra indole-3-acetaldehyde. Cuối cùng, indole-3-acetaldehyde bị oxy hóa bởi enzyme aldehyde dehydrogenase hoặc enzyme oxidase (Hình 2-1). Gen chịu trách nhiệm cho giai đoạn oxy hóa aldehyde của con đường IPyA vẫn chưa được biết đến nhiều. Các gen indole-3-acetaldehyde dehydrogenase phụ thuộc vào 4 NADP đã xác định được trong bộ gen của Bacillus amyloliquefaciens FXB42 và Bacillus subtilis 168.

Tuy nhiên, khi cắt gen này ở B.amyloliquefaciens FXB424 việc tổng hợp IAA lại không ảnh hưởng nhiều, do đó gen này không đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp IAA. Xie và các cộng sự (2005) đã phát hiện một gen aldA trong Azospirillum brasilense Yu62 có sự tương đồng lên tới 80% so với aldehyde dehydrogenase (Xie et al. Khi chèn gen Tn5 vào vị trí gen aldA kết quả thấy lượng IAA được sản xuất ít hơn khi có gen aldA. Điều này chứng tỏ rằng, gen aldA này có tham gia xúc tác bước oxy hóa andehyde trong con đường IPyA.

Một con đường tắt được đề xuất, trong đó IAAld được tạo thành trực tiếp từ tryptophan bởi enzyme monooxygenase (Hình 2-1). Đây được gọi là con đường oxy hóa chuỗi bên tryptophan (TSO). Con đường TSO đã được đề xuất ở vi khuẩn như Pseudomonas fluorescens HP72, P. Fluorescens CHA0 và P.

Một decarboxylase chuyển indole-3-pyruvic acid thành indole-3-acetylaldehyde, đã được xác định và đặc trưng trong Az. brasilense, Enterobacter cloacae, và Pseudomonas putida. Indole-3-pyruvate decarboxylase (IPDC) là gen mã hóa enzyme chính trong con đường IPyA được gen ipdC mã hóa (Lebuhn and Hartmann 1993; Duca et al. 2014a; Mano and Nemoto 2012).

Ngoài ra, một con đường nhánh mới được đề xuất từ indole-3-pyruvate được chuyển hóa trực tiếp thành IAA. Nhưng con đường này chỉ tồn tại trên một nhóm vi khuẩn. Con đường indole-3-acetamide. Ký hiệu: IAM – indole-3-acetamide, IAN – indole-3-acetinitrile, IAOx – indole-3-acetaldoxime (Duca et al.

Con đường IAM là con đường đã được nghiên cứu rõ ràng nhất ở vi khuẩn (Hình 2-2). Con đường hai bước này được xúc tác bởi các enzyme tryptophan-2- monooxygenase (IaaM) và IAM hydrolase (IaaH), được mã hóa bởi các gen iaaM và iaaH. Các gen tương đồng với gen iaaM đã được phát hiện trên một số vi khuẩn khác, trình tự mã hóa enzyme của chúng được chia làm hai nhóm. Trình tự mã hóa cho enzyme nhóm I tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA, mã hóa cho các enzyme chuyển hóa tryptophan, chẳng hạn như mã hóa tryptophan 2- monooxygenases trong các cây như Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas Syringae Pv.

Savastanoi, Pantoea agglomerans và Dickeya dadantii. Trình tự gen mã hóa enzyme nhóm II không tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA mà nhóm này tham gia xúc tác cho phản ứng phân hủy lysine trên P. Các enzyme nitril hydratase liên kết IAN và IAM con đường bằng cách xúc tác quá trình hydrat hóa indole-3-acetonitril thành IAM, sau đó được chuyển thành sản phẩm cuối cùng IAA bởi indoleacetamide hydrolase /amidase. Nitrile hydratase đã được phát hiện ở nhiều vi khuẩn khác nhau và nhiều nghiên cứu đã khám phá sự tham gia của enzyme này trong sinh tổng hợp IAA.

Enzyme nitrile hydratase có thể hoạt động 6 trên nhiều chất nền nitrile khác nhau bao gồm nitril béo, thơm và dị vòng, chuyển đổi chúng thành các amide tương ứng. Các gen mã hóa amidase thường nằm liền kề với các gen mã hóa nitrile hydratase vì chúng chuyển đổi sản phẩm amide của nitrile hydratase thành axit cacboxylic tương ứng. Các gen mã hóa amidase dự đoán được phát hiện trong vùng lân cận của các gen nitrile hydratase trong bộ gen của Pseudomonas sp. UW4, Bacillus sp.rhodochrous J1, Rhodococcus sp.

N- 774, Pseudomonas chlororaphis B23, Brevibacter sp. japonicum USDA 110 và Ruegeria pomeroya DSS-3 (Duca et al. 2014a; Zdunek-Zastocka 2008; Nascimento et al. 2020a; Lebuhn and Hartmann 1993; Zhao 2010; Won et al.

Con đường indole-3-acetonitrile/indole-3-acetaldoxime. Trp – tryptophan, IAOx - indole-3-acetaldoxime, IAN – indole-3-acetinitrile (Duca et al. Con đường IAOx/IAN sinh tổng hợp IAA vẫn chưa được nghiên cứu nhiều trên thực vật cũng như vi khuẩn. Ở con đường này, đầu tiên tryptophan được chuyển hóa thành indole-3-acetaldoxime (hình 2-3) có thể bởi enzyme oxy hóa, tuy nhiên enzyme này giờ vẫn chưa được làm rõ trên vi khuẩn.

Trong bước thứ hai, indole-3- acetaldoxime chất trung gian được chuyển thành indole-3-acetonitril bởi enzyme acetaldoxime dehydratase. Các enzyme acetaldoxime dehydratase đã được xác định trong một số vi khuẩn và được mã hóa bởi các gen oxd. Các indole-3-acetonitrile được chuyển hóa thành IAA bởi một enzyme nitrilase trong một bước duy nhất hoặc bằng một nitrile hydratase và một amidase trong con đường hai bước. Ở vi khuẩn, các enzyme nitrilase có thể có vai trò trong tổng hợp hormone, đồng hóa chất dinh dưỡng và giải độc nitriles ngoại sinh và nội sinh (Howden and Preston 2009).

Một 7 số nitrilase khác nhau đã được nghiên cứu cụ thể về khả năng chuyển đổi IAN thành IAA. Ở một số vi khuẩn, gen mã hóa cho enzyme nitrilase được tìm thấy gần acetaldoxime các gen dehydrat và enzym của chúng hoạt động được liên kết với nhau, đã được quan sát thấy ở Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Rhodococcus sp. AK32 và Vi khuẩn Corynebacterium sp.

C5 (Won et al. 2011b; Duca et al. 2014a; Zhao 2010; Xie et al.