Nghiên Cứu Phân Lập Gen Liên Quan Đến Con Đường Sinh Tổng Hợp IAA Ở Vi Khuẩn Bacillus Megaterium

Nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA ở *Bacillus megaterium* mở ra hướng đi mới trong nông nghiệp bền vững. 59 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2022.

• Tác giả: Nguyễn Siêu Tuấn Vũ
• Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Một Số Gen Liên Quan Đến Con Đường Sinh Tổng Hợp IAA Ở Vi Khuẩn Bacillus Megaterium
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Mục đích, yêu cầu
• 1.2. Tổng quan tài liệu
• 1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus megaterium
• 1.2.2. Một số con đường, các gen sinh tổng hợp IAA trên thực vật và vi khuẩn
• 1.2.3. Các con đường trao đổi chất trên Bacillus megaterium 1TM7 từ cơ sở dữ liệu KEGG
• 1.2.4. Sinh tổng hợp IAA trên Bacillus megaterium
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp
• 2.1.1. Phương pháp khai thác cơ sở dữ liệu gen
• 2.1.2. Phương pháp tách DNA genome (gDNA) của Bacillus megaterium
• 2.1.3. Phương pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả dự đoán con đường sinh tổng hợp IAA trên vi khuẩn Bacillus megaterium 1TM7
• 3.2. Xác định các gen tiềm năng tham gia vào con đường chuyển hóa IAA
• 3.3. Khuếch đại 1TM7-03404, ysnE và yclC từ gDNA của Bacillus megaterium 1TM7
• 3.4. Kết quả giải trình tự 1TM7_03404, ysnE và yclC
• 3.4.1. Trình tự ysnE
• 3.4.2. Trình tự 1TM7_03404
• 3.4.3. Trình tự yclC
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Giới Thiệu Nghiên Cứu Gen Sinh Tổng Hợp IAA ở Bacillus

Nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA ở Bacillus megaterium mở ra hướng đi mới trong nông nghiệp bền vững. IAA (indole-3-acetic acid) là một auxin quan trọng, điều hòa sự phát triển của thực vật. Bacillus megaterium, một loại vi khuẩn Bacillus phổ biến trong vùng rễ, có khả năng sinh tổng hợp IAA. Việc hiểu rõ con đường sinh tổng hợp IAA trong Bacillus giúp tối ưu hóa việc ứng dụng vi khuẩn này trong sản xuất nông nghiệp, giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định các gen liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Mục tiêu là làm sáng tỏ cơ chế sinh tổng hợp IAA và tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn này trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Khóa luận tốt nghiệp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam năm 2022, đây là một hướng đi đầy hứa hẹn, đặc biệt khi nhu cầu lương thực ngày càng tăng cao.

1.1. Bacillus megaterium Vai Trò và Tiềm Năng Sinh Học

Bacillus megaterium là một vi khuẩn Bacillus Gram dương phổ biến, được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau. Nó nổi tiếng với khả năng sản xuất nhiều enzyme và chất chuyển hóa quan trọng, bao gồm cả IAA. Theo Vary et al., nhiệt độ phát triển tối ưu của B. megaterium là khoảng 30°C, cho thấy khả năng thích nghi cao trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Bacillus megaterium có bộ gen Bacillus megaterium kích thước khoảng 5,1 Mb, chứa nhiều plasmid. Khả năng sinh tổng hợp IAA của Bacillus megaterium có thể được ứng dụng để thúc đẩy sự phát triển của cây trồng và cải thiện năng suất cây trồng.

1.2. Tầm Quan Trọng của IAA Trong Nông Nghiệp Hiện Đại

IAA (indole-3-acetic acid) đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa sinh trưởng thực vật, ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý như kéo dài tế bào, phân chia tế bào, hình thành rễ và phát triển quả. Theo Spartz and Gray (2008), IAA là một chất trung tâm điều hòa quá trình sinh học. Việc sử dụng Bacillus megaterium để sinh tổng hợp IAA có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học và thuốc trừ sâu, đồng thời tăng cường sức khỏe của đất. Ứng dụng của Bacillus megaterium trong nông nghiệp có thể giúp tạo ra một hệ thống canh tác bền vững và thân thiện với môi trường.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Con Đường Sinh Tổng Hợp IAA

Mặc dù tiềm năng của Bacillus megaterium trong sinh tổng hợp IAA là rõ ràng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn này. Các gen sinh tổng hợp IAA và enzyme sinh tổng hợp IAA liên quan chưa được xác định đầy đủ. Việc phân lập và định danh gen gặp khó khăn do sự phức tạp của bộ gen Bacillus megaterium. Hơn nữa, việc điều hòa gen sinh tổng hợp IAA còn chưa được hiểu rõ, gây khó khăn cho việc tối ưu hóa quá trình sản xuất IAA. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào cơ chế sinh tổng hợp IAA ở thực vật và vi khuẩn Gram âm, bỏ qua vi khuẩn Gram dương như Bacillus.

2.1. Sự Khác Biệt Giữa Vi Khuẩn Gram Âm và Gram Dương

Các nghiên cứu về sinh tổng hợp IAA chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm. Con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn Gram dương, như Bacillus megaterium, vẫn còn ít được biết đến. Sự khác biệt về cấu trúc tế bào và cơ chế di truyền giữa vi khuẩn Gram âm và Gram dương đòi hỏi các phương pháp tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu gen sinh tổng hợp IAA. Việc áp dụng kết quả nghiên cứu từ vi khuẩn Gram âm sang vi khuẩn Gram dương cần được thực hiện cẩn thận, do sự khác biệt về enzyme sinh tổng hợp IAA và điều hòa gen sinh tổng hợp IAA.

2.2. Khó Khăn Trong Phân Lập và Định Danh Gen IAA

Việc phân lập và định danh gen mã hóa enzyme liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium gặp nhiều khó khăn. Bộ gen Bacillus megaterium có kích thước lớn và phức tạp, gây khó khăn cho việc xác định các marker gen đặc hiệu. Các phương pháp phân tích gen truyền thống có thể không đủ nhạy để phát hiện các gen sinh tổng hợp IAA có biểu hiện thấp. Cần có các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến, như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và phân tích trình tự gen, để giải quyết những thách thức này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tiếp Cận Sinh Học Phân Tử

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để phân tích gen liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Các phương pháp bao gồm: (1) Khai thác cơ sở dữ liệu NCBI và KEGG để xác định các gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA; (2) Phân lập Bacillus megaterium và tách chiết DNA genome (gDNA); (3) Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR; (4) Giải trình tự gen và phân tích trình tự gen để xác định các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp IAA. Các kết quả này sẽ giúp làm sáng tỏ cơ chế sinh tổng hợp IAA và tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn này.

3.1. Khai Thác Dữ Liệu Từ Cơ Sở Dữ Liệu NCBI và KEGG

Việc khai thác dữ liệu từ cơ sở dữ liệu NCBI và KEGG là bước quan trọng để xác định các gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA. Cơ sở dữ liệu NCBI cung cấp thông tin về trình tự gen và biểu hiện gen của nhiều loài vi sinh vật, bao gồm cả Bacillus megaterium. Cơ sở dữ liệu KEGG cung cấp thông tin về các con đường trao đổi chất và các enzyme liên quan. Việc kết hợp thông tin từ hai cơ sở dữ liệu này giúp xác định các gen ứng viên và enzyme có khả năng tham gia vào sinh tổng hợp IAA.

3.2. Khuếch Đại Gen Bằng Phản Ứng PCR Chi Tiết Quy Trình

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng để khuếch đại các đoạn gen cụ thể. Trong nghiên cứu này, PCR được sử dụng để khuếch đại các gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA từ gDNA của Bacillus megaterium. Quá trình PCR bao gồm các bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài. Mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được xác định từ cơ sở dữ liệu NCBI và KEGG.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Định Danh Gen và Phân Tích Trình Tự

Kết quả nghiên cứu đã định danh gen thành công ba gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium: gen ysnE, gen yclC, và gen 1TM7_03404. Phân tích trình tự gen cho thấy các gen này có sự tương đồng cao với các gen tương ứng trong các loài vi khuẩn khác. Gen ysnE mã hóa cho enzyme tryptophan acetyltransferase, gen yclC mã hóa cho enzyme phenolic acid decarboxylase, và gen 1TM7_03404 mã hóa cho enzyme phenylacetaldehyde dehydrogenase. Các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong con đường sinh tổng hợp IAA.

4.1. Gen ysnE Vai Trò Trong Sinh Tổng Hợp IAA

Gen ysnE mã hóa cho enzyme tryptophan acetyltransferase, một enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp IAA. Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa tryptophan, tạo ra một chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp IAA. Phân tích trình tự gen cho thấy gen ysnE trong Bacillus megaterium có sự tương đồng cao với gen ysnE trong các loài vi khuẩn khác. Điều này cho thấy gen ysnE có vai trò bảo tồn trong sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn.

4.2. Gen yclC Liên Quan Đến Quá Trình Chuyển Hóa Phenolic Acid

Gen yclC mã hóa cho enzyme phenolic acid decarboxylase, một enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa phenolic acid. Mối liên hệ giữa enzyme này và sinh tổng hợp IAA cần được nghiên cứu thêm. Enzyme này có thể ảnh hưởng đến con đường sinh tổng hợp IAA thông qua việc điều chỉnh nồng độ các chất trung gian. Phân tích trình tự gen của gen yclC trong Bacillus megaterium cung cấp thông tin quan trọng về chức năng và vai trò của enzyme này trong sinh tổng hợp IAA.

V. Ứng Dụng và Tiềm Năng Của Bacillus megaterium Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp. Việc sử dụng Bacillus megaterium làm phân bón sinh học có thể giúp thúc đẩy tăng trưởng thực vật, cải thiện năng suất cây trồng, và giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học. Vai trò của IAA ở Bacillus megaterium trong việc tương tác với thực vật là rất quan trọng. Ảnh hưởng của IAA đến sự phát triển thực vật cũng như tầm quan trọng của IAA trong nông nghiệp ngày càng được khẳng định. Công nghệ sinh học có thể được sử dụng để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium, tăng cường hiệu quả của phân bón sinh học.

5.1. Phát Triển Phân Bón Sinh Học Từ Bacillus megaterium

Bacillus megaterium có thể được sử dụng để sản xuất phân bón sinh học giàu IAA. Phân bón sinh học từ Bacillus megaterium có thể giúp cải thiện sức khỏe của đất, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng, và bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh. Việc sử dụng phân bón sinh học từ Bacillus megaterium là một giải pháp bền vững cho nông nghiệp, giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

5.2. Tối Ưu Hóa Quá Trình Sinh Tổng Hợp IAA Bằng Công Nghệ

Công nghệ sinh học có thể được sử dụng để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Các kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật biến đổi gen có thể được sử dụng để tăng cường biểu hiện gen của các gen sinh tổng hợp IAA. Các điều kiện nuôi cấy cũng có thể được tối ưu hóa để tăng cường sinh tổng hợp IAA. Việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA sẽ giúp tăng cường hiệu quả của phân bón sinh học từ Bacillus megaterium.

VI. Kết Luận Hướng Đi Mới Cho Nghiên Cứu và Ứng Dụng

Nghiên cứu về gen liên quan đến sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium đã mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp. Các kết quả nghiên cứu đã định danh gen ba gen tiềm năng tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA, cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về điều hòa gen sinh tổng hợp IAA và cơ chế tương tác giữa Bacillus megaterium và thực vật là cần thiết để tối ưu hóa ứng dụng của vi khuẩn này trong nông nghiệp.

6.1. Các Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Trong Tương Lai

Trong tương lai, cần có các nghiên cứu sâu hơn về điều hòa gen sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium. Cần tìm hiểu các yếu tố môi trường và di truyền ảnh hưởng đến biểu hiện gen của các gen sinh tổng hợp IAA. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về cơ chế tương tác giữa Bacillus megaterium và thực vật, để hiểu rõ hơn về cách Bacillus megaterium thúc đẩy tăng trưởng thực vật.

6.2. Đề Xuất Các Ứng Dụng Thực Tiễn Trong Sản Xuất Nông Nghiệp

Các kết quả nghiên cứu về gen sinh tổng hợp IAA trong Bacillus megaterium có thể được ứng dụng để phát triển các sản phẩm nông nghiệp mới. Có thể phát triển các chế phẩm sinh học chứa Bacillus megaterium để cải thiện sức khỏe của đất và tăng cường khả năng kháng bệnh của cây trồng. Các sản phẩm này có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học và thuốc trừ sâu, góp phần vào một nền nông nghiệp bền vững.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Indole-3-acetic acid (tên danh pháp quốc tế IUPAC: 2-(1H-indol-3-yl) acetic acid, công thức phân tử C10H9NO2, viết tắt là IAA) là một phytohormone thuộc nhóm auxin giữ vai trò điều hòa trung tâm trong các quá trình sinh lý thực vật. Hợp chất này kích thích sự kéo dài tế bào thông qua cơ chế làm tăng tính thấm nước, tính thấm lọc và làm giảm áp lực thành tế bào; đồng thời thúc đẩy quá trình phân chia tế bào, kích thích ra rễ, phân hóa hoa, đậu quả và làm chậm quá trình già hóa của lá. Do vai trò thiết yếu đối với sinh trưởng cây trồng, việc khai thác khả năng sinh tổng hợp IAA từ vi sinh vật vùng rễ nhằm phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững đang thu hút sự chú ý trong bối cảnh nhu cầu an ninh lương thực toàn cầu ngày càng gia tăng.

Trong tự nhiên, bên cạnh thực vật, nhiều vi sinh vật nội sinh và vi sinh vật vùng rễ có khả năng tổng hợp IAA. Vi khuẩn Bacillus megaterium (gần đây được phân loại lại với tên khoa học là Priestia megaterium) là loài trực khuẩn Gram dương phổ biến trong đất và vùng rễ cây trồng, sở hữu kích thước tế bào lớn, tốc độ sinh trưởng nhanh, hệ gen tương đối nhỏ đã được giải trình tự hoàn chỉnh và có khả năng thao tác di truyền thuận lợi. Loài vi khuẩn này đã được chứng minh có khả năng sinh tổng hợp lượng lớn IAA, mang tiềm năng ứng dụng cao trong việc chế tạo các chế phẩm vi sinh kích thích sinh trưởng cây trồng.

Mặc dù các con đường sinh tổng hợp IAA ở thực vật và một số vi khuẩn Gram âm (như Azospirillum brasilense, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida) đã được làm sáng tỏ tương đối chi tiết, các cơ chế và con đường chuyển hóa tương ứng ở các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là chi Bacillus, vẫn còn nhiều khoảng trống học thuật. Để có thể định hướng và tối ưu hóa khả năng sản sinh IAA của B. megaterium, việc xác định các con đường trao đổi chất và phân lập các gen chức năng đóng vai trò xúc tác là nhiệm vụ tiền đề mang tính quyết định.

Từ bối cảnh thực tiễn và lý luận nêu trên, đề tài "Nghiên cứu phân lập một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn Bacillus megaterium" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và yêu cầu khoa học sau:

• Mục đích nghiên cứu:

  1. Dự đoán các con đường sinh tổng hợp IAA có thể tồn tại trên chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 1TM7 bằng các công cụ tin sinh học.
  2. Phân lập các gen mã hóa cho các enzyme then chốt tham gia vào các con đường chuyển hóa đã được dự đoán.

• Nhiệm vụ và yêu cầu nghiên cứu:

  1. Sử dụng hệ thống công cụ phân tích tin sinh học để dự đoán các con đường chuyển hóa tryptophan tạo thành IAA tiềm năng trên hệ gen chủng Bacillus megaterium 1TM7.
  2. Phân lập và giải trình tự thành công 03 gen ứng viên quan trọng: gen ysnE (mã hóa enzyme tryptophan acetyltransferase), gen yclC (mã hóa enzyme phenolic acid decarboxylase) và gen mang mã locus 1TM7_03404 (mã hóa enzyme phenylacetaldehyde dehydrogenase).

• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 1TM7 có hoạt tính sinh IAA cao, hệ gen của chủng đã được giải trình tự bằng công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba PacBio Sequel (mẫu nghiên cứu do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp, là sản phẩm thuộc đề tài cấp Nhà nước mã số KHCN-TN/16-20).
  • Phạm vi nghiên cứu: Khai thác cơ sở dữ liệu hệ gen in silico và thực nghiệm sinh học phân tử (tách chiết DNA tổng số, thiết kế mồi, phản ứng khuếch đại gen bằng PCR, tinh sạch sản phẩm thôi gel và giải trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger) đối với 03 gen mục tiêu (ysnE, yclC, 1TM7_03404) tại Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoàn thành năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Quá trình sinh tổng hợp IAA ở vi sinh vật được phân thành hai nhóm cơ chế chính: con đường không phụ thuộc tryptophan (với tiền chất giả định là indole-3-glycerol phosphate hoặc indole) và các con đường phụ thuộc tryptophan. Ở nhóm phụ thuộc tryptophan, bốn con đường chuyển hóa chính đã được ghi nhận ở vi sinh vật bao gồm:

1. Con đường Indole-3-pyruvic acid (IPyA): Tryptophan chuyển hóa thành IPyA nhờ enzyme aminotransferase, sau đó IPyA bị khử carboxyl thành indole-3-acetaldehyde (IAAld) nhờ enzyme indole-3-pyruvate decarboxylase (IPDC), cuối cùng IAAld bị oxy hóa thành IAA nhờ enzyme aldehyde dehydrogenase.
2. Con đường Indole-3-acetamide (IAM): Tryptophan chuyển hóa thành IAM qua phản ứng xúc tác của tryptophan 2-monooxygenase (IaaM), sau đó IAM được enzyme IAM hydrolase/amidase (IaaH) thủy phân trực tiếp thành IAA.
3. Con đường Indole-3-acetonitrile/Indole-3-acetaldoxime (IAN/IAOx): Tryptophan chuyển thành IAOx, sau đó thành IAN nhờ acetaldoxime dehydratase, và cuối cùng IAN chuyển thành IAA qua enzym nitrilase hoặc phức hợp nitrile hydratase/amidase.
4. Con đường Tryptamine (TAM): Tryptophan chuyển hóa thành tryptamine nhờ enzyme tryptophan decarboxylase (TDC), tiếp tục chuyển hóa qua các sản phẩm trung gian để tạo thành IAAld trước khi oxy hóa thành IAA.

Đối với hệ gen vi khuẩn Bacillus megaterium (hệ gen kích thước khoảng 5,1 Mb, hàm lượng G+C trung bình 38,2%), các nghiên cứu so sánh genome ở nhóm Firmicutes cho thấy sự hiện diện chủ yếu của 03 con đường: IPyA, IAM và TAM, trong khi con đường IAN không phổ biến.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và tin sinh học

Nghiên cứu kết hợp phương pháp phân tích tin sinh học in silico và thực nghiệm sinh học phân tử in vitro:

• Phương pháp phân tích tin sinh học:

  • Khai thác cơ sở dữ liệu KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) qua giao thức BBH (Bi-directional Best Hit) và thuật toán GHOSTZ đối với tập hợp dữ liệu acid amin của chủng 1TM7, đối chiếu trực tiếp với hai chủng chuẩn Priestia megaterium QM B1551 và Priestia megaterium DSM 319 nhằm xác định hệ thống các con đường trao đổi chất (đặc biệt là con đường Tryptophan metabolism - mã số ko00380).
  • Sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI Conserved Domain Database (CDD) để quét và xác định các miền chức năng (conserved domains), vị trí xúc tác của các chuỗi polypeptide suy diễn từ các khung đọc mở (ORF).
  • So sánh, căn gióng trình tự cục bộ bằng công cụ BLAST (BLASTn, BLASTp) trên ngân hàng dữ liệu GenBank (NCBI).

• Phương pháp tách chiết DNA tổng số (gDNA):

  • Nuôi cấy chủng 1TM7 trong môi trường Luria-Bertani (LB) lỏng ở 37°C, lắc 200 vòng/phút qua đêm.
  • Phá vỡ màng tế bào bằng đệm CTAB 2% (w/v) chứa Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M và ủ nhiệt tại 65°C trong 2 giờ.
  • Tinh sạch protein và lipid bằng dung dịch phenol:chloroform:isoamyl alcohol (PCI) tỉ lệ 25:24:1 (% v/v) và chloroform:isoamyl alcohol (CI) tỉ lệ 24:1 (% v/v), thu hồi pha nước sau ly tâm 12.000 × g ở 4°C.
  • Kết tủa acid nucleic bằng isopropanol lạnh ở -20°C trong tối thiểu 30 phút, rửa cặn lắng bằng ethanol 70%, làm khô và hòa tan lại trong đệm TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0).

• Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR và tinh sạch sản phẩm:

  • Thực hiện phản ứng PCR sử dụng enzyme DreamTaq 2X DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific) cho phản ứng kiểm tra sơ bộ và Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix (New England Biolabs - NEB) cho phản ứng khuếch đại độ chính xác cao.
  • Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các phân đoạn gen 1TM7_03404, ysnE và yclC.
  • Kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel agarose 1% (w/v) nhuộm chất huỳnh quang RedSafe (Intron).
  • Thu hồi và tinh sạch băng DNA mục tiêu từ gel agarose bằng bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) theo nguyên lý bắt giữ DNA trên màng silica.

• Phương pháp giải trình tự gen:

  • Định lượng nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau tinh sạch bằng máy quang phổ vi thể NanoDrop.
  • Giải trình tự nucleotide hai chiều theo nguyên lý kết thúc chuỗi Sanger tự động gắn huỳnh quang dideoxynucleotide (ddNTP) trên hệ thống mao quản ABI Prism. So đối chiếu trình tự đọc được với dữ liệu genome PacBio ban đầu.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này trình bày lý do lựa chọn đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Bacillus megaterium dựa trên tiềm năng sinh học của auxin IAA đối với nông nghiệp và các đặc tính ưu việt của chủng vi khuẩn nội sinh 1TM7. Tác giả chỉ rõ khoảng trống tri thức: trong khi các con đường sinh tổng hợp IAA ở thực vật và vi khuẩn Gram âm đã được nghiên cứu sâu, cơ chế ở vi khuẩn Gram dương nói chung và B. megaterium nói riêng vẫn chưa rõ ràng. Từ đó, chương xác định hai mục đích cốt lõi là dự đoán các con đường trao đổi chất qua công cụ tin sinh học và phân lập thành công ba gen enzyme then chốt (ysnE, yclC, 1TM7_03404).

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết bao quát trên 7 phân mục chính:

• Đặc điểm sinh học của Bacillus megaterium: Trình bày vị trí phân loại học, kích thước hình thái tế bào (dài 4 µm, đường kính 1,5 µm), cấu trúc hệ gen (kích thước 5,1 Mb, tỷ lệ G+C 38,2%, hệ thống plasmid 56–174 kb), nhiệt độ sinh trưởng tối thích 30°C và các ứng dụng công nghiệp (sản xuất penicillin acylase, amylase, glucose dehydrogenase, vitamin B12, pyruvate).
• Các con đường sinh tổng hợp IAA: Phân tích chi tiết 4 con đường phụ thuộc tryptophan gồm IPyA, IAM, IAN/IAOx và TAM, chỉ rõ các enzyme chuyển hóa và các gen tương ứng đã biết ở các loài vi sinh vật khác (Azospirillum brasilense, Pseudomonas, Bacillus amyloliquefaciens SQR9).
• Dữ liệu KEGG về hệ thống trao đổi chất của chủng 1TM7: Thống kê phân tích từ KAAS chỉ ra hệ gen chủng 1TM7 chứa 1931 gen mã hóa protein tham gia vào 214 con đường trao đổi chất.

Mã con đường (Pathway ID)	Tên con đường trao đổi chất	Số lượng trình tự gen
Ko00360	Phenylalanine metabolism	8
Ko00380	Tryptophan metabolism	10
Ko00561	Glycerolipid metabolism	11
Ko00061	Fatty acid biosynthesis	12
Ko00020	Citrate cycle (TCA cycle)	22
Ko00010	Glycolysis / Gluconeogenesis	31
Ko00620	Pyruvate metabolism	34
Ko00230	Purine metabolism	39
Ko00270	Cysteine and methionine metabolism	42
Ko03010	Ribosome	52

• Tổng quan về sinh tổng hợp IAA ở Bacillus: Khái quát các công bố gần đây ở B. amyloliquefaciens SQR9 và B. megaterium STB1, qua đó nhấn mạnh sự hiện diện của các gen patB, yclB, dhaS, ysnE và các enzyme khử carboxyl, dehydrogenase.
• Phương pháp nghiên cứu chức năng gen: Khái quát nguyên lý các công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 (các biến thể Recombineering, CRISPRi, CRISPRa) và cơ chế can thiệp RNA (RNAi gồm miRNA, siRNA, phức hợp RISC, phân cắt qua AGO2).
• Các thế hệ công nghệ giải trình tự DNA: Lược sử phát triển từ thế hệ thứ nhất (Sanger, Maxam-Gilbert, hệ thống ABI Prism 310, 3700), thế hệ thứ hai NGS (Roche 454, Solexa/Illumina, SOLiD), thế hệ thứ ba (PacBio SMRT, Oxford Nanopore MinION) đến thế hệ thứ tư (in situ sequencing).
• Hệ thống công cụ tin sinh học: Phân tích cấu trúc và chức năng của các cơ sở dữ liệu NCBI (GenBank, PubChem, PubMed, các thuật toán BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn, tBLASTx, Conserved Domains CDD), máy chủ chú giải tự động KAAS và cơ sở dữ liệu tích hợp họ protein InterPro.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết các nguyên vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thao tác:

• Nguồn mẫu: Chủng Bacillus megaterium 1TM7 có khả năng sinh IAA phân lập từ đề tài KHCN-TN/16-20, hệ gen giải bằng PacBio Sequel.
• Hóa chất: Hệ đệm CTAB, dung môi hữu cơ PCI (25:24:1), CI (24:1), cồn tuyệt đối, isopropanol, đệm TE, hóa chất PCR DreamTaq 2X, Phusion HotStart Flex, chất nhuộm RedSafe, cột tinh sạch gel GeneJET.
• Các quy trình chuẩn hóa:
  • Quy trình khai thác KEGG-KAAS qua job request BBH, chương trình GHOSTZ đối chiếu với 2 chủng đối chứng P. megaterium QM B1551 và DSM 319; quy trình tìm kiếm miền chức năng trên NCBI Conserved Domains.
  • Quy trình ly trích gDNA vi khuẩn biến tính bằng CTAB ở 65°C trong 2 giờ, chiết tách pha hữu cơ nhiều lần, tủa cồn ở -20°C.
  • Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho hai hệ enzyme Taq polymerase (95°C trong 3 phút; 35 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, 55°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây; kéo dài 72°C trong 10 phút) và Phusion HotStart Flex (98°C trong 3 phút; 35-40 chu kỳ gồm 98°C trong 10 giây, 55°C trong 10 giây, 72°C theo độ dài đoạn gen; kéo dài 72°C trong 7 phút).
  • Quy trình cắt lọc gel, hòa tan bằng Binding Buffer ở 55°C, ly tâm qua cột silica, rửa màng và thôi giải DNA bằng Elution Buffer.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 tập trung vào 4 nội dung kết quả thực nghiệm:

• Dự đoán các con đường chuyển hóa IAA trên chủng 1TM7: Phân tích in silico đã xác định 03 con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc tryptophan:
  1. Con đường IPyA: Tryptophan chuyển hóa thành IPyA nhờ 3 gen aminotransferase dự đoán (1TM7_00232, 1TM7_02089, 1TM7_03361); IPyA chuyển hóa thành IAAld nhờ phenolic acid decarboxylase (PAD) do gen 1TM7_00770 (yclC) mã hóa (họ UbiD decarboxylase mang miền TIGR00148); IAAld bị oxy hóa thành IAA nhờ aldehyde dehydrogenase (1TM7_03404 mã hóa phenylacetaldehyde dehydrogenase thuộc họ ALDH, cùng với 1TM7_02048/03518). Ngoài ra, còn phát hiện nhánh oxy hóa trực tiếp IPyA thành IAA thông qua ferredoxin-NADP reductase (1TM7_00266) và L-lysine N6-monooxygenase (1TM7_04180).
  2. Con đường IAM: Tryptophan chuyển thành IAM nhờ enzyme monooxygenase MoxC do 1TM7_03013 hoặc 1TM7_02097 mã hóa (EC:1.13.12.3); sau đó IAM thủy phân thành IAA nhờ amidase do 1TM7_02571/02703 (Omega-amidase YafV) và 1TM7_04578 (2-amino-5-chloromuconic acid deaminase).
  3. Con đường TAM: Tryptophan chuyển thành tryptamine nhờ decarboxylase 1TM7_00770 (yclC); tryptamine chuyển thành IAAld nhờ 1TM7_03612 (NADH oxidase) và 1TM7_04895/04900 (oxidoreductase YvdP); IAAld chuyển thành IAA bởi enzyme dehydrogenase (1TM7_03404 và 1TM7_02048/03518).
  4. Vai trò của gen ysnE (1TM7_03535): Mã hóa enzyme tryptophan acetyltransferase giả định thuộc họ N-acetyltransferase, đóng vai trò xúc tác liên kết chuyển hóa indole-3-pyruvate thành indole-3-acetaldehyde và tham gia vào nhánh tryptamine.

Con đường	Phản ứng chuyển hóa	Enzyme xúc tác	Gen dự đoán trên 1TM7
IPyA	Trp → IPyA	Aminotransferase	1TM7_00232, 1TM7_02089, 1TM7_03361
	IPyA → IAAld	Phenolic acid decarboxylase	1TM7_00770 (yclC)
	IAAld → IAA	Phenylacetaldehyde dehydrogenase	1TM7_03404, 1TM7_02048/03518
	IPyA → IAA (nhánh trực tiếp)	Oxidoreductase	1TM7_00266, 1TM7_04180
IAM	Trp → IAM	Tryptophan 2-monooxygenase	1TM7_03013, 1TM7_02097
	IAM → IAA	Amidase / Deaminase	1TM7_02571/02703, 1TM7_04578
TAM	Trp → Tryptamine	Decarboxylase	1TM7_00770 (yclC)
	Tryptamine → IAAld	NADH oxidase / Oxidoreductase	1TM7_03612, 1TM7_04895/04900
	IAAld → IAA	Aldehyde dehydrogenase	1TM7_03404, 1TM7_02048/03518
Liên nhánh	Indole-3-pyruvate ↔ IAAld	Tryptophan acetyltransferase	1TM7_03535 (ysnE)

• Lựa chọn gen phân lập: Ba gen ysnE, yclC và 1TM7_03404 được chọn làm mục tiêu khuếch đại do tham gia vào các mắt xích phản ứng trung tâm của cả hai con đường IPyA và TAM.
• Kết quả PCR:
  • Khuếch đại gen 1TM7_03404 bằng cặp mồi 03404-F/R thu được một băng đặc hiệu duy nhất có kích thước đúng 408 bp.
  • Khuếch đại gen ysnE thành công bằng các cặp mồi chuyên biệt (YsnE-F1/R1, Up.R và YE).
  • Khuếch đại gen yclC bằng cặp mồi YclC-F/R thu được sản phẩm kích thước chuẩn 970 bp.

Tên gen	Tên mồi	Trình tự nucleotide mồi (5’ - 3’)	Kích thước sản phẩm
1TM7_03404	03404-F 03404-R	CCGATGAAGCAGGATTCCCA CAAGCGGACCCATTGTTGTC	408 bp
ysnE (1TM7_03535)	YsnE-F1 YsnE-R1	AGATGAGCACCACGGAGAAA TAGAAAACGGTTCGCACTCG	Băng điện di đặc hiệu
yclC (1TM7_00770)	YclC-F YclC-R	ACCTTTTGCCATTGTTCCGC CTTGTTTCTGGTGCAACCGG	970 bp

• Kết quả giải trình tự Sanger: Các peak tín hiệu huỳnh quang rõ ràng, đơn pic, không có tạp nhiễu:
  • Trình tự gen ysnE của chủng 1TM7 có độ tương đồng đạt 99% so với trình tự ysnE của Priestia aryabhattai, đạt 86% so với Bacillus subtilis 168, và đạt 56% so với Bacillus amyloliquefaciens SQR9.
  • Trình tự gen 1TM7_03404 có độ tương đồng đạt 80% so với trình tự tương ứng ở loài Priestia flexa, và đạt 75% so với các gen có cùng chức năng ở Bacillus vallismortis và Bacillus tequilensis.
  • Trình tự gen yclC sau khi ráp nối hoàn toàn trùng khớp với trình tự locus 1TM7_00770 trên hệ gen giải mã ban đầu của chủng B. megaterium 1TM7.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tác giả tổng kết các kết quả đạt được: đã dự đoán thành công các cụm gen tham gia 3 con đường sinh tổng hợp IAA (IPyA, IAM, TAM) trên chủng 1TM7; thiết kế thành công các cặp mồi và nhân bản chính xác 3 gen ysnE, yclC, 1TM7_03404; giải trình tự và xác định mức độ tương đồng di truyền của các gen phân lập được so với cơ sở dữ liệu quốc tế. Phần kiến nghị đề xuất tiếp tục nghiên cứu kiểm chứng chức năng thực tế của từng gen bằng các phương pháp đột biến tạo chủng khuyết dưỡng hoặc can thiệp biểu hiện gen (như hệ thống CRISPR/Cas9) để định lượng chính xác sự thay đổi hiệu suất sinh tổng hợp IAA.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã ghi nhận các kết quả thực nghiệm và số liệu cụ thể sau:

1. Dữ liệu phân tích hệ gen in silico:

   • Xác định được 1931 gen mã hóa protein liên quan đến 214 con đường trao đổi chất trên hệ gen B. megaterium 1TM7 qua công cụ KAAS.
   • Xác định 10 gen thuộc con đường chuyển hóa tryptophan (ko00380), từ đó làm sáng tỏ sự hiện diện của 3 con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc tryptophan gồm: IPyA (chứa các gen aminotransferase 1TM7_00232, 1TM7_02089, 1TM7_03361; decarboxylase 1TM7_00770; aldehyde dehydrogenase 1TM7_03404, 1TM7_02048/03518), IAM (monooxygenase 1TM7_03013, 1TM7_02097; amidase 1TM7_02571/02703, 1TM7_04578) và TAM (decarboxylase 1TM7_00770; oxidase 1TM7_03612, 1TM7_04895/04900; dehydrogenase 1TM7_03404).
   • Xác lập vai trò trung gian tiềm năng của gen ysnE (1TM7_03535) thuộc họ N-acetyltransferase trong mạng lưới liên kết chuyển hóa giữa indole-3-pyruvate, tryptamine và indole-3-acetaldehyde.

2. Dữ liệu thực nghiệm sinh học phân tử:

   • Tối ưu hóa thành công quy trình ly trích tách chiết DNA tổng số từ chủng B. megaterium 1TM7 bằng phương pháp biến tính CTAB 2% kết hợp chiết tách hữu cơ PCI/CI.
   • Nhân bản thành công phân đoạn gen 1TM7_03404 có kích thước chính xác 408 bp bằng cặp mồi chuyên biệt 03404-F/R.
   • Nhân bản thành công phân đoạn gen yclC (1TM7_00770) có kích thước chuẩn 970 bp bằng cặp mồi YclC-F/R.
   • Nhân bản thành công gen ysnE (1TM7_03535) bằng các hệ mồi YsnE-F1/R1, Up.R và YE.

3. Số liệu tương đồng sau giải trình tự Sanger:

   • Đoạn trình tự ysnE phân lập từ chủng 1TM7 đạt mức độ tương đồng 99% với Priestia aryabhattai, 86% với Bacillus subtilis 168 và 56% với Bacillus amyloliquefaciens SQR9.
   • Đoạn trình tự 1TM7_03404 đạt mức độ tương đồng 80% với loài Priestia flexa, và 75% với Bacillus vallismortis và Bacillus tequilensis.
   • Trình tự phân đoạn gen yclC kiểm chứng tính chính xác tuyệt đối với dữ liệu genome PacBio đã chú giải của chủng.

4. Đóng góp học thuật tự ghi nhận:

   • Khóa luận đóng góp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về việc định danh và phân lập các gen tham gia sinh tổng hợp IAA trên chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 1TM7 tại Việt Nam.
   • Cung cấp các dẫn liệu sinh học phân tử cụ thể (trình tự mồi, điều kiện luân nhiệt PCR, trình tự nucleotide) phục vụ cho các nghiên cứu biểu hiện gen và kỹ thuật di truyền tiếp theo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:

  • Đề tài mới dừng lại ở mức độ dự đoán in silico và phân lập, kiểm chứng trình tự gen in vitro bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự Sanger; chưa tiến hành đánh giá biểu hiện mức độ phiên mã (transcription) hoặc dịch mã (translation) của các gen này trong điều kiện nuôi cấy thực tế có bổ sung tiền chất L-tryptophan.
  • Chưa thực hiện việc tạo dòng vi khuẩn đột biến knock-out (bất hoạt gen) hoặc overexpression (biểu hiện quá mức) đối với ba gen ysnE, yclC, 1TM7_03404 để xác định định lượng tỷ lệ sụt giảm hay gia tăng hàm lượng IAA sinh ra của chủng 1TM7.

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Ứng dụng các công cụ chỉnh sửa hệ gen vi khuẩn hiện đại (như kỹ thuật CRISPR/Cas9 tái tổ hợp recombineering hoặc can thiệp ức chế phiên mã CRISPRi đã được tổng quan trong khóa luận) để bất hoạt từng gen mục tiêu nhằm xác định chính xác mức độ đóng góp chức năng của từng con đường IPyA, IAM và TAM đối với tổng lượng IAA tạo thành.
  • Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men sinh khối và biểu hiện gen để khai thác chủng vi khuẩn B. megaterium 1TM7 trong sản xuất chế phẩm sinh học kích thích sinh trưởng cây trồng nông nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận là nguồn tài liệu học thuật có giá trị tham khảo rõ rệt đối với:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Di truyền học và Nông nghiệp: Cung cấp quy trình chi tiết về việc kết hợp các công cụ tin sinh học (KEGG-KAAS, NCBI BLAST, Conserved Domains) trong việc khai thác dữ liệu hệ gen vi khuẩn (genome mining) để định hướng thực nghiệm sinh học phân tử.
• Các nhà nghiên cứu về vi sinh vật vùng rễ (PGPR): Cung cấp dữ liệu chi tiết về thông số các cặp mồi PCR, nồng độ thành phần hóa chất các dung dịch đệm phân tích (CTAB, PCI, CI, TE), chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng khuếch đại gen vi khuẩn Gram dương thành dày, cùng hệ thống bảng mã locus gen chuyển hóa auxin ở vi khuẩn Bacillus megaterium.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu và hệ gen của nó được giải trình tự bằng công nghệ nào?
Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 1TM7 có hoạt tính sinh IAA cao là sản phẩm nghiên cứu của đề tài khoa học cấp Nhà nước mang mã số KHCN-TN/16-20. Dữ liệu hệ gen của chủng 1TM7 được đọc và giải trình tự hoàn chỉnh bằng hệ thống máy PacBio Sequel sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba SMRT (Single-Molecule Real-Time) do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.

2. Ba con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc tryptophan được tác giả dự đoán trên hệ gen chủng 1TM7 là những con đường nào?
Dựa trên kết quả phân tích KAAS (KEGG) và các miền chức năng từ NCBI CDD, tác giả xác định ba con đường chuyển hóa phụ thuộc tryptophan trên chủng 1TM7 gồm: con đường Indole-3-pyruvic acid (IPyA), con đường Indole-3-acetamide (IAM) và con đường Tryptamine (TAM). Con đường Indole-3-acetonitrile (IAN) không được ghi nhận trên chủng này.

3. Ba gen tiềm năng được lựa chọn để khuếch đại và phân lập thực nghiệm mã hóa cho các enzyme nào?
Ba gen được lựa chọn để khuếch đại và phân lập gồm:

• Gen ysnE (mã locus 1TM7_03535): mã hóa enzyme tryptophan acetyltransferase giả định thuộc họ N-acetyltransferase.
• Gen yclC (mã locus 1TM7_00770): mã hóa enzyme phenolic acid decarboxylase (PAD) thuộc họ UbiD decarboxylase.
• Gen mang mã locus 1TM7_03404: mã hóa enzyme phenylacetaldehyde dehydrogenase thuộc họ ALDH.

4. Kích thước các sản phẩm khuếch đại PCR của các gen mục tiêu là bao nhiêu?
Phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã khuếch đại phân đoạn gen 1TM7_03404 có kích thước chính xác là 408 bp (sử dụng cặp mồi 03404-F/R) và phân đoạn gen yclC có kích thước là 970 bp (sử dụng cặp mồi YclC-F/R). Gen ysnE được khuếch đại thành công cho các băng điện di đặc hiệu bằng cặp mồi YsnE-F1/R1 cùng các cặp mồi Up.R và YE.

5. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của các gen sau khi giải trình tự Sanger so với các cơ sở dữ liệu quốc tế như thế nào?
Kết quả căn gióng trình tự đọc được cho thấy: gen ysnE của chủng 1TM7 có độ tương đồng đạt 99% so với Priestia aryabhattai, đạt 86% so với Bacillus subtilis 168 và đạt 56% so với Bacillus amyloliquefaciens SQR9; gen 1TM7_03404 đạt độ tương đồng 80% so với Priestia flexa và 75% so với Bacillus vallismortis và Bacillus tequilensis; gen yclC có trình tự hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu giải trình tự hệ gen PacBio ban đầu của chủng.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Siêu Tuấn Vũ đã kết hợp thành công phương pháp tin sinh học in silico trên nền tảng cơ sở dữ liệu KEGG-KAAS và NCBI với các kỹ thuật sinh học phân tử thực nghiệm để nghiên cứu mạng lưới sinh tổng hợp IAA ở chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 1TM7. Công trình đã xác định sự hiện diện của ba con đường chuyển hóa phụ thuộc tryptophan (IPyA, IAM, TAM), đồng thời thiết kế hệ mồi và phân lập, giải trình tự Sanger thành công ba gen enzyme cấu trúc then chốt gồm ysnE, yclC và 1TM7_03404. Kết quả nghiên cứu tạo lập cơ sở dữ liệu di truyền vững chắc phục vụ các định hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn vùng rễ trong sản xuất nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Indole 3-acetic acid (tên IUPAC: 2-(1H-indol-3-yl) acetic acid, viết tắt: IAA) là một axit monocacboxylic có công thức phân tử C10H9NO2. IAA lần đầu tiên được phát hiện trên thực vật vào cuối thế kỷ 19 và khám phá này đã đặt nền móng cho lĩnh vực “auxinology” (Spartz and Gray 2008). IAA như một chất trung tâm điều hòa quá trình sinh học, có tác dụng kích thích kéo dài tế bào bằng cách thay đổi các điều kiện sinh lý của cây như tăng tính thấm nước, tính thấm lọc, giảm áp lực tế bào xuống mức thấp v. IAA còn ngăn chặn và trì hoãn hiện tượng sinh lý của lá, thúc đẩy sự ra hoa, tạo quả, ra rễ, phân chia tế bào v.

Do đó, việc sinh tổng hợp IAA là hết sức quan trọng trong việc điều hòa sinh trưởng của cây. Với những tác dụng như vậy, IAA là chất được hướng đến tổng hợp để hỗ trợ sự sinh trưởng và phát triển của các loài cây lương thực trong ngành nông nghiệp, đặc biệt trong bối cảnh nhu cầu lương thực ngày càng gia tăng như hiện nay. Trong tự nhiên, IAA được tổng hợp bởi cả thực vật lẫn vi sinh vật vùng rễ của thực vật. Trong đó, Bacillus megaterium là vi khuẩn khá phổ biến trong vùng rễ của thực vật.

Bacillus megaterium đã được chứng minh là có khả năng sản sinh IAA với lượng lớn. Nó có hệ gen nhỏ và đã được giải trình tự, thời gian sinh trưởng và phát triển nhanh cộng với khả năng thao tác trên gen dễ dàng. megaterium là một loài vi khuẩn tiềm năng trong việc sản xuât IAA ứng dụng vào nông nghiệp". Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp IAA trên Bacillus cũng như các vi khuẩn Gram dương khác vẫn chưa được nghiên cứu kỹ càng.

Người ta mới chỉ tập trung làm rõ con đường sinh tổng hợp IAA ở thực vật và một số vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên, để có thể tối ưu hóa sự sản xuất IAA ở B. megaterium để ứng dụng, điều đầu tiên là hiểu rõ các con đường sinh tổng hợp IAA trên loài này. Vì những lý do 1 đó, tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu phân lập một số gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn Bacillus megaterium”.2 Mục đích, yêu cầu 1.1 Mục đích Nghiên cứu dự đoán các con sinh tổng hợp IAA có thể có trên chủng vi khuẩn B.

Phân lập các gen mã hóa cho enzyme quan trọng trong các con đường được dự đoán.2 Yêu cầu Dự đoán các con đường tiềm năng quan trọng sinh tổng hợp IAA có thể có trên vi khuẩn B. Phân lập thành công gen ysnE mã hóa cho enzyme tryptophan acetyltransferase, yclC mã hóa cho enzyme phenolic acid decarboxylase và gen 1TM7_03404 mã hóa cho enzyme phenylacetaldehyde dehydrogenase. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn Bacillus megaterium Vi khuẩn B. megaterium (gần đây đã được đổi tên thành Priestia megaterium) thuộc lớp Bacilli, họ Bacillaceae, chi Bacillus.

megaterium là vi khuẩn Gram dương, thuộc trực khuẩn, đa số là vi khuẩn hiếu khí, hình thành dạng bào tử, được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau (như đất, nước biển, trầm tích, ruộng lúa, mật ong, cá và thực phẩm khô). Có chiều dài tế bào lên đến 4 µm và đường kính 1,5 µm là một trong những vi khuẩn lớn nhất được biết đến. Nó có kích thước bộ gen khoảng 5,1 Mb, với hàm lượng G + C trung bình là 38,2%, có nhiều plasmid có các kích thước từ 56kb-174kb. Nhiệt độ phát triển trong khoảng 3°C - 45°C, nhiệt độ tối thích khoảng 30°C (Vary et al.

megaterium tạo ra các sản phẩm có các protein như penicilin acylase (được sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp (Martín 1995; Suga et al. 1990), các amylase khác nhau (được dùng để biến tính tinh bột trong ngành công nghiệp bánh), glucose dehydrogenase được sử dụng để tái tạo cofactor NADH/NADPH (Nicotinamid adenin dinucleotid), trong các phản ứng sinh hóa và xét nghiệm glucose trong máu). Hơn nữa, nó được sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, độc tố diệt nấm và oxetanocin, chất ức chế vi rút HIV (vi rút suy giảm miễn dịch ở người), vi rút viêm gan B và loét giác mạc ngứa sẩn đơn do vi rút mụn rộp (herpes simplex corneal ulcers).2 Một số con đường, các gen sinh tổng hợp IAA trên thực vật và vi khuẩn. Hai con đường sinh tổng hợp IAA chính được đề xuất ở thực vật và vi khuẩn là con đường với tiền chất tryptophan và con đường với các tiền chất khác.

Với con đường sinh tổng hợp IAA không phụ thuộc tryptophan, còn chưa được biết đến 3 nhiều, các tiền chất được dự đoán có thể là indole-3-glycerol phosphate hoặc indole (Idris et al. 2007; Mano and Nemoto 2012). Với tiền chất là tryptophan có bốn con đường sinh tổng hợp IAA trên thực vật và vi khuẩn đã được các nhà khoa học đề xuất: con đường indole-3-pyruvic acid (IPyA), indole-3-acetaminde (IAM), indole-3-acetonitrile (IAN), tryptamine (TAM). (Duca et al.

Con đường indole-3-pyruvic acid. Ký hiệu: trp – tryptophan, IPyA – indole-3-pyruvic acid, IAAld – indole-3-acetaldehyde (Duca et al. 2014b) Con đường IPyA được cho là tồn tại ở thực vật, vi khuẩn có lợi và có hại. Các nhà khoa học đã chứng minh, khi con đường này bị bất hoạt quá trình sinh tổng hợp IAA bị giảm đi 90% ở loài Azospirillum Brasilense, Enterobacter cloacae , và Pseudomonas putida (Nascimento et al.

Do đó, con đường IPyA là con đường rất quan trọng trong quá trình tổng hợp IAA với tiền chất là tryptophan. Tuy nhiên, các gen mã hóa trên vi khuẩn chịu trách nhiệm cho bước oxy hóa aldehyde của con đường IPyA vẫn chưa được biết đến nhiều. Sự có mặt của con đường IPyA trên thực vật và vi khuẩn được đề xuất dựa trên việc xác định các chất trung gian tương ứng. Ban đầu, tryptophan sẽ bị khử thành indole-3-pyruvic acid (IPyA) bởi enzyme aminotransferase.

Tiếp sau đó, một enzyme decarboxylase chuyển hóa IPyA tạo ra indole-3-acetaldehyde. Cuối cùng, indole-3-acetaldehyde bị oxy hóa bởi enzyme aldehyde dehydrogenase hoặc enzyme oxidase (Hình 2-1). Gen chịu trách nhiệm cho giai đoạn oxy hóa aldehyde của con đường IPyA vẫn chưa được biết đến nhiều. Các gen indole-3-acetaldehyde dehydrogenase phụ thuộc vào 4 NADP đã xác định được trong bộ gen của Bacillus amyloliquefaciens FXB42 và Bacillus subtilis 168.

Tuy nhiên, khi cắt gen này ở B.amyloliquefaciens FXB424 việc tổng hợp IAA lại không ảnh hưởng nhiều, do đó gen này không đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp IAA. Xie và các cộng sự (2005) đã phát hiện một gen aldA trong Azospirillum brasilense Yu62 có sự tương đồng lên tới 80% so với aldehyde dehydrogenase (Xie et al. Khi chèn gen Tn5 vào vị trí gen aldA kết quả thấy lượng IAA được sản xuất ít hơn khi có gen aldA. Điều này chứng tỏ rằng, gen aldA này có tham gia xúc tác bước oxy hóa andehyde trong con đường IPyA.

Một con đường tắt được đề xuất, trong đó IAAld được tạo thành trực tiếp từ tryptophan bởi enzyme monooxygenase (Hình 2-1). Đây được gọi là con đường oxy hóa chuỗi bên tryptophan (TSO). Con đường TSO đã được đề xuất ở vi khuẩn như Pseudomonas fluorescens HP72, P. Fluorescens CHA0 và P.

Một decarboxylase chuyển indole-3-pyruvic acid thành indole-3-acetylaldehyde, đã được xác định và đặc trưng trong Az. brasilense, Enterobacter cloacae, và Pseudomonas putida. Indole-3-pyruvate decarboxylase (IPDC) là gen mã hóa enzyme chính trong con đường IPyA được gen ipdC mã hóa (Lebuhn and Hartmann 1993; Duca et al. 2014a; Mano and Nemoto 2012).

Ngoài ra, một con đường nhánh mới được đề xuất từ indole-3-pyruvate được chuyển hóa trực tiếp thành IAA. Nhưng con đường này chỉ tồn tại trên một nhóm vi khuẩn. Con đường indole-3-acetamide. Ký hiệu: IAM – indole-3-acetamide, IAN – indole-3-acetinitrile, IAOx – indole-3-acetaldoxime (Duca et al.

Con đường IAM là con đường đã được nghiên cứu rõ ràng nhất ở vi khuẩn (Hình 2-2). Con đường hai bước này được xúc tác bởi các enzyme tryptophan-2- monooxygenase (IaaM) và IAM hydrolase (IaaH), được mã hóa bởi các gen iaaM và iaaH. Các gen tương đồng với gen iaaM đã được phát hiện trên một số vi khuẩn khác, trình tự mã hóa enzyme của chúng được chia làm hai nhóm. Trình tự mã hóa cho enzyme nhóm I tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA, mã hóa cho các enzyme chuyển hóa tryptophan, chẳng hạn như mã hóa tryptophan 2- monooxygenases trong các cây như Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas Syringae Pv.

Savastanoi, Pantoea agglomerans và Dickeya dadantii. Trình tự gen mã hóa enzyme nhóm II không tham gia vào con đường sinh tổng hợp IAA mà nhóm này tham gia xúc tác cho phản ứng phân hủy lysine trên P. Các enzyme nitril hydratase liên kết IAN và IAM con đường bằng cách xúc tác quá trình hydrat hóa indole-3-acetonitril thành IAM, sau đó được chuyển thành sản phẩm cuối cùng IAA bởi indoleacetamide hydrolase /amidase. Nitrile hydratase đã được phát hiện ở nhiều vi khuẩn khác nhau và nhiều nghiên cứu đã khám phá sự tham gia của enzyme này trong sinh tổng hợp IAA.

Enzyme nitrile hydratase có thể hoạt động 6 trên nhiều chất nền nitrile khác nhau bao gồm nitril béo, thơm và dị vòng, chuyển đổi chúng thành các amide tương ứng. Các gen mã hóa amidase thường nằm liền kề với các gen mã hóa nitrile hydratase vì chúng chuyển đổi sản phẩm amide của nitrile hydratase thành axit cacboxylic tương ứng. Các gen mã hóa amidase dự đoán được phát hiện trong vùng lân cận của các gen nitrile hydratase trong bộ gen của Pseudomonas sp. UW4, Bacillus sp.rhodochrous J1, Rhodococcus sp.

N- 774, Pseudomonas chlororaphis B23, Brevibacter sp. japonicum USDA 110 và Ruegeria pomeroya DSS-3 (Duca et al. 2014a; Zdunek-Zastocka 2008; Nascimento et al. 2020a; Lebuhn and Hartmann 1993; Zhao 2010; Won et al.

Con đường indole-3-acetonitrile/indole-3-acetaldoxime. Trp – tryptophan, IAOx - indole-3-acetaldoxime, IAN – indole-3-acetinitrile (Duca et al. Con đường IAOx/IAN sinh tổng hợp IAA vẫn chưa được nghiên cứu nhiều trên thực vật cũng như vi khuẩn. Ở con đường này, đầu tiên tryptophan được chuyển hóa thành indole-3-acetaldoxime (hình 2-3) có thể bởi enzyme oxy hóa, tuy nhiên enzyme này giờ vẫn chưa được làm rõ trên vi khuẩn.

Trong bước thứ hai, indole-3- acetaldoxime chất trung gian được chuyển thành indole-3-acetonitril bởi enzyme acetaldoxime dehydratase. Các enzyme acetaldoxime dehydratase đã được xác định trong một số vi khuẩn và được mã hóa bởi các gen oxd. Các indole-3-acetonitrile được chuyển hóa thành IAA bởi một enzyme nitrilase trong một bước duy nhất hoặc bằng một nitrile hydratase và một amidase trong con đường hai bước. Ở vi khuẩn, các enzyme nitrilase có thể có vai trò trong tổng hợp hormone, đồng hóa chất dinh dưỡng và giải độc nitriles ngoại sinh và nội sinh (Howden and Preston 2009).

Một 7 số nitrilase khác nhau đã được nghiên cứu cụ thể về khả năng chuyển đổi IAN thành IAA. Ở một số vi khuẩn, gen mã hóa cho enzyme nitrilase được tìm thấy gần acetaldoxime các gen dehydrat và enzym của chúng hoạt động được liên kết với nhau, đã được quan sát thấy ở Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Rhodococcus sp. AK32 và Vi khuẩn Corynebacterium sp.

C5 (Won et al. 2011b; Duca et al. 2014a; Zhao 2010; Xie et al.