Đặt vấn đề Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp lƣơng thực cho loài ngƣời và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lƣơng thực- thực phẩm- dƣợc phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô đƣợc chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau. Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc, và là cây lƣơng thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao. Năm 2012, tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là 48200 ha, ngô là 133700 ha; tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37400 ha, ngô là 52500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 30700 ha, ngô là 39300 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 30600 ha, ngô là 33700 ha [22].
Nƣớc ta có 75% diện tích là đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phƣơng nói riêng bị giảm. Trong những năm gần đây, hƣớng sản xuất ngô ở nƣớc ta là tăng cƣờng diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến. Các giống ngô nếp địa phƣơng có chất lƣợng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhƣng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần. Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống.
Trƣớc đây, công tác chọn giống truyền thống thƣờng tốn rất nhiều thời gian và công sức, nhất là đối với những tính trạng đa gen chịu nhiều ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng. Hiện nay, công nghệ sinh học đƣợc coi là phƣơng tiện hữu 2 hiệu để khắc phục những vấn đề khó khăn đó. Sự hiểu biết về phân tử DNA, RNA, protein, hay các hợp chất thứ cấp. có liên quan đến các đặc tính, tính trạng giúp cho ngƣời nghiên cứu chủ động lựa chọn kỹ thuật sinh học tác động vào chúng nhằm nhận dạng giống cây trồng theo mong muốn.
Chọn giống nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng (Molecular Assisted Selection- MAS) đang ngày càng đƣợc quan tâm vì phƣơng pháp này có thể rút ngắn đƣợc thời gian chọn lọc, thậm chí có thể chọn lọc sớm ở giai đoạn cây non. Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình trao đổi chất. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm. Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nƣớc khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu.
Anthocyanin đƣợc coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định hƣớng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang đƣợc quan tâm, trong đó có chỉ thị sắc tố anthocyanin. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng”. Mục tiêu của đề tài Xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa anthocyanin và khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng.
Xác định và phân lập đƣợc một số gen điều hòa (gen TF) quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng. Đánh giá đƣợc mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin của ngô nếp địa phƣơng trong điều kiện hạn. 3 Những mục tiêu trên nhằm định hƣớng ứng dụng trong tuyển chọn và bảo tồn giống ngô nếp có chất lƣợng và khả năng chịu hạn cao. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu giai đoạn hạt nảy mầm và cây con thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh (hàm lƣợng đƣờng, hoạt độ amylase, chỉ số chịu hạn tƣơng đối.
Phân nhóm các giống ngô theo mức độ chịu hạn. - Xác định mối tƣơng quan giữa sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin và khả năng chịu hạn của ngô nếp địa phƣơng ở giai đoạn cây con. - Phân lập đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc mã hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn. - Sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR để phân tích, so sánh mức độ biểu hiện của gen B và Lc ở giai đoạn phiên mã của đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.
Những đóng góp mới của luận án - Xác định đƣợc mức độ tƣơng quan giữa hàm lƣợng anthocyanin với khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng, và hàm lƣợng anthocyanin đƣợc coi là một trong những chỉ thị sinh hóa hóa phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn. - Phân lập đƣợc 02 đoạn gen B và Lc mã hóa cho protein là nhân tố phiên mã điều hòa quá trình sinh tổng hợp anthocyanin. - Bƣớc đầu xác định đƣợc mức độ phiên mã của 02 gen B và Lc là một trong các chỉ thị ở mức độ phân tử cho khả năng chịu hạn giai đoạn cây ngô non. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai 4 trò của anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn.
- Cung cấp thông tin về hai gen điều hòa (nhân tố phiên mã) B và Lc thuộc họ bHLH tham gia sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn. - Tìm hiểu đƣợc cơ sở sinh học phân tử của khả năng chịu hạn ở cây ngô nếp địa phƣơng thông qua so sánh mức độ biểu hiện của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin. Ý nghĩa thực tiễn - Kết đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm và cây non đƣợc sử dụng làm cơ sở để đánh giá khả năng chịu hạn ở cây trồng. Trong đó, anthocyanin đƣợc xem là chất chỉ thị phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn.
- Sử dụng gen Lc của ngô nhƣ một gen chỉ thị mạnh mẽ để tăng tổng hợp anthocyanin nhằm tạo ra các loại thực phẩm vừa có lợi cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng, vừa có tiềm năng kinh tế cho ngƣời sản xuất, và vừa có lợi cho sự chống chịu hạn cho bản thân cây trồng. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về cây ngô Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Zea, họ Hoà thảo (Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales). Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô đƣợc phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa.
Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô đƣợc phân chia thành các thứ. Ngoài ra, ngô còn đƣợc phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trƣởng và thƣơng phẩm [11]. Cây ngô là một loại cây lƣơng thực đƣợc thuần canh tại khu vực Trung Mỹ và sau đó mở rộng ra khắp châu Mỹ, và trên toàn thế giới vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16 [186]. Tuy nhiên dạng ngô dại hiện không còn tồn tại nên có nhiều giả thuyết về nguồn gốc di truyền của cây ngô.
Song điều quan trọng nhất là hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nƣớc [11]. Thân cây ngô trông tƣơng tự nhƣ thân cây của các loài hòa thảo. Ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm và rộng 5-10 cm; thân cây thẳng, thông thƣờng cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Dƣới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp.
Khi còn non chúng dài ra khoảng 3 cm mỗi ngày. Từ các đốt ở phía dƣới sinh ra một số rễ [11]. Thân cây ngô non tích lũy một chất kháng sinh mạnh là DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-on). DIMBOA là thành viên của nhóm các axít hydroxamic (còn gọi là benzoxazinoit) có khả năng phòng chống tự nhiên đối với một loạt các loài gây hại nhƣ côn trùng, nấm và vi khuẩn gây 6 bệnh.
Giống ngô đột biến (bx) thiếu DIMBOA rất dễ bị các loài rệp và nấm gây bệnh. Khi ngô trở nên già hơn thì hàm lƣợng DIMBOA cũng nhƣ khả năng đề kháng sâu bệnh cũng giảm đi [179], [187]. Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông đƣợc bao bọc trong một số lớp lá, và đƣợc các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô màu hung vàng từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài trông giống nhƣ một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng.
Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thƣờng ở họ Hòa thảo. Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tƣơng đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200- 400 hạt. Các hạt có màu nhƣ ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng.
Khi đƣợc nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [11]. Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bƣớu nhiễm sắc thể"- các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm.
Mỗi bƣớu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bƣớu này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [185].