Đặt vấn đề Hạn là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng và dẫn tới tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vƣợt quá tầm kiểm soát của con ngƣời. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan tới tính chịu hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và tăng sản lƣợng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã.
Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Do đó, việc nghiên cứu phân lập và đặc tính gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hƣớng triển vọng và nhận đƣợc sự quan tâm đặc biệt. Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn đã đƣợc xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác nhau. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật.
Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen. Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn mục tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen thực vật đã đƣợc một số phòng thí nghiệm quan tâm. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trƣờng nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nƣớc ngoài hoặc các gen đã đƣợc công bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới. Cho đến nay, chúng ta vẫn 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chƣa có một nghiên cứu cơ bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã.
, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật”. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF điều khiển tính chịu hạn từ lúa. - Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI- IF phân lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mô hình. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn của lúa Oryza sativa L.
nội dung chính: - Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF liên quan đến chống chịu điều kiện bất lợi ở lúa. - Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF. - Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực vật. - Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình.
Địa điểm nghiên cứu Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính: - Bộ môn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam). - Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ). 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng gen OsNLI-IF chƣa đƣợc xác định chức năng.
Gen OsNLI-IF đƣợc chứng minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và có khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc lá/ lúa). Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển bởi các promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều kiện stress (Lip9) đã đƣợc chuyển vào cây mô hình để nghiên cứu biểu hiện gen. Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai trò tăng cƣờng tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây chuyển gen. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu.
12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 1. Giới thiệu chung về hạn hán Nƣớc là thành phần cơ bản nhất của sự sống, tất cả mọi sinh vật đều cần có nƣớc để duy trì sự sống. Chính vì vậy, nguồn nƣớc trong môi trƣờng sống rất quan trọng đối với đời sống của sinh vật.
Đặc biệt đối với thực vật, nƣớc có vai trò sống còn, quyết định sự tồn tại và phát triển của thực vật. Nhu cầu về nƣớc của thực vật phụ thuộc vào từng loài và từng giai đoạn phát triển của chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn cụ thể, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Trong nông nghiệp, hạn hán đƣợc xác định khi đất không có đủ độ ẩm và lƣợng mƣa không đủ cung cấp cho mùa màng, làm cho cây trồng không đủ độ ẩm để duy trì sự tăng trƣởng và sản lƣợng trung bình.
Ảnh hƣởng của hạn hán trong nông nghiệp rất khó ƣớc lƣợng vì tính phức tạp trong sự tăng trƣởng cây trồng và khả năng xuất hiện của các nhân tố khác nhƣ sâu bọ, cỏ dại, đất kém màu mỡ và sự ô nhiễm môi trƣờng cũng ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và năng suất của cây trồng [20]. Các yếu tố gây hạn của môi trƣờng nhƣ thành phần thổ nhƣỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ, gió nóng… gây nên hiện tƣợng thiếu nƣớc của cây, nguyên nhân chính là do sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa tế bào và môi trƣờng, dẫn đến sự thiếu hụt nƣớc trong tế bào. Tùy theo mức độ, hạn đƣợc chia ra thành ba loại: hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện. Đối với mỗi loại sẽ gây ra những ảnh hƣởng khác nhau, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây trồng, mùa màng.
Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp Trong các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, hạn hán là nhân tố chính và phổ biến nhất gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp. Do biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu, hiện nay các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm khoảng 1% tổng diện tích đất nông nghiệp và đƣợc dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thế kỉ 21 [126]. Mức độ ảnh hƣởng của hạn hán trong nông nghiệp phụ thuộc vào tần suất, cƣờng độ, tính khắc nghiệt và tính nhạy cảm của đối tƣợng cây trồng. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với nông nghiệp có thể diễn ra theo chu kỳ hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất lƣợng sản phẩm, giảm năng suất, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do sâu bọ, tăng chi phí tƣới tiêu, dẫn tới làm mất sản lƣợng cây trồng và giảm thu nhập của ngƣời nông dân.
Tác động của hạn hán làm sản lƣợng lúa gạo tụt giảm; lƣợng gạo dự trữ thấp đã buộc các quốc gia xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới (trong đó có Việt Nam) phải áp dụng chính sách hạn chế xuất khẩu để đảm bảo an ninh lƣơng thực quốc gia, trong khi nhu cầu nhập khẩu gạo của các quốc gia khác (đặc biệt là Trung Quốc) tăng cao. Đây chính là nguyên nhân tạo ra cơn sốt gạo năm 2008, đẩy giá gạo lên mức cao kỷ lục mới (>1.000 USD/tấn) và gây ra những tác động tiêu cực đến đời sống kinh tế [3, 134]. Việt Nam với nền kinh tế chủ yếu dựa vào sản xuất nông nghiệp cũng là một trong số các quốc gia nằm trong vùng chịu ảnh hƣởng nặng nề của hiện tƣợng BĐKH. Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lƣợng lúa gạo hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nƣớc, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có xu hƣớng giảm dần, có thể giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070.
Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trƣờng thế giới do Việt Nam là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới. Chính vì vậy, các chính sách tăng trƣởng xanh và toàn diện trong ngành nông nghiệp để đối phó với hạn hán phải đƣợc chính phủ xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sự tham gia của tất cả các thành phần trong xã hội [135]. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật Môi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [38]. Hạn hán khi xảy ra sẽ gây ảnh hƣởng đầu tiên tới quá trình trao đổi nƣớc với môi trƣờng và quá trình kiểm soát hàm lƣợng nƣớc trong cơ thể của thực vật.
Đây là quá trình đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau nhƣ lƣợng nƣớc dự trữ trong 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mô, thế nƣớc của lá, khả năng hoạt động của khí khổng, tốc độ bay hơi nƣớc, nhiệt độ lá và tán lá. Khi tiếp xúc với hạn hán, thế nƣớc trong lá, hàm lƣợng nƣớc trong cơ thể, tốc độ thoát hơi nƣớc và độ dẫn của khí khổng đều bị giảm, trong khi nhiệt độ lá tăng lên.