ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời đại xã hội kinh tế phát triển, việc chăm sóc sức khoẻ ngày càng được mọi người chú trọng thông qua việc quan tâm đến chế độ ăn, và việc bổ sung các loại chất dinh dưỡng, vitamin, khoáng chất,…Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ cũng là một trong những lựa chọn ngày càng được ưa chuộng và phổ biến để giúp chúng ta bổ sung những chất cần thiết cho cơ thể, đặc biệt việc sử dụng các hormon nội sinh như Pregnenolon hay Dehydroepiandrosteron (DHEA),… Dehydropiandrosteron (DHEA) hay còn gọi là Prasteron là một chất thường có trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ với công dụng chính để bổ sung hormon cho cơ thể. Hiện nay trên thị trường các thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa DHEA thường được bào chế dưới dạng viên nén hoặc viên nang cứng với các hàm lượng khác nhau khác nhau như 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg,. đơn lẻ hoặc kết hợp với một số hợp chất khác [28], [29]. Tại Việt Nam, theo thông tư 43/2014/TT-BYT ngày 24 tháng 11 năm 2014 tại điều 5 “Các hoạt chất có tác dụng chính tạo nên công dụng của sản phẩm, mà các đơn vị kiểm nghiệm trong nước thực hiện kiểm nghiệm được thì phải được định lượng hoạt chất chính đó trong sản phẩm” [2].
Do đó, để kiểm soát chất lượng các sản phẩm chứa DHEA cần xây dựng một phương pháp để định lượng hoạt chất này trong các sản phẩm có công bố. Trên thế giới các nghiên cứu thường tập trung vào xác định nồng độ hormon này trong dịch sinh học hay các mẫu thịt, sữa,. hoặc với mục đích phát hiện chúng cùng với các hormon khác được được trộn vào các thực phẩm bổ sung cho các vận động viên, mà bị coi là doping. Các phương pháp thường dùng để xác định hormon trên là LC- MS/MS [8], [15], [16], [17], [24], [32], [33], GC-MS [7], [19], HPLC-UV [4], [12], [28], [29], [30],… Trong các nghiên cứu việc xác định hormon chủ yếu dùng phương pháp LC-MS/MS do có nhiều ưu điểm so với các phương pháp HPLC-UV hay GC-MS, vì đặc điểm độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Mặt khác nền mẫu TPBVSK lại chứa nhiều thành phần phức tạp. Hiện tại, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào xây dựng phương pháp định lượng DHEA trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, vì vậy với mong muốn xây dựng phương pháp định lượng để phục vụ cho việc kiểm soát các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa DHEA, đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng DHEA (Dehydroepiandrosteron) trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ bằng LC-MS/MS” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng DHEA (Dehydroepiandrosteron) trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Ứng dụng phương pháp để kiểm nghiệm một số mẫu thực phẩm chức năng có chứa Dehydroepiandrosteron trên thị trường.
Tổng quan về Dehydroepiandrosteron (DHEA) 1. Nguồn gốc và cấu trúc hoá học Dehydroepiandrosteron (5-androsten-3β-ol-17-on) hay còn được gọi là Prasteron [28], [29] là một tiền hormon steroid nội sinh có nguồn gốc từ cholesterol được hình thành thông qua một loạt các phản ứng dưới sự xúc tác monooxygenase thuộc cytochrom P450 và hydroxysteroid dehydrogenase. Sự tiết DHEA được kiểm soát bởi adrenocorticotrophin (ACTH) và các yếu tố tuyến yên khác [23], [26], [31]. Chức năng chủ yếu của nó như một chất trung gian trao đổi chất trong quá trình sinh tổng hợp steroid sinh dục androgen và estrogen [26], [28], [29].
Nồng độ Dehydroepiandrosteron giảm theo tuổi ở nam và nữ, đôi khi đạt giá trị thấp tới 10-20% so với nồng độ gặp ở người trẻ [15], [26].Cấu trúc hoá học của DHEA Tên IUPAC: (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-3-hydroxy-10,13-dimethyl- 1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-on [36]. Công thức phân tử: C19H28O2. Khối lượng phân tử: 288. Tính chất lý hoá DHEA tương đối bền dưới khi bảo quản ở nhiệt độ thường và tác động của nhiệt độ [25].
Độ tan: Độ tan của DHEA trong ethanol, DMSO, dimethyl formamid lần lượt là 10 mg/ml, 15 mg/ml, 25 mg/ml, ít tan trong nước độ tan 0,0635 mg/ml (ở 25°C) [37], [38]. Nhiệt độ nóng chảy: 140 -141°C Log P = 3,23 [36]. Dehydroepiandrosteron hòa tan trong H2SO4 tạo thành dung dịch màu vàng, khi thêm nước cẩn thận sẽ tạo thành vòng màu xanh tím và khi lắc sẽ tạo ra dung dịch màu xanh tím (hấp thụ tối đa ở bước sóng khoảng 560 nm), màu biến mất khi thêm nước. Đối với phản ứng màu với riêng H2SO4 và với sự có mặt của benzaldehyd hoặc furfural thì DHEA tạo ra phản ứng màu Pettenkofer-Schmidt rất mạnh (với axit furfural và sulfuric trong axit acetic) có thể được sử dụng để ước tính so màu.
3 Tạo ra màu xanh hơi vàng nhạt với độ đồng đều cao với dung dịch SbCl 2, trong anhydrit axit acetic-acetic băng (9:1, v/v). Trong phản ứng của Zimmermann với m-dinitrobenzen và 15% KOH trong rượu hoặc rượu-dioxan, DHEA nhanh chóng tạo ra màu đỏ đậm [13]. Tác dụng của DHEA 1.Chức năng sinh học DHEA trong cơ thể DHEA hoạt động như một tiền thân của hormon testosteron và estrogen [14]. Ở phụ nữ, sau thời kỳ mãn kinh, tất cả estrogen và gần như tất cả androgen được sản xuất cục bộ ở các mô ngoại vi từ DHEA gián tiếp tác động lên hình thành xương, mỡ, cơ, insulin và glucose sự trao đổi chất, làn da, ham muốn tình dục.
Ở nam giới sự đóng góp của DHEA cho androgen nhiều nhất ở tuyến tiền liệt, nơi có khoảng 50% androgen được sản xuất từ DHEA [22].Một số dạng dùng của DHEA và chỉ định DHEA thường được dùng dưới dạng thực phẩm chắc năng nhằm mục đích tăng cường các nội tiết tố giúp cải thiện các biểu hiện suy giảm nội tiết tố [26]. Nó còn có một số tác dụng khác như làm chậm quá trình lão hoá, tăng cơ bắp, cải thiện khả năng sinh sản hoặc điều trị các tình trạng bệnh lý như loãng xương và trầm cảm [18]. DHEA ngoài được sử dụng dưới dạng thực phẩm chức năng để bổ sung hormon, nó còn được gọi dưới tên Prasteron dùng để điều trị đau khi quan hệ tình dục do teo âm đạo và chuẩn bị cổ tử cung để sinh con. Nó được sử dụng đường uống, bôi lên da, đặt âm đạo hoặc tiêm bắp [39].
Ngoài ra còn dùng phối hợp với ibuprofen để điều trị giảm bùng phát tự miễn dịch ở bệnh nhân nữ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống hoạt động (SLE) [40].Một số tác dụng khác của DHEA Tác dụng lên bệnh béo phì: - DHEA có thể kiểm soát cân nặng [14] tác động lên quá trình chuyển hóa glucose ở mô hình động vật và làm giảm quá trình tạo glucose ở gan. Bằng cách sử dụng cơ chất thụ thể insulin 1 và 2 (IRS1 và IRS2) được kích thích bằng insulin chuột chúng ta đã thấy được tác dụng của DHEA đối với gan. DHEA làm tăng quá trình phosphoryl hóa Akt ở gan của C57BL6 IRS1 - và IRS2 - những con chuột bị thiếu hụt được nuôi bằng chế độ ăn nhiều chất béo (HFD), điều này cho thấy sự gia tăng. Tín hiệu Akt do DHEA tạo ra là đủ khi có IRS1 hoặc IRS2 [6].
Tác dụng lên hệ miễn dịch: - DHEA có nhiều mối liên hệ với nhiều khía cạnh của chức năng miễn dịch và thường được coi là có lợi và hỗ trợ khả năng miễn dịch [14], [22], mặc dù không phải là nguồn gốc duy nhất, tỷ lệ cortisol:DHEA tăng lên dường như là một yếu tố góp phần vào sự suy giảm chức năng miễn dịch liên quan đến tuổi tác được 4 gọi là lão hóa miễn dịch [10]. Vai trò của DHEA như một chất kháng glucocorticoid và tác dụng của nó đối với cả thụ thể androgen và estrogen. Với nghiên cứu bổ sung, DHEA có thể hữu ích như một liệu pháp điều trị, đặc biệt trong các bệnh có mức độ viêm cao hoặc khi việc sản xuất tuyến thượng thận bị thay đổi [10], [22]. Tác dụng lên hệ tim mạch - DHEA có tác dụng giảm cholesterol trong đại thực bào giảm xơ vữa động mạch ở thỏ [14].
- DHEA chống lại xơ vữa động mạch [14], [27], [34] bằng cách chống lại các cơ chế này, bao gồm điều chỉnh tình trạng lipid máu, bảo vệ tế bào nội mô (bao gồm đối phó với stress oxy hóa và phản ứng viêm của mạch máu nội mô, ức chế quá trình apoptosis của tế bào nội mô và tạo ra NO) và ức chế sự tăng sinh và di cư của các tế bào cơ trơn mạch máu. Kết quả là, DHEA có giá trị lớn trong việc ngăn ngừa xơ vữa động mạch và ức chế nó [27], [34]. - Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng DHEA có tác động đa dạng do đó mức độ giảm của DHEA có thể liên quan đến nhiều loại bệnh lý khác nhau, bao gồm bệnh tim mạch. Tại mức tế bào trong hệ thống tim mạch, DHEA dường như ảnh hưởng đến một loạt các con đường tín hiệu (các kênh ion, canxi tế bào nội) dẫn đến tác động chống tái cấu trúc và giãn mạch [27].
DHEA đã xuất hiện như một liệu pháp đầy hứa hẹn ở một số bệnh các dạng tăng huyết áp động mạch phổi như tăng huyết áp do thiếu oxy liên quan đến mãn tính bệnh phổi tắc nghẽn [27]. Quy định trên thế giới và Việt Nam về việc sử dụng DHEA Ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay vẫn chưa có một quy định nào liên quan đến việc yêu cầu ngưỡng hàm lượng được phép có trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ của DHEA. Tuy nhiên, theo quy định của uỷ ban Olympic, DHEA và một số các loại hormon sinh dục khác đã bị cấm cho các vận động viên thể thao khi chúng được coi là doping [8], [16], [17]. Các phương pháp nghiên cứu xác định DHEA 1.
Các nghiên cứu xác định DHEA đã được thực hiện trên thế giới Các phương pháp như HPLC-UV, LC-MS/MS, GC-MS thường được sử dụng để xác định DHEA trong các nền mẫu khác nhau như TPBVSK, dịch sinh học hay thực phẩm,… 5 Bảng 1. Các nghiên cứu xác định DHEA trên thế giới Nền LOD, STT Xử lý mẫu Điều kiện sắc kí TLTK mẫu LOQ - Nghiền 5 viên, mỗi viên - Phương pháp: - LOD = chứa 50 mg DHEA, trọng HPLC-UV 𝜆 = 210 50 ng/𝜇l lượng trung bình viên nm. - Pha động: 166,7 - 28,7 mg mẫu + 20 ml pha MeOH:H2O ng/𝜇l động (dung môi) → siêu (70:30, v/v). Viên âm 10 phút → pha loãng - Pha tĩnh: C18 [28] 1 nén thành 50 ml → Lọc dịch Eurospher-100, qua màng 0,45 µm.
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μl. - Phương pháp: - Pha - Lấy khối lượng mẫu HPLC-UV: 𝜆 =292 động A: tương đương 1 viên → nm. +LOQ= bình định mức 100 ml + 60 - Pha động: 3,28 ml ACN (hoặc MeOH) → +) Kênh (A): ng/µl Viên lắc cơ học trong 20 phút.
ACN–KH2PO4 (60 +LOD= [29] nén - Dịch chiết được pha : 40, v/v).