Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Thủy sản và các sản phẩm chế biến từ thủy sản là nguồn cung cấp protein và chất dinh dưỡng quan trọng trong khẩu phần ăn hàng ngày. Tuy nhiên, các loài cá thịt sẫm màu (đặc biệt là cá thuộc họ Scombroidae như cá ngừ, cá thu, cá nục, cá trích) chứa hàm lượng rất cao acid amin tự do L-histidine trong mô cơ. Sau khi đánh bắt, nếu điều kiện bảo quản nhiệt độ và vệ sinh không đảm bảo, các vi sinh vật nhiễm vào (điển hình như Proteus vulgaris, Vibrio alginolyticus, Enterobacteriaceae, Morganella morganii) sẽ phát triển và sinh tổng hợp enzyme L-histidine decarboxylase (HDC). Enzyme này xúc tác phản ứng khử carboxyl chuyển hóa histidine thành histamin. Quá trình tích tụ histamin diễn ra nhanh chóng ngay cả khi nguyên liệu chưa xuất hiện các dấu hiệu ôi thiu hay hư hỏng cảm quan.

Histamin là một amin sinh học có tính bền vững cao với nhiệt, không bị phân hủy hay phá hủy bởi các quá trình chế biến nhiệt thông thường như nấu chín, thanh trùng, sấy khô hoặc đóng hộp. Khi con người tiêu thụ thực phẩm chứa hàm lượng histamin vượt mức chuyển hóa của các enzyme nội sinh trong cơ thể (Diamine oxidase - DAO và Histamine N-methyltransferase - HNMT), histamin tự do sẽ xâm nhập vào tuần hoàn máu và gắn vào các thụ thể histamin (H1, H2, H3, H4). Tình trạng này gây ra ngộ độc cấp tính với các triệu chứng lâm sàng như đỏ bừng mặt, ngứa, phát ban, đau đầu, tụt huyết áp, nôn mửa, tiêu chảy, co thắt phế quản và trong trường hợp nặng có thể dẫn tới tử vong.

Nhằm kiểm soát nguy cơ ngộ độc, các tổ chức quốc tế đã ban hành quy chuẩn giới hạn hàm lượng histamin trong thủy sản:

  • Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA): Giới hạn 50 – 200 mg/kg; mức 200 – 500 ppm có thể gây hại cho sức khỏe.
  • Tổ chức Y tế Thế giới và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO/WHO): Ngưỡng an toàn tối đa là 200 mg/kg (200 ppm).
  • Ủy ban Châu Âu (EC): Giới hạn 100 – 200 mg/kg đối với sản phẩm từ cá có hàm lượng histidine cao; 200 – 400 mg/kg đối với sản phẩm thủy sản chế biến bằng phương pháp lên men enzym trong nước muối.
  • Tiêu chuẩn Codex Alimentarius: Không quá 10 mg/100 g cá (100 ppm) và không quá 40 mg/100 g nước mắm (400 ppm).

Tại Việt Nam, các phương pháp phân tích histamin phổ biến trước đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò tử ngoại/dãy diod quang (HPLC-UV/DAD) hoặc đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD). Tuy nhiên, chưa có công bố chính thức về quy trình phân tích histamin bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Đề tài "Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định histamin trong cá và sản phẩm từ cá bằng LC-MS/MS" được thực hiện nhằm đáp ứng yêu cầu nâng cao độ nhạy, độ chọn lọc trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm.

Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài gồm 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng LC-MS/MS.
  2. Áp dụng phương pháp trên để xác định histamin trong một số mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản trên thị trường.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng phân tích: Histamin ($C_5H_9N_3$, phân tử lượng 111,15 g/mol).
  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu trắng (cá không phát hiện histamin), mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn và mẫu thực phẩm thương phẩm.
  • Phạm vi nghiên cứu: Các mẫu cá tươi, cá đông lạnh, cá chế biến sẵn (cá sứa một nắng, cá khô, đồ hộp) và các loại nước mắm thương phẩm được lấy ngẫu nhiên tại các chợ và cửa hàng trên địa bàn thành phố Hà Nội; thực hiện tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc (Trường Đại học Dược Hà Nội) và Khoa Độc học và dị nguyên (Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia) trong năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và nguyên tắc phân tích

Histamin (2-(1H-Imidazol-4-yl)ethanamine) có hệ số phân bố octanol-nước $\log P = -0,7$, tính phân cực rất cao, chứa hai trung tâm base ($pK_{a1} = 5,8$ của vòng imidazol và $pK_{a2} = 9,68$ của nhóm amin bậc một). Phân tử không có nhóm mang màu hấp thụ mạnh trong vùng UV-Vis (210 – 700 nm) và không phát huỳnh quang tự nhiên.

Để phân tích histamin bằng LC-MS/MS với độ nhạy cao và giảm giới hạn phát hiện, nghiên cứu áp dụng phản ứng tạo dẫn xuất giữa nhóm amin bậc 1 của histamin với thuốc thử dansyl clorid (5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl chloride) theo tỷ lệ mol 1:1. Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm ($pH \approx 11$, tạo bởi hệ đệm $NaOH\ 2\text{M}$ và $NaHCO_3$ bão hòa) ở nhiệt độ $40^\circ\text{C}$ trong thời gian 20 phút. Thuốc thử dansyl clorid dư thừa được loại bỏ bằng phản ứng với dung dịch amoniac ($NH_4OH\ 25%$) trong 30 phút, tạo thành sản phẩm dẫn xuất histamin-dansyl clorid bền vững.

Quá trình thẩm định phương pháp phân tích được thực hiện dựa trên hướng dẫn của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống (AOAC International 2016) và quy định của Hội đồng Châu Âu (Quyết định Ủy ban EU 2021/808) về tiêu chuẩn nhận dạng chất bằng kỹ thuật khối phổ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Chuẩn bị và chiết tách mẫu (SLE):
    • Nền mẫu cá: Cân đồng nhất 5,0 g mẫu cá đã loại bỏ xương, chiết rắn - lỏng 2 lần với dung môi acid perchloric ($HClO_4\ 0,4\text{M}$), mỗi lần 20 mL, kết hợp lắc vortex 1 phút, lắc ngang 20 phút và ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. Gộp dịch chiết và định mức thành 50 mL bằng $HClO_4\ 0,4\text{M}$.
    • Nền mẫu nước mắm: Hút chính xác 100 µL nước mắm, định mức thành 10 mL bằng dung dịch $HClO_4\ 0,4\text{M}$.
  • Tạo dẫn xuất và hoàn nguyên: Hút 0,5 mL dịch chiết, bổ sung 100 µL $NaOH\ 2\text{M}$, 150 µL $NaHCO_3$ bão hòa và 1 mL dansyl clorid 0,1 mg/mL trong aceton. Hỗn hợp được ủ nhiệt ở $40^\circ\text{C}$ trong 20 phút, làm nguội 10 phút, thêm 50 µL $NH_4OH\ 25%$ phản ứng trong 30 phút, sau đó định mức thành 5 mL bằng hỗn hợp amoni acetat 0,1 M : acetonitril (1:1, v/v) và lọc qua màng 0,2 µm trước khi bơm vào hệ thống sắc ký.
  • Hệ thống thiết bị phân tích:
    • Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực: SCIEX Triple Quad 5500.
    • Cột sắc ký: Xbridge HILIC (150 mm × 4,6 mm; kích thước hạt 3,5 µm).
    • Pha động: Kênh A ($HCOOH\ 0,1%$ trong nước) và Kênh B (Acetonitril 100%), rửa giải theo chương trình gradient nồng độ trong 10 phút; tốc độ dòng 0,7 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 10 µL.
    • Chế độ khối phổ: Nguồn ion hóa phun sương điện tử chế độ ion dương (ESI+), kỹ thuật ghi phổ phản ứng chọn lọc đa kênh (MRM).

Nguồn dữ liệu

Dữ liệu nghiên cứu bao gồm: dữ liệu phổ khối của chất chuẩn histamin dihydrochloride (độ tinh khiết 99,4%, chuẩn đối chiếu LGC); tín hiệu sắc ký từ quá trình tối ưu hóa các điều kiện chiết tách, tạo dẫn xuất, thẩm định độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ đúng, độ lặp lại; và kết quả phân tích định lượng trên 21 mẫu thực phẩm thực tế mua tại các chợ và cửa hàng ở Hà Nội. Số liệu được thu thập qua phần mềm Analyst 1.6.3 và tổng hợp, xử lý thống kê bằng Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về histamin

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cấu trúc phân tử, tính chất vật lý, hóa học và con đường sinh học hình thành histamin trong mô cơ động vật thủy sản. Tác giả trình bày chi tiết hai cơ chế chuyển hóa chính của histamin trong cơ thể người: con đường methyl hóa nội sinh qua enzyme HNMT (tạo chất chuyển hóa acid N-methylimidazole acetic bài tiết qua nước tiểu) và con đường oxy hóa ngoại sinh qua enzyme DAO (tạo imidazol-4-yl-acetaldehyd).

Chương này cũng tổng hợp các quy định pháp lý quốc tế về ngưỡng dung nạp histamin, đồng thời phân tích ưu và nhược điểm của các kỹ thuật phân tích hiện hành:

Kỹ thuật Xử lý mẫu Detector LOQ Độ thu hồi (%) Đánh giá
HPLC Chiết methanol, làm sạch SPE FLD (dẫn xuất OPT) 5 mg/kg 90 – 110 Xử lý đơn giản, dẫn xuất nhanh nhưng sản phẩm kém bền
HPLC Chiết $HClO_4$, dùng chuẩn nội DAD (254 nm, dẫn xuất dansyl clorid) 10 mg/kg 97 – 103 Dùng chuẩn nội giảm sai số nhưng độ nhạy còn hạn chế
UHPLC Chiết $HClO_4\ 6%$ và nước DAD (210 nm, không dẫn xuất) 7,2 mg/kg 100 – 104 Phân tích trực tiếp, thân thiện môi trường nhưng chọn lọc vừa phải
RP-HPLC Chiết $HCl\ 0,3\text{M}$ UV (205 nm) 3 mg/kg 86 – 96,62 Tiết kiệm chi phí nhưng pH pha động ảnh hưởng lớn đến dẫn xuất
LC-MS/MS Chiết TCA 20%, chiết lỏng - lỏng toluen MS/MS (ESI+, SRM, dẫn xuất dansyl clorid) 5 mg/kg 82 – 118 Độ chọn lọc và độ nhạy cao nhưng xử lý mẫu nhiều bước phức tạp
UPLC-MS/MS Chiết methanol, pha loãng nước MS/MS (cột HILIC, ESI+, SRM, không dẫn xuất) Cá: 14,12 ng/mL
Mắm: 11,50 ng/mL		 98,5 – 102,5 Phân tích trực tiếp, độ nhạy cao, rút ngắn thời gian
HPLC-MS/MS Chiết TCA 20% MS/MS (cột ZIC-pHILIC, MRM) 0,052 mg/kg 101,5 – 103,9 Độ nhạy cao, không cần tinh chế phức tạp

Từ tổng quan tài liệu, tác giả khẳng định việc phát triển phương pháp LC-MS/MS kết hợp dẫn xuất hóa dansyl clorid trên cột tương tác thân nước (HILIC) là hướng đi phù hợp nhằm tăng khối lượng phân tử phân tích, tối ưu khả năng ion hóa và nâng cao độ nhạy vượt trội.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 thiết lập danh mục trang thiết bị, hóa chất, chất chuẩn và quy trình phân tích cụ thể. Nội dung tập trung vào:

  • Thiết kế thực nghiệm tối ưu hóa: Khảo sát lựa chọn pha tĩnh (Symmetry C18, ACQUITY UPLC BEH Amide, Xbridge HILIC); khảo sát dung môi chiết ($HClO_4$, $HCl$, $TCA$ cùng nồng độ 0,4 M); khảo sát số lần chiết (1, 2, 3, 4 lần); khảo sát thời gian dẫn xuất (20, 30, 45, 60 phút) và nhiệt độ dẫn xuất (30, 40, 50, 60°C).
  • Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nền (Matrix Effect - ME): So sánh hệ số góc đường chuẩn trên dung môi ($a_{\text{dung môi}}$) và đường chuẩn trên nền mẫu ($a_{\text{nền mẫu}}$) theo công thức: $$\text{ME}\ (%) = \frac{a_{\text{nền mẫu}} - a_{\text{dung môi}}}{a_{\text{dung môi}}} \times 100%$$
  • Tiêu chuẩn thẩm định (theo AOAC 2016 và EU 2021/808):
    • Độ phù hợp hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối $\text{RSD} \le 2%$ cho thời gian lưu và diện tích pic ($n = 6$).
    • Tính chọn lọc: Không có pic gây nhiễu tại thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu trắng; độ lệch thời gian lưu giữa mẫu thử và mẫu chuẩn $\le 0,1$ phút; số điểm nhận dạng ion $\text{IP} = 5$ (1 điểm cho tách LC, 1 điểm cho ion mẹ, 3 điểm cho 2 ion con); tỷ lệ ion xác nhận/ion định lượng nằm trong giới hạn sai lệch cho phép.
    • Giới hạn định lượng (LOQ) tại nồng độ có $S/N \ge 10$; giới hạn phát hiện tính theo công thức $\text{LOD} = \text{LOQ} / 3,3$.
    • Khoảng tuyến tính: Hệ số tương quan $R \ge 0,995$ ($R^2 \ge 0,99$), độ chệch các điểm nồng độ $\Delta_i \le \pm 15%$ (tại LOQ chấp nhận $\pm 20%$).
    • Độ đúng và độ lặp lại: Khảo sát tại 3 mức nồng độ ($n = 6$), so sánh với khoảng thu hồi và RSD chấp nhận theo nồng độ của AOAC.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tối ưu hóa, thẩm định và phân tích mẫu thực tế:

  • Tối ưu hóa điều kiện MS/MS và sắc ký:
    • Xác định ion mẹ của dẫn xuất histamin-dansyl clorid là $[M+H]^+ = 345\ m/z$. Hai ion con được phân mảnh tại buồng va chạm Q2 gồm: ion định lượng $m/z = 170$ (Collision Energy $\text{CE} = 30\ \text{eV}$, Collision Cell Exit Potential $\text{CXP} = 20\ \text{eV}$) và ion định tính $m/z = 154$ ($\text{CE} = 35\ \text{eV}$, $\text{CXP} = 20\ \text{eV}$).
    • Thông số nguồn ESI: Điện thế ion hóa $\text{IS} = 4500\ \text{V}$, nhiệt độ nguồn $\text{TEM} = 400^\circ\text{C}$, áp suất khí màng $\text{CUR} = 30\ \text{psi}$, áp suất khí va chạm $\text{CAD} = 7\ \text{psi}$, khí nguồn $\text{GS1} = \text{GS2} = 45\ \text{psi}$, thế cổng vào $\text{EP} = 10\ \text{eV}$.
    • Pha tĩnh: Cột Xbridge HILIC cho pic sắc ký đối xứng, sắc nét, không bị nhiễu nền và tín hiệu cao nhất (khắc phục hoàn toàn hiện tượng chẻ pic trên cột Symmetry C18 và hiện tượng tù pic trên cột BEH Amide).
Thời gian (phút) Pha động Kênh A (% $HCOOH\ 0,1%$) Pha động Kênh B (% Acetonitril)
0 10 90
4 10 90
6 99 1
7 99 1
8 10 90
10 10 90

  • Kết quả tối ưu hóa xử lý mẫu:

    • Dung môi chiết: $HClO_4\ 0,4\text{M}$ cho tín hiệu diện tích pic cao nhất và dịch chiết trong suốt do khả năng tủa protein triệt để hơn so với $HCl$ và $TCA$ (dịch chiết $HCl$ và $TCA$ bị đục).
    • Số lần chiết: Chiết 2 lần cho hiệu suất thu hồi tối ưu; chiết lần 3 và 4 không làm tăng đáng kể lượng chất nhưng hòa tan thêm tạp chất nền.
    • Phản ứng dẫn xuất: Đạt hiệu suất cao nhất ở nhiệt độ $40^\circ\text{C}$ trong thời gian 20 phút. Nhiệt độ trên $40^\circ\text{C}$ hoặc thời gian kéo dài làm giảm diện tích pic do dẫn xuất bị phân hủy.

  • Kết quả khảo sát ảnh hưởng nền (Matrix Effect):

Nền mẫu Phương trình đường chuẩn Hệ số xác định $R^2$ Hệ số góc ($a$) $\text{ME}\ (%)$ Đánh giá ảnh hưởng
Dung môi $y = 38205x - 16438$ 0,9999 38205 — —
Nền cá $y = 28683x - 9508,7$ 0,9979 28683 -24,9 Giảm tín hiệu ($<-20%$), bắt buộc định lượng bằng đường chuẩn nền mẫu trắng
Nền mắm $y = 42061x + 61485$ 0,9987 42147 +10,1 Tăng tín hiệu nhẹ ($<\pm 20%$), định lượng được bằng đường chuẩn dung môi
  • Kết quả thẩm định phương pháp:
    • Độ phù hợp hệ thống: Tiêm lặp 6 lần chuẩn 10 ppb cho thời gian lưu trung bình 3,01 phút ($\text{RSD} = 0,54%$) và diện tích pic trung bình $2,83 \times 10^5$ ($\text{RSD} = 1,67%$), đều đạt yêu cầu $\le 2%$.
    • Độ chọn lọc: Mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu ở thời gian lưu 3,01 phút. Tỷ số ion $154/170$ ở mẫu chuẩn là $3,76%$; độ lệch tỷ số ion ở mẫu cá là $-1,56%$ và ở mẫu mắm là $-6,57%$ (nằm trong giới hạn cho phép $\pm 50%$). Tổng số điểm nhận dạng $\text{IP} = 5$, đáp ứng tiêu chuẩn EU 2021/808.
    • LOD và LOQ:
      • Nền cá: $\text{LOQ} = 0,05\ \text{ppm}$ ($50\ \text{ppb}$, $S/N = 20,2$), $\text{LOD} = 0,015\ \text{ppm}$ ($15\ \text{ppb}$).
      • Nền mắm: $\text{LOQ} = 0,5\ \text{ppm}$ ($500\ \text{ppb}$, $S/N = 13,4$), $\text{LOD} = 0,15\ \text{ppm}$ ($150\ \text{ppb}$).
    • Khoảng tuyến tính:
      • Nền cá ($0,05 - 20\ \text{ppm}$): $y = 26407x - 6060,7$ ($R = 0,9996$), độ chệch $-5%$ đến $12,6%$.
      • Nền mắm ($0,5 - 200\ \text{ppm}$): $y = 40725x + 63811$ ($R = 0,9998$), độ chệch $-6%$ đến $7,2%$.
    • Độ đúng và độ lặp lại:
Nền mẫu Mức thêm chuẩn (ppm) Nồng độ tìm lại trung bình (ppm) Độ thu hồi trung bình (%) Giới hạn thu hồi AOAC (%) Độ lặp lại RSD (%) Giới hạn RSD AOAC (%)
Cá 0,05 0,0469 88,5 – 103 80 – 110 6,21 16,6
2,00 2,00 93,2 – 106 80 – 110 5,01 9,5
20,0 19,92 94,1 – 104 90 – 107 3,80 6,8
Nước mắm 0,50 0,479 89,3 – 103 80 – 110 5,79 11,8
20,0 19,7 93,9 – 104 90 – 107 3,47 6,8
200 199 95,6 – 104 95 – 105 3,02 4,8

Kết quả và đóng góp

Kết quả phân tích mẫu thực phẩm thực tế

Phương pháp đã được ứng dụng để định lượng histamin trên 21 mẫu thực phẩm thu thập tại các chợ và cửa hàng ở Hà Nội:

Nhóm mẫu Tên mẫu phân tích Khối lượng / Thể tích Độ pha loãng ($F$) Hàm lượng histamin (ppm) Giới hạn an toàn EC (ppm) Đánh giá
Thủy sản Cá mòi tươi 5,0303 g — 3,01 200 Đạt chuẩn
Cá thu đông lạnh 5,0116 g — 3,27 200 Đạt chuẩn
Cá sứa 1 nắng 5,2284 g 10 72,58 200 Đạt chuẩn
Cá thu ngừ tươi 5,1755 g 200 249,25 200 Vượt giới hạn
Cá nục khô 5,1055 g 10 106,75 200 Đạt chuẩn
Cá bạc má tươi 5,1041 g 10 62,60 200 Đạt chuẩn
Cá nục tươi 5,0593 g 200 225,33 200 Vượt giới hạn
Cá thu tươi 5,0256 g 10 140,28 200 Đạt chuẩn
Cá ngừ bào 5,1555 g — 1,73 200 Đạt chuẩn
Hộp cá nục xốt cà 5,1315 g 10 6,27 200 Đạt chuẩn
Hộp cá ngừ ngâm dầu 5,1690 g — 1,14 200 Đạt chuẩn
Nước mắm Mắm 1 100 µL 50 45,2 400 Đạt chuẩn
Mắm 2 100 µL 500 82,0 400 Đạt chuẩn
Mắm 3 100 µL 1000 885 400 Vượt giới hạn
Mắm 4 100 µL 1000 1050 400 Vượt giới hạn
Mắm 5 100 µL 1000 2160 400 Vượt giới hạn
Mắm 6 100 µL 1000 1910 400 Vượt giới hạn
Mắm 7 100 µL 1000 1290 400 Vượt giới hạn
Mắm 8 100 µL 1000 1260 400 Vượt giới hạn
Mắm 9 100 µL 1000 1800 400 Vượt giới hạn
Mắm 10 100 µL 50 61,5 400 Đạt chuẩn

Kết quả cho thấy:

  • Đối với mẫu cá: 2/11 mẫu ($18,18%$) vượt ngưỡng quy định 200 ppm của Ủy ban Châu Âu gồm cá thu ngừ tươi (249,25 ppm) và cá nục tươi (225,33 ppm). Mẫu cá thu tươi có hàm lượng tương đối cao (140,28 ppm). Các mẫu đồ hộp và cá đông lạnh duy trì hàm lượng histamin rất thấp ($1,14 - 6,27\ \text{ppm}$).
  • Đối với nước mắm: 7/10 mẫu ($70%$) có hàm lượng histamin vượt giới hạn an toàn 400 ppm của EC, trong đó mẫu Mắm 5 có hàm lượng cao nhất lên tới 2160 ppm.

Đóng góp của đề tài

  1. Đóng góp về phương pháp luận phân tích: Đã xây dựng thành công quy trình phân tích định lượng histamin bằng LC-MS/MS sau khi dẫn xuất với dansyl clorid trên cột tách HILIC. Quy trình đạt độ nhạy rất cao ($\text{LOQ} = 0,05\ \text{ppm}$ trên cá và $0,5\ \text{ppm}$ trên nước mắm), thấp hơn đáng kể so với các phương pháp HPLC-DAD, HPLC-FLD và LC-MS/MS thông thường đã công bố trước đây.
  2. Khảo sát hiệu ứng nền: Định lượng chính xác mức độ ảnh hưởng nền trên 2 nền mẫu đặc trưng, chứng minh nền cá gây mất tín hiệu ion âm ($-24,9%$) đòi hỏi phải dùng đường chuẩn ma trận (matrix-matched calibration curve), trong khi nền mắm ($+10,1%$) có thể sử dụng đường chuẩn dung môi.
  3. Cảnh báo an toàn thực phẩm: Dữ liệu phân tích thực tế chỉ ra thực trạng đáng báo động về nguy cơ nhiễm histamin cao ở các loại cá tươi sẫm màu và nước mắm truyền thống lưu thông trên thị trường Hà Nội, cung cấp cơ sở khoa học phục vụ công tác thanh kiểm tra an toàn thực phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Quy trình phân tích là phương pháp gián tiếp, bắt buộc phải trải qua bước tạo dẫn xuất với dansyl clorid kéo dài khoảng 50 phút (20 phút ủ nhiệt và 30 phút khóa thuốc thử dư), làm tăng các bước thao tác trong phòng thí nghiệm.
  • Nền mẫu cá bị ảnh hưởng nền âm đáng kể ($-24,9%$), đòi hỏi phòng kiểm nghiệm phải chuẩn bị mẫu trắng cá không chứa histamin để lập đường chuẩn nền, gây khó khăn cho việc phân tích nhanh quy mô lớn nếu không có sẵn mẫu trắng đồng nhất.
  • Số lượng mẫu khảo sát thực tế còn hạn chế (11 mẫu cá và 10 mẫu nước mắm) trên địa bàn thành phố Hà Nội, chưa phản ánh đầy đủ bức tranh chất lượng thủy sản ở các vùng miền khác.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích trực tiếp histamin không qua dẫn xuất hoặc sử dụng chuẩn nội đồng vị đánh dấu ($^{13}C$ hoặc đồng vị Deuterium như Histamine-$d_4$) nhằm triệt tiêu hoàn toàn hiệu ứng nền và rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu.
  • Mở rộng thẩm định và áp dụng phương pháp trên các nền mẫu thực phẩm giàu protein hoặc lên men khác như tôm, cua, mực, phô mai và rượu vang.
  • Mở rộng quy mô khảo sát trên chuỗi cung ứng thủy sản từ tàu đánh bắt, cảng cá, cơ sở bảo quản đông lạnh đến các nhà máy chế biến nước mắm truyền thống trên cả nước.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Cán bộ kiểm nghiệm thực phẩm và độc chất: Cung cấp thông số vận hành chi tiết trên thiết bị khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS (các mảnh ion $345 \rightarrow 170$ và $345 \rightarrow 154$, năng lượng CE, CXP, thông số nguồn ESI) và quy trình chiết mẫu SLE bằng $HClO_4\ 0,4\text{M}$ có độ thu hồi cao ($88,5 - 104%$).
  • Sinh viên và học viên ngành Dược học, Hóa phân tích, Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm: Là tài liệu mẫu về quy trình thẩm định phương pháp phân tích sắc ký - khối phổ theo tiêu chuẩn quốc tế AOAC 2016 và EU 2021/808 (tính điểm nhận dạng IP, đánh giá Matrix Effect, LOD/LOQ, độ đúng, độ lặp lại).
  • Doanh nghiệp chế biến thủy sản và sản xuất nước mắm: Cung cấp số liệu cảnh báo về sự hình thành histamin trong nguyên liệu cá tươi và quá trình lên men nước mắm, giúp doanh nghiệp hoàn thiện quy trình kiểm soát chất lượng (HACCP), hạ nhiệt độ bảo quản cá ngay sau đánh bắt nhằm giảm thiểu tích tụ histamin.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn cột Xbridge HILIC thay vì cột pha đảo C18 thông thường?

Trong giai đoạn khảo sát tối ưu hóa pha tĩnh, tác giả đã thử nghiệm 3 loại cột: Symmetry C18, ACQUITY UPLC BEH Amide và Xbridge HILIC. Kết quả sắc ký đồ cho thấy: trên cột C18, pic sắc ký của dẫn xuất histamin-dansyl clorid bị hiện tượng chẻ pic; trên cột BEH Amide, pic sắc ký không cân xứng và đỉnh pic bị tù. Cột Xbridge HILIC cho pic sắc ký cân xứng, sắc nét, không có nhiễu nền và cường độ tín hiệu cao nhất, do đó được lựa chọn làm pha tĩnh chuẩn cho quy trình.

2. Dung môi và số lần chiết nào được chứng minh là tối ưu nhất để tách histamin từ mẫu cá?

Dung môi acid perchloric ($HClO_4\ 0,4\text{M}$) chiết 2 lần là điều kiện tối ưu nhất. $HClO_4$ là acid vô cơ mạnh giúp chuyển histamin về dạng ion phân cực tan tốt vào dịch chiết, đồng thời tủa protein triệt để giúp dịch chiết trong suốt (trong khi chiết bằng $HCl$ hoặc $TCA$ dịch chiết vẫn bị đục do protein chưa kết tủa hoàn toàn). Chiết 2 lần cho hiệu suất thu hồi tối đa; chiết 3 hoặc 4 lần không làm tăng đáng kể lượng histamin thu được nhưng lại hòa tan thêm các tạp chất cản trở từ nền mẫu.

3. Hiệu ứng nền mẫu (Matrix Effect) ảnh hưởng thế nào đến phép đo và tác giả giải quyết bằng cách nào?

Kết quả khảo sát hệ số góc đường chuẩn cho thấy:

  • Trên nền cá: $\text{ME} = -24,9%$ (hiệu ứng nền âm, làm suy giảm tín hiệu ion phân tích vượt quá giới hạn $\pm 20%$ của AOAC). Tác giả giải quyết bằng cách bắt buộc sử dụng đường chuẩn pha trên nền mẫu trắng (matrix-matched curve) để định lượng.
  • Trên nền nước mắm: $\text{ME} = +10,1%$ (hiệu ứng nền dương nhẹ, làm tăng tín hiệu nhưng nằm trong giới hạn cho phép $\pm 20%$). Do đó, nền mắm có thể sử dụng trực tiếp đường chuẩn pha trong dung môi để tính toán hàm lượng.

4. Giới hạn định lượng (LOQ) và độ thu hồi của phương pháp này đạt bao nhiêu?

Phương pháp đạt giới hạn định lượng $\text{LOQ} = 0,05\ \text{ppm}$ ($50\ \text{ppb}$) trên nền mẫu cá và $\text{LOQ} = 0,5\ \text{ppm}$ ($500\ \text{ppb}$) trên nền mẫu nước mắm. Độ thu hồi trên nền cá tại 3 mức nồng độ (0,05; 2; 20 ppm) đạt từ $88,5%$ đến $103%$ với $\text{RSD} = 3,80 - 6,21%$. Độ thu hồi trên nền nước mắm tại 3 mức nồng độ (0,5; 20; 200 ppm) đạt từ $89,3%$ đến $104%$ với $\text{RSD} = 3,02 - 5,79%$, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu của AOAC 2016.

5. Thực trạng dư lượng histamin trên các mẫu thực phẩm thương phẩm tại Hà Nội ra sao?

Khảo sát 21 mẫu thực tế cho thấy nguy cơ nhiễm độc histamin tập trung chủ yếu ở cá tươi sẫm màu và nước mắm truyền thống. Cụ thể, $2/11$ mẫu cá vượt giới hạn an toàn 200 ppm của EC là cá thu ngừ tươi (249,25 ppm) và cá nục tươi (225,33 ppm). Đáng lưu ý, có tới $7/10$ mẫu nước mắm vượt giới hạn an toàn 400 ppm của EC, với hàm lượng dao động từ 885 ppm đến 2160 ppm. Ngược lại, các mẫu cá hộp và cá ngừ đông lạnh đều có hàm lượng rất an toàn ($1,14 - 6,27\ \text{ppm}$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp xác định histamin trong cá và nước mắm bằng kỹ thuật LC-MS/MS sau khi dẫn xuất với dansyl clorid trên cột Xbridge HILIC. Phương pháp đạt độ chọn lọc cao với 5 điểm nhận dạng IP, khoảng tuyến tính rộng, độ thu hồi tốt ($88,5 - 104%$) và giới hạn định lượng vượt trội ($0,05\ \text{ppm}$ trên cá và $0,5\ \text{ppm}$ trên mắm) theo tiêu chuẩn AOAC 2016 và EU 2021/808. Kết quả áp dụng thực tế trên 21 mẫu tại Hà Nội đã phát hiện tỷ lệ vượt ngưỡng an toàn cao ở cá tươi sẫm màu ($18,18%$) và nước mắm ($70%$), cung cấp dữ liệu khoa học tin cậy phục vụ công tác kiểm nghiệm và quản lý an toàn thực phẩm.