ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn dây củ tròn có nguồn gốc chủ yếu từ phía bắc Thái Lan, Myanmar. Theo y học cổ truyền Thái Lan, từ lâu rễ củ SDCT đã được sử dụng với mục đích làm đẹp, trẻ hóa cho nữ giới [26]. Ngày nay, rễ củ SDCT đã được báo cáo có tác dụng hướng estrogen mạnh trong các thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng. Ngoài ra, rễ củ SDCT còn tác dụng chống loãng xương, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống lão hóa [43], [15], [36].
Thành phần hóa học của rễ củ SDCT được xác định chứa các nhóm chất isoflavonoid, chromen, coumestan, tinh dầu, tinh bột [14], [10]. Các phytoesstrogen là thành phần hóa học chính mang lại tác dụng estrogen nổi bật trong rễ củ SDCT. Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã phát hiện ít nhất 17 hợp chất phytoestrogen có trong rễ của sắn dây củ tròn, trong đó chứa 10 isoflavonoid với tác dụng estrogen nổi trội. Daidzein là 1 trong 10 isoflavonoid đó, cho thấy tác dụng estrogen đáng kể.
Daidzein là dạng aglycon của daidzin, các dạng aglycon hoạt tính estrogen cao hơn đáng kể so với dạng glycosid [32]. Hiện nay, điều chế cao dược liệu với hàm lượng hoạt chất cao đang là xu hướng phát triển của dược phẩm. Trong quá trình chế biến tạo cao, nhiệt độ xử lý dược liệu hay phương pháp hỏa chế là một trong các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến thành phần hóa học và có thể dẫn đến sự thay đổi về tác dụng của vị thuốc. Do đó, tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ và sử dụng một cách hợp lý với từng dược liệu cụ thể là yếu tố quan trọng có thể làm tăng tác dụng của vị thuốc.
Với các lý do nêu trên, đề tài “Định lượng daizein bằng HPLC trong dịch chiết sắn dây củ tròn, ứng dụng tối ưu hóa phương pháp chế biến dược liệu” được thực hiện với 4 mục tiêu: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng daidzein trong dịch chiết rễ củ SDCT bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xử lý dược liệu và điều kiện chiết xuất tới hàm lượng daidzein trong dịch chiết rễ củ SDCT. Điều chế cao đặc rễ củ SDCT theo các thông số quy trình đã khảo sát.
Khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc rễ củ SDCT điều chế được. Tổng quan về cây Sắn dây củ tròn 1. Tên khoa học và vị trí phân loại Tên khoa học: Pueraria candollei var. mirifica (Airy Shaw & Suvat.
Tên Việt Nam hay dùng: SDCT, Sâm tố nữ. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009), cây SDCT thuộc chi Sắn dây (Pueraria), họ Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), lớp Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae). Phân bố SDCT phân bố chủ yếu trong các khu rừng lá rụng ở độ cao 300–800 m phía bắc, tây và đông bắc Thái Lan, có thể cả ở Myanmar [26]. SDCT phân bố ở các tỉnh ở Việt Nam như Ba Vì, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang và một số huyện miền núi của Thanh Hóa và Nghệ An [6].
Đặc điểm thực vật Cây dây leo bằng thân quấn. Thân tròn, màu nâu, thân non có lông trắng mịn phủ ngoài, già nhẵn có khía. Rễ phình thành củ, 20 x 30 cm, vỏ nâu nhạt, mặt cắt ngang củ xốp, màu trắng, hình nan hoa. Lá kép có 3 lá chét, mặt trên lá có một lớp lông tơ xanh đậm, mặt dưới có lông ngắn màu xám, gân lá hình lông chim.
Lá chét giữa hình thoi, đầu nhọn, hai lá chét bên mọc đối, hình trứng ngược. Lá kèm của lá chét dạng sợi; hai lá chét bên mỗi lá một lá kèm, lá chét giữa có hai lá kèm. Cụm hoa chùm tán, mọc ở đầu cành hoặc nách lá. Hoa màu xanh tím, dài khoảng 10mm, không đều, lưỡng tính, mẫu 5, tiền khai hoa cờ.
Bộ nhị mười xếp thành hai bó (9 nhị hàn liền với nhau 1 nhị rời ra). Bộ nhụy dài 10 mm, bầu trên chứa một lá noãn mang nhiều noãn, nhiều ô, đính moãn mép. Quả loại đậu, dẹt, dài 5-7 cm, rộng 6-7 mm, khi non màu xanh, già màu nâu. Quả mang 2-5 hạt, có vách ngăn giữa các hạt.
Cây thường ra hoa từ tháng 2-3 và kết quả vào tháng 4 [26], [6]. Tổng quan về rễ củ Sắn dây củ tròn 1. Thành phần hóa học Rễ củ SDCT chứa các phytoestrogen. Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã phát hiện ít nhất 17 hợp chất phytoestrogen có trong rễ của SDCT, có thể chia thành 3 nhóm: 10 isoflavonoid (daidzin, daidzein, genistin, genistein, kwakhurin, kwakhurin hydrat, tuberosin, puerazin, mirificin, puemiricarpen); 4 coumestan (coumestrol, mirificoumestran, mirificoumestan glycol, mirificoumestan hydrate); 3 2 chromen: miroestrol, deoxymiroestrol, isomiroestrol).
Tất cả các phytoestrogen trên đều có cấu trúc tương tự 17β – estradiol (Hình 1. Công thức cấu tạo của 17β – estradiol 1. Isoflavonoid Mười isoflavonoid đã được phân lập và phát hiện từ rễ củ SDCT và được thể hiện trong bảng 1. Một số hợp chất isoflavonoid được phân lập từ rễ củ SDCT STT Tên thành phần Công thức hóa học TLTK 1 Daidzein [16], [19] 2 Genistein [16], [19] 3 Puerarin [19], [13] 4 Daidzin [16], [19] 5 Genistin [16], [19] 3 6 Tuberosin [26] 7 Mirificin [19] 8 Kwakhurin [41], [35] 9 Kwakhurin hydrat [21] 10 Puemiricarpen [11] 1.
Chromen Rễ củ SDCT có chứa các cheromen: miroestrol [24], deoxymiroestrol [48], isomiroestrol [24], (+)-7-O-Methylisomiroestrol [47]. Miroestrol Deoxymiroestrol 4 Isomiroestrol (+) -7- O - Methylisomiroestrol Hình 1. Công thức cấu tạo của chromen trong rễ củ SDCT 1. Coumestan Dịch chiết MeOH của rễ củ SDCT có chứa: mirificoumestan (3,9-dihydroxy-8- methoxy-7 (3,3-dimethylallyl)-coumestan), mirificoumestan hydrat (3,9-dihydroxy-8- methoxy-7 (3-hydroxy-3-methylbutyl)-coumestan), mirificoumestan glycol (3,9- dihydroxy-8 metoxy-7-(2,3-dihydroxy-3-methylbutyl)-coumestan) và coumestrol (3,9 dihydroxycoumestan) [20].
Công thức cấu tạo của coumestan trong rễ củ SDCT 1. Các thành phần khác Các thành phần của tinh dầu từ rễ củ SDCT được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí mao quản - khối phổ (GC - MS), đã phát hiện 82 hợp chất trong rễ củ SDCT. Thành phần chính là 2-pentylfuran (8.1%) và 2-cis-9-octadecenyloxyethanol (3. Ngoài ra trong rễ củ SDCT còn chứa một lượng lớn tinh bột, nhựa, đường, polysaccharid [25].
Tác dụng sinh học 1. Tác dụng estrogen Sookvanichsilp N đã nghiên cứu hoạt động estrogen bằng cách sử dụng mô hình tăng sinh tế bào tử cung và tế bào MCF-7 của cao từ rễ củ SDCT. Cao rễ củ SDCT bao 5 gồm: cao chiết EtOH (PM1), cao chiết nước (PM2), cao chiết dichloromethan (M3) và chứng dương 17- estradiol liều 0,1 - 100 ug/kg/ngày. Trong 3 loại cao chiết, PM3 thể hiện hoạt tính estrogen mạnh nhất [38].
Miroestrol được phân lập từ rễ của SDCT có tác dụng ngăn ngừa sự hình thành phôi nang, tăng trọng lượng tử cung, âm đạo ở chuột cống cái bình thưởng và tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo ở chuột cắt buồng trứng [42], [9]. Hiệu lực tiêm dưới da của miroestrol bằng 0,7 lần estradiol và mạnh hơn 2 lần estron [22]. Cherdshewasart W và cộng sự đã tiến hành đánh giá hoạt tính estrogen của 25 giống cây thu hái tại 76 tỉnh thuộc 5 vùng của Thái Lan. Chuột đã cắt bỏ buồng trứng dùng bột rễ củ trong 14 ngày liên tiếp với các liều lần lượt là 10, 100 và 1.000 mg/kg và được so sánh với phương pháp lô chuột điều trị hàng ngày bằng 2 mg/kg 17β-estradiol.
Phương pháp đánh giá tăng trưởng biểu mô âm đạo cũng cho thấy: mức liều 10mg/kg tất cả các mẫu đều không xuất hiện tế bào sừng; liều 100mg/kg cho thấy 13 trên 25 mẫu và với liều 1000mg/kg tất cả các mẫu đều xuất hiện tế bào sừng - chất biểu thị cho hoạt tính estrogen [12]. Tác dụng chống loãng xương Năm 2008, Nontakorn Urasopon cùng cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng chống loãng xương của rễ củ SDCT trên chuột cái đã cắt bỏ buồng trứng. Nghiên cứu cho thấy tác dụng phòng ngừa của SDCT với tình trạng mất xương phụ thuộc vào loại xương, vị trí xương và các khoang xương. Tại liều 100 mg/kg, 1000 mg/kg, tình trạng mất xương được ngăn chặn hoàn toàn cả về mật độ và hàm lượng khoáng chất của xương [43].
Năm 2016, Suthon và cộng sự đã báo cáo tác dụng chống loãng xương của SDCT và puerarin ở chuột cái Sprague-dawley. Nghiên cứu này chỉ ra rằng SDCT có thể được sử dụng như một chất chống loãng xương cho phụ nữ sau mãn kinh. Chuột được điều trị trong 12 tuần bằng liều uống (5, 25 và 50 mg/kg thể trọng) bột rễ củ SDCT và puerarin ở liều 7 mg/kg trọng lượng cơ thể (tiêm dưới da) trong 12 tuần. Tác dụng chống oxy hóa Một số isoflavonoid (puerarin và daidzein) trong SDCT có hoạt tính chống oxy hóa tương tự như α-Tocopherol trong đó đặc biệt là puerarin trong một nghiên cứu invitro đánh giá bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) [15].
Sucontphunt A đã nghiên cứu dịch chiết cồn SDCT trên tế bào thần kinh đại não chuột thấy có tác dụng chống oxy hóa và kháng độc với glutamat rõ ràng ở nồng độ 10 6 và 50 ng/ml theo cơ chế bất hoạt tác dụng của H2O2. Tác dụng thể hiện trên hình ảnh vi học tế bào và số lượng tế bào còn sống [39]. Tác dụng khác ❖ Tác dụng sát khuẩn: Chiết xuất ethyl acetat của SDCT chứa daidzin, genistin, daidzein và genistein thể hiện đặc tính kháng khuẩn chống lại nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết cũng được xác định với giá trị từ 15 đến 50 mg/ml tùy thuộc vào vi khuẩn được thử nghiệm [17].
❖ Tác dụng chống lão hóa: Collagen là thành phần quan trọng của tóc, móng tay và mô liên kết, giúp săn chắc và đàn hồi cho da [28]. Elastin là một loại protein chịu trách nhiệm về độ đàn hồi và khả năng phục hồi của da, cho phép da căng ra và sau đó trở lại hình dạng ban đầu, được xúc tác bởi enzyme elastase. Khi tuổi tác ngày càng tăng, tiếp xúc với bức xạ UV nhiều lần, đàn hồi sẽ bị thoái hóa bởi elastase nội bào, dẫn đến lão hóa da [18]. Các nghiên cứu đã xác nhận hoạt tính chống collagenase yếu của chiết xuất rễ củ SDCT [36].
Chiết xuất SDCT (100 µg/mL) được dùng cho các nguyên bào xương của khỉ đầu chó nguyên sinh đã cải thiện sự tăng sinh và mức độ mRNA của collagen loại I và phosphatase kiềm [7]. Công dụng trong y học cổ truyền và dân gian Ở Thái Lan, bột rễ củ SDCT được trộn với mật ong để tạo thành thuốc viên, uống mỗi ngày một lần vào ban đêm trong 3-6 tháng để phục hồi mái tóc đen, tăng cảm giác thèm ăn, trẻ hóa phụ nữ tuổi mãn kinh gần một trăm năm trước [26]. Hiện nay, SDCT đã đươc đưa vào các sản phẩm mỹ phẩm và thực phẩm chức năng để làm giảm nếp nhăn, tăng kích thước vòng một [27]. Phương pháp xác định daidzein 1.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 7 Bảng 1.