Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu một số đặc tính sinh học sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh care

Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh care.

• Tác giả: Lương Quốc Hưng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Danh mục chữ viết tắt
• 1.2. Danh mục bảng
• 1.3. Danh mục hình
• 1.4. Trích yếu luận văn
• 1.5. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 1.7. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 1.8. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
• 1.8.1. Những đóng góp mới
• 1.8.2. Ý nghĩa khoa học
• 1.8.3. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.9. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.9.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 1.9.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước
• 1.9.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước
• 1.9.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE
• 1.9.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care
• 1.9.2.2. Hình thái của virus Care
• 1.9.2.3. Cấu trúc của virus Care
• 1.9.2.4. Sức đề kháng của virus Care
• 1.9.2.5. Cơ chế sinh bệnh
• 1.9.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care
• 1.9.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care
• 1.9.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE
• 1.9.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care
• 1.9.3.2. Triệu chứng bệnh tích
• 1.9.3.3. Chẩn đoán bệnh Care
• 1.9.4. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VACXIN PHÒNG BỆNH CARE
• 1.10. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.10.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 1.10.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 1.10.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 1.10.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.10.4.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.10.4.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.10.4.3. Nghiên cứu tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.10.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.10.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 1.10.5.2. Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST
• 1.10.5.3. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml)
• 1.10.5.4. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
• 1.10.5.5. Phương pháp RT-PCR
• 1.10.5.6. Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene
• 1.10.5.7. Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus
• 1.10.5.8. Phương pháp ELISA
• 1.10.5.9. Xử lý số liệu
• 1.11. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.11.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
• 1.11.1.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.1.2. Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.1.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
• 1.11.2.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.2.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.2.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.2.4. Kết quả so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid giữa những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 1.11.2.5. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử
• 1.11.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
• 1.11.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đặc tính sinh học của giống gốc vacxin Care

Nghiên cứu về đặc tính sinh học của giống gốc sản xuất vacxin phòng bệnh Care là một lĩnh vực quan trọng trong ngành thú y. Việc hiểu rõ các đặc tính này giúp xác định khả năng gây bệnh và hiệu quả của vacxin. Các chủng giống gốc được phân lập từ chó mắc bệnh Care sẽ được nghiên cứu để đánh giá khả năng sinh trưởng và tính kháng nguyên của chúng.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus Care

Virus Care, hay còn gọi là Canine distemper virus (CDV), thuộc họ Paramyxoviridae. Virus này có cấu trúc RNA đơn và có khả năng gây bệnh cao ở chó. Nghiên cứu cho thấy virus có thể gây ra các triệu chứng nghiêm trọng và tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị kịp thời.

1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu giống gốc vacxin

Việc nghiên cứu giống gốc vacxin không chỉ giúp phát triển các sản phẩm vacxin hiệu quả mà còn đảm bảo an toàn cho đàn chó nuôi. Các chủng giống gốc được lựa chọn từ những trường hợp thực địa sẽ có khả năng bảo vệ tốt hơn trước virus.

II. Thách thức trong nghiên cứu tính kháng nguyên của vacxin Care

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về tính kháng nguyên của vacxin Care, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Một trong những vấn đề lớn là sự biến đổi của virus, dẫn đến việc vacxin không còn hiệu quả như mong đợi. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải liên tục cập nhật và điều chỉnh công thức vacxin.

2.1. Sự biến đổi của virus Care

Virus Care có khả năng biến đổi gen, điều này làm cho các vacxin hiện tại có thể không còn hiệu quả. Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng virus mới có thể xuất hiện và gây ra các đợt bùng phát dịch bệnh.

2.2. Khó khăn trong việc phân lập virus

Phân lập virus Care từ các mẫu bệnh phẩm là một thách thức lớn. Nhiều dòng tế bào không thể nuôi cấy virus này, dẫn đến việc khó khăn trong việc xác định hiệu giá virus và nghiên cứu tính kháng nguyên.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh học của giống gốc vacxin Care

Để nghiên cứu đặc tính sinh học của giống gốc vacxin Care, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy tế bào, phân lập virus và xác định hiệu giá virus. Những phương pháp này giúp cung cấp thông tin chi tiết về khả năng gây bệnh của virus.

3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào Vero DST

Dòng tế bào Vero-DST được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu virus Care. Phương pháp này cho phép phân lập virus và xác định hiệu giá một cách chính xác.

3.2. Phương pháp RT PCR trong nghiên cứu virus

Phương pháp RT-PCR được sử dụng để xác định sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này giúp phát hiện virus với độ nhạy cao và cho phép phân tích gen của virus.

IV. Kết quả nghiên cứu về tính kháng nguyên của giống gốc vacxin Care

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng giống gốc sản xuất vacxin Care có tính kháng nguyên cao. Điều này được xác định thông qua các thử nghiệm trên chó thí nghiệm, cho thấy hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo vệ sau khi tiêm vacxin.

4.1. Hiệu giá kháng thể sau khi tiêm vacxin

Kết quả cho thấy hiệu giá kháng thể đạt cực đại sau 42 ngày tiêm. Các chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 có hiệu giá kháng thể lần lượt là 1,643 ± 0,410 và 1,347 ± 0,246.

4.2. Tính kháng nguyên của hỗn dịch kháng nguyên

Hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt từ các chủng giống gốc cho thấy tính kháng nguyên cao, giúp kích thích hệ miễn dịch của chó thí nghiệm tạo ra kháng thể chống lại virus Care.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu vacxin phòng bệnh Care

Nghiên cứu về vacxin phòng bệnh Care đã chỉ ra rằng việc lựa chọn giống gốc phù hợp là rất quan trọng. Các kết quả đạt được từ nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc phát triển vacxin hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong ngành thú y

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển vacxin mà còn giúp nâng cao nhận thức về bệnh Care trong cộng đồng chăn nuôi. Việc phòng bệnh hiệu quả sẽ giảm thiểu thiệt hại cho đàn chó nuôi.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu vacxin

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các chủng giống gốc mới và cải tiến công nghệ sản xuất vacxin. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả bảo vệ cho đàn chó nuôi trong nước.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Care (Canine Distemper) do Canine Distemper Virus (CDV) gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm hàng đầu trên đàn chó, ghi nhận tỷ lệ tử vong dao động từ 50% đến 80%, thậm chí chạm ngưỡng 100% khi xảy ra bội nhiễm vi khuẩn kế phát. Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện từ năm 1920 và hiện diện khắp các tỉnh thành, gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi thú cảnh. Mặc dù nhiều đàn chó đã được tiêm phòng bằng các loại vắc-xin nhược độc nhập khẩu chứa chủng cổ điển Onderstepoort, dịch bệnh vẫn bùng phát do sự biến đổi di truyền và sai khác kháng nguyên giữa chủng vắc-xin thương mại và các chủng virus lưu hành ngoài thực địa.

Đề tài được thực hiện nhằm xác định và đánh giá toàn diện các đặc tính sinh học, sinh học phân tử cùng tính kháng nguyên của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04, làm cơ sở khoa học vững chắc cho việc sản xuất vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Care tại Việt Nam. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Khoa Thú y và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Kết quả đề tài mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi xác lập bộ dữ liệu kỹ thuật hoàn chỉnh cho hai chủng virus thực địa với hiệu giá đạt 3,16 x 10^4 TCID50/25µl và hiệu giá kháng thể trung bình đạt đỉnh OD 1,643 ± 0,410 trên mô hình động vật thí nghiệm, tạo tiền đề tự chủ nguồn vắc-xin vô hoạt nội địa an toàn và hiệu quả cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết virus học hiện đại về giống Morbillivirus thuộc họ Paramyxoviridae. Virus Care có cấu trúc hệ gen RNA sợi đơn không phân đoạn mang điện tích âm (-ssRNA) với kích thước khoảng 15,7 kb, bao gồm 6 gen cấu trúc mã hóa cho các protein N, P, M, F, H, L và 1 protein phi cấu trúc C. Trong đó, phosphoprotein P tham gia trực tiếp vào quá trình sao chép RNA, còn glycoprotein bọc ngoài H (Haemagglutinin, khối lượng phân tử 76-80 kDa) giữ vai trò then chốt trong việc gắn kết thụ thể SLAM và CD46 trên màng tế bào vật chủ để xâm nhập mô bào.

Dựa trên trình tự gen H, cấu trúc dịch tễ học phân tử của virus Care toàn cầu được phân chia thành 7 nhóm di truyền địa lý chính gồm: Asia 1, Asia 2, America 1, America 2, Europe, Europe-wildlife và Arctic-like. Bên cạnh đó, khung lý thuyết miễn dịch học vắc-xin vô hoạt khẳng định rằng việc bất hoạt hoàn toàn độc lực virus bằng hóa chất mà vẫn bảo tồn nguyên vẹn cấu trúc kháng nguyên bề mặt, kết hợp với hệ chất bổ trợ nhũ dầu, sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể sinh kháng thể IgG trung hòa bảo hộ mạnh mẽ mà không gây ra nguy cơ phục hồi độc lực như vắc-xin nhược độc truyền thống.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu xuất phát từ hai chủng giống gốc cường độc gồm VNUA-CDV-03 (phân lập từ phổi chó bệnh tại Hà Nội năm 2012) và VNUA-CDV-04 (phân lập từ ruột chó bệnh tại Cần Thơ năm 2013) ở đời cấy truyền thứ 5 (P#5), đối chứng cùng chủng vắc-xin Onderstepoort phân lập từ chế phẩm Duramune DA2L. Virus được nhân dòng trên môi trường tế bào Vero-DST nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 5-10% huyết thanh thai bò (FBS) tại điều kiện 37°C và 5% CO2.

Phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR một bước với bộ kít Qiagen One-step RT-PCR để khuếch đại gen H và gen P bằng các cặp mồi đặc hiệu CDVff1/CDV-HS2 và Upp1/Upp2. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải trình tự gen Sanger tự động trên hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000. Dữ liệu trình tự được đối chiếu qua ngân hàng gen GenBank, căn chỉnh bằng Genetyx 5.4 và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA6 theo phương pháp Maximum Likelihood với 1000 lần lặp bootstrap.

Đánh giá tính kháng nguyên in vivo được tiến hành trên 15 chó lai Becgie cái khỏe mạnh, 6 tuần tuổi, cân nặng 4-5 kg và hoàn toàn âm tính với kháng thể CDV. Động vật được chia ngẫu nhiên thành 3 lô (5 con mỗi lô): lô tiêm kháng nguyên vô hoạt VNUA-CDV-03, lô tiêm VNUA-CDV-04 (vô hoạt bằng BEI nồng độ 0,005M - 0,01M, nhũ hóa với tá dược dầu ISA 740 theo tỷ lệ 1:1, liều 2 ml/con đường tiêm bắp) và lô đối chứng tiêm 2 ml nước cất. Hiệu giá kháng thể IgG được theo dõi định kỳ qua 11 mốc thời gian trong 56 ngày bằng kỹ thuật ELISA qua bộ kít Ingezime MOQUILLO IgG. Số liệu được phân tích phương sai hai nhân tố (Two-way ANOVA) trên phần mềm GraphPad Prism 6.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình theo dõi đặc tính sinh học trên thảm tế bào Vero-DST cho thấy cả hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 bắt đầu xuất hiện bệnh tích tế bào (CPE) dạng hợp bào sau 12 giờ gây nhiễm. Tỷ lệ phá hủy tế bào đạt 50-55% sau 36 giờ, đạt 90% sau 48 giờ và phá hủy hoàn toàn 100% sau 60-72 giờ. Ngược lại, chủng chuẩn Onderstepoort có tốc độ phá hủy nhanh hơn khi đạt 100% CPE ngay ở 48 giờ.

Hiệu giá virus của chủng VNUA-CDV-03 đạt mức 3,16 x 10^4 TCID50/25µl, cao hơn so với chủng VNUA-CDV-04 với 1,47 x 10^4 TCID50/25µl. Khảo sát động học nhân lên chỉ ra rằng lượng virus nội bào luôn cao hơn lượng virus phóng thích ngoại bào ở mọi mốc thời gian, cả hai phân đoạn đều đạt nồng độ cực đại sau 48 giờ gây nhiễm.

Phân tích sinh học phân tử đoạn gen H dài 1824 bp và gen P dài 402 bp ghi nhận độ tương đồng nucleotide giữa VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 đạt 89,20% ở gen H (tương đồng amino acid 88,83%) và 95,10% ở gen P (tương đồng amino acid 93,08%). Cây phát sinh loài chứng minh chủng VNUA-CDV-03 thuộc nhánh di truyền Asia 1, trong khi VNUA-CDV-04 thuộc nhóm Classic.

Về tính kháng nguyên, hiệu giá kháng thể IgG kháng virus Care ở cả hai lô tiêm vắc-xin vô hoạt bắt đầu vượt ngưỡng tới hạn (Cut-off) sau 21 ngày tiêm, đạt đỉnh cực đại sau 42 ngày với giá trị OD trung bình của lô VNUA-CDV-03 là 1,643 ± 0,410 và lô VNUA-CDV-04 là 1,347 ± 0,246, vượt trội hoàn toàn so với lô đối chứng.

Thảo luận kết quả

Đặc tính phá hủy tế bào theo dạng hợp bào (syncytium) của hai chủng phân lập tương đồng với các nghiên cứu trước đây trên các chủng thực địa CDV-HN1, Vn86 và Vn99 tại Việt Nam. Việc hàm lượng virus tập trung chủ yếu trong tế bào và đạt đỉnh ở 48 giờ cung cấp căn cứ kỹ thuật chính xác để biểu diễn đường cong sinh trưởng và xác định thời điểm thu hoạch sinh khối kháng nguyên tối ưu nhất là khi bệnh tích tế bào đạt 90%, kết hợp kỹ thuật phá vỡ màng tế bào bằng sốc nhiệt đông - tan băng.

Sự khác biệt rõ nét về kiểu gen khi chủng VNUA-CDV-03 thuộc nhóm Asia 1 (đặc trưng cho các chủng virus đang lưu hành thực địa tại châu Á) và VNUA-CDV-04 thuộc nhóm Classic giải thích hiện tượng thất bại miễn dịch khi sử dụng vắc-xin nhập ngoại dòng Onderstepoort trên đàn chó trong nước. Kết quả phân tích phả hệ kết hợp bảng ma trận tương đồng nucleotide và amino acid khẳng định tính cấp thiết phải sử dụng chủng bản địa Asia 1 để bảo đảm độ tương thích kháng nguyên cao nhất.

Dữ liệu ELISA khẳng định kháng nguyên vô hoạt bằng BEI kết hợp tá dược dầu khoáng ISA 740 có khả năng dung nạp tốt, an toàn tuyệt đối và kích thích miễn dịch bền vững kéo dài trên 56 ngày. Hiệu giá kháng thể của chủng VNUA-CDV-03 luôn duy trì cao hơn chủng VNUA-CDV-04 có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), chứng minh đây là ứng viên giống gốc xuất sắc nhất cho sản xuất công nghiệp.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình công nghệ sản xuất vắc-xin vô hoạt phòng bệnh Care: Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm thú y cần ứng dụng quy trình nhân sinh khối chủng VNUA-CDV-03 trên dòng tế bào Vero-DST với chỉ tiêu hiệu giá virus tối thiểu đạt 10^4 TCID50/liều, triển khai hoàn thiện dây chuyền trong giai đoạn 2024-2025.

Thứ hai, tối ưu hóa công thức nhũ hóa tá dược và độ ổn định chế phẩm: Các đơn vị nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam cần tiếp tục thử nghiệm phối hợp tá dược nhũ dầu ISA 740 ở tỷ lệ 1:1, kiểm soát độ nhớt dưới mức 50 mPa.s và đánh giá độ bền kháng thể kéo dài đến 12-24 tháng sau tiêm, thực hiện trong vòng 12 tháng tới.

Thứ ba, hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu giữ nguồn gen quốc gia: Ban quản lý đề tài cần nộp hồ sơ đăng ký chủng giống VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 vào Ngân hàng Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia trong quý III/2024 nhằm xác lập bản quyền sở hữu trí tuệ và bảo hộ tài nguyên sinh học thú y phục vụ nghiên cứu dài hạn.

Thứ tư, mở rộng thử nghiệm lâm sàng và công cường độc diện rộng: Cục Thú y phối hợp với các chi cục chăn nuôi thú y địa phương phê duyệt đề án thử nghiệm thực địa vắc-xin vô hoạt trên tối thiểu 500 cá thể chó nuôi tại các đô thị lớn như Hà Nội, Cần Thơ và TP. Hồ Chí Minh trong giai đoạn 2025-2026, hướng tới mục tiêu tỷ lệ bảo hộ thực địa đạt trên 95%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhà nghiên cứu vi sinh vật học và bệnh lý học thú y: Cung cấp tài liệu chuyên sâu về phương pháp phân lập virus Care trên dòng tế bào Vero-DST, kỹ thuật thiết kế mồi RT-PCR và phương pháp phân tích cây phát sinh loài phục vụ các nghiên cứu dịch tễ học phân tử.

Các công ty sản xuất vắc-xin và sinh phẩm thú y: Tiếp nhận quy trình công nghệ chuẩn từ thông số vô hoạt BEI nồng độ 0,005M - 0,01M, tỷ lệ phối trộn chất bổ trợ đến quy chuẩn kiểm tra hiệu giá TCID50, hỗ trợ thương mại hóa chế phẩm vắc-xin vô hoạt chất lượng cao.

Bác sĩ thú y lâm sàng và nhà dịch tễ học thú y cảnh: Bổ sung kiến thức chuyên ngành về sự phân bố của các genotype Asia 1 và Classic tại Việt Nam, từ đó nâng cao kỹ năng chẩn đoán phân biệt lâm sàng và xây dựng lịch trình tiêm phòng vắc-xin chính xác cho thú cưng.

Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y: Làm tài liệu tham khảo chuẩn mực trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh truyền nhiễm thú cưng, kỹ thuật miễn dịch học ELISA và mô hình thiết kế thí nghiệm in vivo đánh giá đáp ứng miễn dịch động vật.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nên sản xuất vắc-xin vô hoạt thay vì tiếp tục sử dụng vắc-xin nhược độc nhập khẩu? Vắc-xin nhược độc nhập khẩu chủ yếu chế từ chủng Onderstepoort thuộc nhóm Classic, có thể bị trung hòa bởi kháng thể mẹ truyền hoặc gây đột biến tái độc lực trên các cá thể thú suy giảm miễn dịch. Vắc-xin vô hoạt từ chủng bản địa an toàn tuyệt đối và tạo miễn dịch tương thích cao với chủng virus đang gây bệnh thực địa.

Điểm khác biệt di truyền nổi bật giữa hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 là gì? Chủng VNUA-CDV-03 phân lập tại Hà Nội thuộc genotype Asia 1 có tỷ lệ tương đồng gen H là 89,20% so với VNUA-CDV-04 phân lập tại Cần Thơ thuộc nhóm Classic. Sự sai khác 11,17% về trình tự amino acid chuỗi protein H giải thích tính kháng nguyên vượt trội của chủng VNUA-CDV-03.

Tại sao dòng tế bào Vero-DST lại được ưu tiên sử dụng trong nghiên cứu này? Tế bào Vero-DST biểu hiện phân tử thụ thể SLAM trên bề mặt màng, tạo điều kiện tối ưu cho virus Care xâm nhập và nhân lên nhanh chóng, hình thành bệnh tích hợp bào rõ nét từ 12 giờ gây nhiễm, khắc phục hoàn toàn nhược điểm khó phân lập virus của các dòng tế bào thận thông thường.

Thời điểm thu hoạch virus nào mang lại hiệu giá kháng nguyên cao nhất? Hiệu giá virus cả nội bào và ngoại bào đều đạt đỉnh sau 48 giờ gây nhiễm khi bệnh tích tế bào đạt 90%. Do lượng virus tập trung chủ yếu trong nội bào, quy trình thu hoạch cần kết hợp làm tan rã màng tế bào bằng phương pháp đông - tan băng lặp lại để thu hồi tối đa lượng kháng nguyên đạt 3,16 x 10^4 TCID50/25µl.

Đáp ứng miễn dịch trên chó sau khi tiêm vắc-xin vô hoạt diễn tiến như thế nào? Hiệu giá kháng thể IgG bắt đầu vượt ngưỡng tới hạn Cut-off từ ngày 21 sau tiêm, tăng nhanh và đạt đỉnh cực đại sau 42 ngày với giá trị OD đạt 1,643 ± 0,410 ở chủng VNUA-CDV-03, sau đó duy trì ổn định ở mức bảo hộ cao đến ngày thứ 56 của kỳ theo dõi.

Kết luận

• Luận văn đã xác lập đầy đủ hồ sơ đặc tính sinh học của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 trên dòng tế bào Vero-DST với hiệu giá virus lần lượt đạt 3,16 x 10^4 TCID50/25µl và 1,47 x 10^4 TCID50/25µl.
• Giải mã thành công trình tự gen H (1824 bp) và gen P (402 bp), chứng minh chủng VNUA-CDV-03 thuộc kiểu gen Asia 1 và VNUA-CDV-04 thuộc kiểu gen Classic lưu hành tại Việt Nam.
• Khẳng định tính kháng nguyên vượt trội của vắc-xin vô hoạt bổ sung tá dược ISA 740 với hiệu giá kháng thể IgG đạt đỉnh OD 1,643 ± 0,410 sau 42 ngày tiêm phòng trên mô hình chó thực nghiệm.
• Cung cấp cơ sở khoa học và nguồn vật liệu sinh học chuẩn hóa phục vụ trực tiếp cho công tác chuyển giao công nghệ sản xuất vắc-xin phòng bệnh Care quy mô công nghiệp trong nước.
• Định hướng giai đoạn 2024-2026: Đẩy mạnh các thử nghiệm công cường độc mở rộng và hoàn thiện hồ sơ cấp phép lưu hành vắc-xin vô hoạt thương mại; các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp hãy kết nối với Bộ môn Bệnh lý Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam để thúc đẩy hợp tác phát triển công nghệ sinh học thú y bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯƠNG QUỐC HƯNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lương Quốc Hưng i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lương Quốc Hưng ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan .ii Mục lục .iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

viii Trích yếu luận văn. ix Thesis Abstract. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.

PHẠM VI NGHIÊN CỨU. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN. Những đóng góp mới. Ý nghĩa khoa học.

Ý nghĩa thực tiễn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước.

Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE. Phân loại virus gây bệnh Care. Hình thái của virus Care.

Cấu trúc của virus Care. Sức đề kháng của virus Care. Cơ chế sinh bệnh. Đặc tính sinh học của virus Care.

Đặc tính sinh học phân tử của virus Care. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care. 14 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Triệu chứng bệnh tích. Chẩn đoán bệnh Care. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VACXIN PHÒNG BỆNH CARE. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Nghiên cứu tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Phương pháp nuôi cấy tế bào. Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml). Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus.

Phương pháp RT-PCR. Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene. Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus. Phương pháp ELISA.

Xử lý số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care.

Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. 38 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE.

Kết quả giải trình tự gene của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid giữa những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care.

Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

78 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó) CPE Cytophathogenic Effect (Khả năng gây bệnh tích tế bào) DW De-ionized water (Nước khử ion) DNA Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic) EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (Axít etylen diamin tetraaxetic) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp miễn dịch ELISA gắn enzyme) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) FCS Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê) MOI Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) RNA Ribonucleic acid (Axít ribonucleic) Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng RT-PCR hợp chuỗi phiên mã ngược) SLS Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu) TBE Tris/Borate/EDTA (Dung dịch đệm có axít boric) Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm 50% TCID50 trên môi trường nuôi cấy mô) vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra. Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care được lưu hành ở Việt Nam. Thông tin của hai chủng giống gốc nghiên cứu.

Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR. Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR. Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR sequence.

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR sequence. Sơ đồ bố trí thí nghiệm. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705).

Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Sự tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid của gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với một số chủng virus Care tham chiếu (%).

Sự tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid của gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với một số chủng virus Care tham chiếu (%). 59 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cấu trúc hạt virus Morbillivirus. Cấu trúc của virus Care.

Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X).

CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X).

Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-03 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-04 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene H. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene P.

Giản đồ giải trình tự gene tự động đoạn gene Phosphor của chủng virus VNUA-CDV-04. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene H của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705).

So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene P của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của hai chủng giống gốc nghiên cứu và một số chủng virus Care tham chiếu. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của hai chủng giống gốc nghiên cứu và một số chủng virus Care tham chiếu. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus Care bằng phương pháp ELISA trên lô chó thí nghiệm và đối chứng.

64 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lương Quốc Hưng Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care Ngành: Thú y Mã số: 60.