Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập ở miền Bắc Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus care phân lập ở phía bắc, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Thị Hạnh
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập ở Phía Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. DANH MỤC ĐỒ THỊ
• 6. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 8. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
• 9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 10. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 10.1. Ý nghĩa khoa học
• 10.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 11. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 11.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 11.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước
• 11.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu virus Care tại miền Bắc Việt Nam

Virus Care, hay còn gọi là Canine distemper virus (CDV), là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh ở chó. Bệnh này có tính lây lan cao và tỷ lệ tử vong rất lớn, đặc biệt là ở chó con. Nghiên cứu này nhằm mục đích tìm hiểu các đặc tính sinh học và phân tử của virus Care phân lập tại miền Bắc Việt Nam. Việc hiểu rõ về virus này không chỉ giúp trong việc chẩn đoán và điều trị mà còn hỗ trợ trong việc phát triển vaccine hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus Care

Virus Care thuộc họ Paramyxoviridae, có cấu trúc RNA đơn không phân đoạn. Virus này có khả năng gây bệnh nặng cho chó, với triệu chứng điển hình như sốt, ho, và tiêu chảy. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng virus có thể tồn tại lâu trong môi trường và dễ dàng lây lan giữa các cá thể.

1.2. Tình hình dịch bệnh Care tại miền Bắc Việt Nam

Bệnh Care đã được phát hiện tại Việt Nam từ năm 1920 và hiện nay vẫn đang gây ra nhiều thiệt hại cho đàn chó nuôi. Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100% nếu không được điều trị kịp thời. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng virus Care có mặt ở hầu hết các tỉnh miền Bắc, với nhiều chủng virus khác nhau.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu virus Care

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về virus Care, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc hiểu rõ về đặc tính sinh học và phân tử của virus này. Sự biến đổi gen của virus khiến cho việc phát triển vaccine trở nên khó khăn. Ngoài ra, việc thiếu thông tin chi tiết về các chủng virus đang lưu hành cũng là một vấn đề lớn.

2.1. Sự biến đổi gen của virus Care

Virus Care có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, điều này làm cho các vaccine hiện có không còn hiệu quả. Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng virus mới có thể xuất hiện và gây ra dịch bệnh nghiêm trọng hơn.

2.2. Thiếu thông tin về các chủng virus

Việc thiếu thông tin chi tiết về các chủng virus Care đang lưu hành tại miền Bắc Việt Nam gây khó khăn trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để thu thập dữ liệu về các chủng virus này.

III. Phương pháp nghiên cứu virus Care hiệu quả

Để nghiên cứu virus Care, các phương pháp hiện đại như RT-PCR và giải trình tự gene được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định chính xác các chủng virus và đặc tính sinh học của chúng. Việc sử dụng tế bào Vero-DST để phân lập virus cũng là một trong những phương pháp quan trọng.

3.1. Phương pháp RT PCR trong chẩn đoán virus Care

RT-PCR là một phương pháp chính xác để phát hiện virus Care trong mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này cho phép xác định sự hiện diện của virus ngay cả khi số lượng virus trong mẫu rất thấp.

3.2. Giải trình tự gene để phân tích virus

Giải trình tự gene giúp xác định cấu trúc gen của virus Care, từ đó phân tích được sự tương đồng giữa các chủng virus khác nhau. Kết quả này rất quan trọng trong việc phát triển vaccine và các biện pháp phòng ngừa.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập được nhiều chủng virus Care từ chó mắc bệnh. Những chủng này có tiềm năng cao trong việc phát triển vaccine và các chế phẩm sinh học. Việc hiểu rõ về đặc tính sinh học và phân tử của virus sẽ giúp cải thiện hiệu quả phòng ngừa và điều trị bệnh Care.

4.1. Phân lập và xác định các chủng virus Care

Nghiên cứu đã phân lập được 23 chủng virus Care từ các mẫu bệnh phẩm. Các chủng này được đánh giá về khả năng gây bệnh và hiệu giá virus, từ đó lựa chọn ra những chủng có tiềm năng cao cho việc phát triển vaccine.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong thực tiễn

Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển vaccine mà còn hỗ trợ trong công tác chẩn đoán và điều trị bệnh Care. Điều này góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra cho đàn chó nuôi.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu virus Care

Nghiên cứu về virus Care tại miền Bắc Việt Nam đã cung cấp nhiều thông tin quý giá về đặc tính sinh học và phân tử của virus. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự biến đổi gen của virus và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus Care

Nghiên cứu virus Care không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe cho đàn chó mà còn có ý nghĩa lớn trong việc bảo tồn các giống chó quý hiếm. Việc phát triển vaccine hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ tử vong do bệnh Care.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tập trung vào việc phát triển các vaccine mới và cải thiện các phương pháp chẩn đoán. Đồng thời, việc theo dõi sự biến đổi gen của virus Care cũng cần được thực hiện thường xuyên để có thể ứng phó kịp thời với các chủng virus mới.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Care (Canine Distemper - sài sốt ở chó) do Canine distemper virus (CDV) gây ra là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trên đàn chó nuôi, với tỷ lệ tử vong phổ biến từ 50% đến 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không được can thiệp kịp thời. Tại Việt Nam, dịch bệnh đã xuất hiện từ năm 1920 và liên tục lưu hành rộng rãi, gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế và tâm lý cho người nuôi thú cảnh. Mặc dù các loại vắc xin ngoại nhập đã được sử dụng phổ biến, các đợt bùng phát dịch vẫn xuất hiện do sự biến đổi liên tục về đặc tính kháng nguyên và di truyền của virus thực địa.

Đứng trước thực tiễn đó, nghiên cứu của tác giả Lê Thị Hạnh dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Nguyễn Thị Lan tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tập trung làm rõ các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus Care lưu hành tại miền Bắc. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019, tiến hành thu thập và khảo sát trên 46 cá thể chó nghi mắc bệnh tại 5 tỉnh thành trọng điểm gồm Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương, Thái Bình và Hà Giang.

Bằng kỹ thuật RT-PCR chuyên sâu, đề tài đã xác định chính xác 37 ca dương tính với CDV trên 5 giống chó bản địa và ngoại nhập. Kết quả nghiên cứu đã phân lập thành công 23 chủng virus trên dòng tế bào Vero-DST, đánh giá quy luật nhân lên và giải mã trình tự đoạn gene P có độ dài 387 bp. Công trình có ý nghĩa khoa học sâu sắc khi thiết lập ngân hàng dữ liệu di truyền cho các chủng CDV thuộc kiểu gen Asia 1, tạo tiền đề thực tiễn then chốt để phục vụ nghiên cứu sản xuất vắc xin nội địa và kit chẩn đoán nhanh đạt độ nhạy cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học thú y và bệnh lý học phân tử về giống Morbillivirus thuộc họ Paramyxoviridae. Virus Care có cấu trúc hệ gene là một chuỗi đơn RNA âm không phân đoạn dài khoảng 15,7 kb, bao bọc bởi lớp vỏ ngoài lipoprotein chứa các glycoprotein bề mặt. Hệ gene mã hóa cho 6 protein cấu trúc chính bao gồm Nucleocapsid (N), Phosphoprotein (P), Matrix (M), Fusion (F), Haemagglutinin (H), Large protein (L) và 1 protein phi cấu trúc (C).

Cơ chế sinh bệnh học của CDV dựa trên thuyết hướng mô đa hệ thống: virus ban đầu xâm nhập và nhân lên mạnh mẽ tại các mô lympho của đường hô hấp, gây suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, sau đó lan tràn vào máu và tấn công tế bào biểu mô đường hô hấp, tiêu hóa cùng hệ thống thần kinh trung ương. Thuyết tương tác thụ thể chỉ ra rằng glycoprotein bề mặt của virus gắn kết đặc hiệu với thụ thể SLAM (CD150) trên tế bào bạch cầu và thụ thể Nectin-4 trên tế bào biểu mô. Sự hiểu biết sâu sắc về vai trò của gene P (đóng vai trò đồng yếu tố cho phức hợp RNA polymerase trong quá trình sao chép virus) và khả năng tạo bệnh tích tế bào (CPE) dạng hợp bào (syncytium) đóng vai trò định hướng cho toàn bộ phân tích thực nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng quy trình tiếp cận dịch tễ học lâm sàng kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại trên cỡ mẫu 46 cá thể chó nghi mắc bệnh, từ đó xác định 37 mẫu bệnh phẩm dương tính tuyệt đối với CDV. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được thực hiện tại các bệnh viện thú y và phòng khám cơ sở thuộc 5 địa bàn nghiên cứu: Hà Nội (10 mẫu), Thái Bình (8 mẫu), Hà Giang (7 mẫu), Hải Dương (6 mẫu) và Hưng Yên (6 mẫu). Việc lựa chọn cỡ mẫu này đảm bảo tính đại diện cho cả giống chó ngoại nhập (Becgie, Fox) và giống chó bản địa quý (Bắc Hà, H'Mông Cộc, Phú Quốc) ở các độ tuổi từ dưới 3 tháng đến trên 12 tháng.

Để đảm bảo độ tinh sạch và phân biệt chính xác với Canine Parvovirus (CPV) - một tác nhân gây viêm ruột xuất huyết có triệu chứng tương đồng, nghiên cứu kết hợp kỹ thuật PCR chẩn đoán Parvovirus và RT-PCR chẩn đoán CDV bằng bộ kit Qiagen One-step RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu Upp1/Upp2. Virus được phân lập trên dòng tế bào Vero-DST (dòng tế bào biểu hiện thụ thể SLAM của chó), giúp tăng tỷ lệ bắt giữ và nhân lên của mầm bệnh hoang dã. Hiệu giá virus được xác định theo chỉ số TCID50/ml bằng phương pháp Behrens-Karber trên khay 96 giếng với mật độ 20.000 tế bào/giếng. Toàn bộ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene P được giải trình tự tự động trên hệ thống Sanger Beckman Coulter CEQ 8000, xử lý dữ liệu phát sinh loài bằng phần mềm BioEdit và MEGA6 từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ dương tính với CDV qua kỹ thuật RT-PCR đạt 80,43% (37/46 mẫu nghi mắc), trong đó 100% mẫu dương tính với CDV đều âm tính hoàn toàn với Parvovirus. Triệu chứng lâm sàng xuất hiện với tần suất cao nhất gồm: ủ rũ biếng ăn (100%), sốt cao (100%), dử mắt nhiều (100%), nôn mửa (97,30%), hoại dịch hô hấp và ho (91,89%), chảy dử mũi (89,19%), tiêu chảy phân màu cà phê (81,08%). Các biểu hiện đặc thù như nốt sài ở vùng da mỏng chiếm 35,14%, triệu chứng thần kinh chiếm 16,22% và sừng hóa gan bàn chân chiếm 10,81%.

Thứ hai, tác giả đã phân lập thành công 23 chủng virus Care trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST. Thử nghiệm trên 12 chủng đại diện cho thấy bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sớm sau 24 đến 36 giờ gây nhiễm với hiện tượng tế bào co tròn, kết đám tạo hợp bào và phá hủy hoàn toàn lớp tế bào đơn lớp sau 96 giờ. Hiệu giá virus phân lập đạt mức cao, dao động từ 1,44 x 10^2 đến 3,16 x 10^5 TCID50/ml.

Thứ ba, khảo sát quy luật nhân lên của 3 chủng đại diện (CDV1-RHN, CDV19-PHN, CDV28-HHN) cho thấy hàm lượng virus nội bào luôn cao hơn hàm lượng virus giải phóng ngoại bào tại mọi thời điểm, đồng thời hiệu giá virus đạt đỉnh cực đại trong khoảng 48 đến 60 giờ sau khi gây nhiễm.

Thứ tư, giải trình tự đoạn gene P (kích thước 387 bp) của 3 chủng nghiên cứu xác định độ tương đồng nucleotide đạt từ 93,00% đến 99,4% và độ tương đồng amino acid đạt từ 88,01% đến 98,0%. Cả 3 chủng phân lập đều thuộc kiểu gen Asia 1, phân bố thành 2 phân nhánh tiến hóa riêng biệt trên cây phả hệ di truyền.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ tổn thương bệnh tích đại thể tại hạch lympho sưng to và xuất huyết ghi nhận ở mức 100% (37/37 ca mổ khám), tiếp đến là tổn thương viêm phổi nhục hóa, xuất huyết niêm mạc ruột và sung huyết não. Điều này hoàn toàn phù hợp với cơ chế xâm nhập tế bào miễn dịch nguyên phát của CDV, giải thích nguyên nhân gây suy giảm tế bào lympho trầm trọng và mở đường cho các nhiễm trùng kế phát.

So với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam và khu vực châu Á, việc phát hiện các chủng virus thuộc nhánh Asia 1 khẳng định sự chiếm ưu thế của nhóm di truyền này tại miền Bắc, có mối liên hệ dịch tễ mật thiết với các chủng lưu hành tại Trung Quốc. Dữ liệu thực nghiệm của đề tài có thể được hệ thống hóa trực quan qua bảng tổng hợp tỷ lệ 10 triệu chứng lâm sàng theo từng nhóm tuổi và đồ thị động học biểu diễn biến thiên log10 TCID50 theo thời gian từ 12 đến 96 giờ. Cây sinh học phân tử xây dựng từ phần mềm MEGA6 minh chứng rõ ràng sự phân nhánh của các biến chủng thực địa so với các chủng vắc xin cổ điển như Onderstepoort hay Snyder Hill, lý giải nguyên nhân giảm hiệu lực bảo hộ của một số vắc xin nhập khẩu thương mại.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình công nghệ nhân nuôi và sản xuất kháng nguyên vắc xin nhược độc từ các chủng CDV nội địa phân lập được (tiêu biểu như CDV1-RHN hoặc CDV19-PHN) đạt hiệu giá tối thiểu 10^4 đến 10^5 TCID50 mỗi liều. Mục tiêu này cần được các viện nghiên cứu chuyên ngành và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y hoàn thiện trong khung thời gian 2024 - 2026 nhằm nâng cao độ tương đồng kháng nguyên với các chủng thực địa.

Thứ hai, triển khai ứng dụng phổ biến kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi Upp1/Upp2 và phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh sắc ký miễn dịch có độ nhạy đạt trên 95%. Chi cục Thú y các địa phương cùng hệ thống phòng khám lâm sàng cần áp dụng công cụ này nhằm phát hiện bệnh sớm trong 24 đến 48 giờ đầu khi triệu chứng còn chưa điển hình.

Thứ ba, ban hành phác đồ tiêm phòng vắc xin nghiêm ngặt cho đàn chó nuôi với mục tiêu đạt tỷ lệ bảo hộ miễn dịch quần thể trên 85%. Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh thành cần chỉ đạo tiêm mũi 1 khi chó đạt 6 đến 8 tuần tuổi, tiêm nhắc lại 2 mũi tiếp theo cách nhau 3 đến 4 tuần và tái chủng định kỳ mỗi năm một lần.

Thứ tư, thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ phân tử định kỳ 6 tháng một lần tại 5 tỉnh trọng điểm phía Bắc dưới sự chủ trì của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y. Hoạt động này nhằm liên tục cập nhật ngân hàng dữ liệu giải trình tự gene P và gene H, theo dõi các đột biến mới để kịp thời điều chỉnh chiến lược phòng ngừa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, bác sĩ thú y thực hành và chủ các phòng khám thú cảnh: Tài liệu cung cấp cơ sở nhận diện nhanh 10 triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể đặc trưng, giúp phân biệt chính xác bệnh Care với Parvovirus trên thực địa để áp dụng phác đồ trợ sức, trợ lực và kháng huyết thanh kịp thời.

Thứ hai, cán bộ nghiên cứu tại các viện, trung tâm sản xuất vắc xin thú y: Luận văn cung cấp thông số chi tiết về đặc tính nuôi cấy trên dòng tế bào Vero-DST, hiệu giá virus đạt 3,16 x 10^5 TCID50/ml và quy luật nhân lên đạt đỉnh ở 48 - 60 giờ để phục vụ quy trình tuyển chọn giống sản xuất sinh phẩm.

Thứ ba, giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Bác sĩ Thú y, Công nghệ Sinh học: Công trình là nguồn tài liệu học thuật tiêu chuẩn về phương pháp phân lập virus, kỹ thuật RT-PCR, tinh sạch sản phẩm PCR và phân tích phả hệ bằng phần mềm chuyên dụng.

Thứ tư, cơ quan quản lý dịch tễ động vật và các tổ chức bảo tồn động vật hoang dã: Cung cấp bằng chứng khoa học về sự lưu hành của kiểu gen Asia 1, hỗ trợ công tác kiểm dịch vận chuyển động vật qua biên giới và ngăn chặn nguy cơ lây lan mầm bệnh sang các loài thú ăn thịt quý hiếm.

Câu hỏi thường gặp

Bệnh Care ở chó nguy hiểm như thế nào và tỷ lệ tử vong thực tế là bao nhiêu?
Bệnh Care là bệnh truyền nhiễm cấp tính do Morbillivirus gây tổn thương đa cơ quan từ hô hấp, tiêu hóa đến thần kinh. Tỷ lệ tử vong dao động từ 50% đến 80%, có thể lên tới 100% nếu không được điều trị sớm, đặc biệt ở chó con dưới 6 tháng tuổi khi kháng thể mẹ truyền suy giảm.

Tại sao nghiên cứu lại chọn dòng tế bào Vero-DST để phân lập virus Care?
Dòng tế bào Vero-DST được chuyển gene biểu hiện thụ thể SLAM (CD150) của chó, cho phép virus gắn kết và xâm nhập tự nhiên. Nhờ đó, virus sinh trưởng nhanh, biểu hiện bệnh tích hợp bào rõ nét sau 24 đến 36 giờ và đạt hiệu giá cao tới 3,16 x 10^5 TCID50/ml.

Các chủng virus Care phân lập tại miền Bắc thuộc nhóm di truyền nào?
Dựa trên kết quả giải trình tự đoạn gene P dài 387 bp, cả 3 chủng đại diện CDV1-RHN, CDV19-PHN và CDV28-HHN đều thuộc kiểu gen Asia 1, phân bố thành 2 nhánh phát sinh và có độ tương đồng nucleotide từ 93,00% đến 99,4% với các chủng lưu hành trong khu vực.

Những dấu hiệu lâm sàng nào có tỷ lệ xuất hiện cao nhất khi chó mắc bệnh Care?
Theo số liệu khảo sát 37 ca bệnh, 100% cá thể biểu hiện sốt cao, ủ rũ bỏ ăn và có dử mắt đặc; 97,30% nôn mửa; 91,89% ho; 89,19% chảy dử mũi; và 81,08% tiêu chảy phân màu cà phê. Biểu hiện thần kinh xuất hiện muộn hơn ở 16,22% số ca.

Phương pháp nào được đánh giá là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định bệnh Care?
Kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gene P là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất (đạt tỷ lệ phát hiện 80,43% trên mẫu nghi ngờ), giúp loại trừ tuyệt đối sự đồng nhiễm với Parvovirus và phát hiện sớm mầm bệnh ngay cả khi xét nghiệm nhanh cho kết quả âm tính.

Kết luận

• Xác định thành công 37 ca nhiễm virus Care trên 5 giống chó tại 5 tỉnh phía Bắc bằng kỹ thuật RT-PCR với tỷ lệ phát hiện đạt 80,43% trên tổng số mẫu nghi ngờ.
• Phân lập thành công 23 chủng CDV trên dòng tế bào Vero-DST, ghi nhận bệnh tích tế bào xuất hiện sau 24 - 36 giờ và hiệu giá đạt 1,44 x 10^2 đến 3,16 x 10^5 TCID50/ml.
• Xác định quy luật động học nhân lên của virus đạt đỉnh cực đại ở 48 - 60 giờ sau gây nhiễm với hàm lượng virus nội bào chiếm ưu thế.
• Giải mã thành công đoạn gene P kích thước 387 bp, chứng minh các chủng nghiên cứu có độ tương đồng nucleotide 93,00% - 99,4% và thuộc kiểu gen Asia 1.
• Cung cấp nguồn vật liệu di truyền và dữ liệu dịch tễ phân tử làm tiền đề chế tạo sinh phẩm chẩn đoán và vắc xin nhược độc nội địa trong vòng 12 - 24 tháng tới.

Quý độc giả, nhà khoa học và các cơ sở chuyên môn vui lòng tiếp cận toàn văn luận văn thạc sĩ của tác giả Lê Thị Hạnh tại thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam để khai thác chi tiết các dữ liệu quy chuẩn phục vụ công tác giảng dạy, điều trị và sản xuất sinh phẩm thú y.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP Ở PHÍA BẮC VIỆT NAM Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: GS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan.Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Hạnh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, sự động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi đươc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc GS.

Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo Khoa Thú Y, Bộ môn Bệnh lý thú y, Bệnh viện thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y- Bệnh viện thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành ơn tập thể lãnh đạo, Khoa Dịch vụ thú y- Trường Cao Đẳng Công nghệ và Môi Trường Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình công tác, học tập và thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Thị Hạnh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.

vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Danh mục đồ thị. ix Trích yếu luận văn.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Tình hình nghiên cứu bệnh care trong và ngoài nước.

Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước. Một số thông tin về virus care. Phân loại virus gây bệnh Care.

Hình thái của virus Care. Cấu trúc của virus Care. Sức đề kháng của virus Care. Cơ chế sinh bệnh.

Đặc tính sinh học của virus Care. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care. Một số thông tin về bệnh care. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care.

15 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Triệu chứng bệnh tích. Chẩn đoán bệnh Care. Phòng và điều trị bệnh.

Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Đối tượng/vật liệu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus Care phân lập được. Nghiên cứu một số đăc điểm sinh học phân tử của những chủng Virus Care phân lập được. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp quan sát, thống kê sinh họcxử lý số liệu bằng phần mềm excel. Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể. Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml).

Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus. Phương pháp Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh. Phương pháp RT-PCR và PCR. Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene.

Xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận. Thu thập mẫu chó mắc bệnh care và chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR. Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phương pháp RT-PCR.

Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus care phân lập được. Thông tin của những chủng virus Care phân lập được sử dụng trong nghiên cứu. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và hiệu giá của các chủng virus Care phân lập được. 40 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus phân lập được. Kết quả giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự axit amin của những chủng virus nghiên cứu.

So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu. So sánh mức độ tương đồng về trình tự axit amin giữa những chủng virus nghiên cứu. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử. Kết luận và kiến nghị.

56 Tài liệu tham khảo. 61 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó) CPE Cytophathogenic Effect (khả năng gây bệnh tích tế bào) CPV Canine Parvovirus (Virus gây bệnh Parvo ở chó) DAB 3,3-diaminobenzidine DNA Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic) EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (axít etylen diamin tetraaxetic) ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp miễn dịch gắn enzyme) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) FCS Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê) MOI Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) RNA Ribonucleic acid (Axít ribonucleic) RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược) SLS Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu) vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra. Chó mắc bệnh care theo các giống chó khác nhau.

Chó mắc bệnh care theo địa phương nghiên cứu khác nhau. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P. Kết quả chẩn đoán chó mắc Care bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR và PCR.

Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care. Bệnh tích đại thể của chó mắc care. Thông tin chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của các chủng virus Care.

Hiệu giá của các chủng virus Care phân lập. Các chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên. Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene P giữa những chủng virus Care nghiên. Sự tương đồng về axit amin mã hóa từ gene P giữa những chủng virus nghiên cứu.

53 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR chẩn đoán ca rê. Chó bỏ ăn, ho, sốt, có biểu hiện thần kinh. Chó mắc care sốt, ho, khó thở, dỉ mắt, mũi.

Chó tiêu chảy, phân màu cà phê. Hình ảnh thu mẫu và mổ khám chó mắc care. BK-HN05 Phổi viêm, xuất huyết, gan hóa. BK-HN06 Ruột xuất huyết, xung huyết chứa hơi căng phồng.

BH- HG06 Gan to xung huyết. Ph- HD04 Hạch lympho màng treo ruột sưng, tụ máu. CPE do CDV1-PHN gây ra sau 24 giờ gây nhiễm trên tế bào Vero-DST. CPE do CDV1-PHN gây ra sau 48 giờ gây nhiễm trên tế bào Vero-DST.

CPE do CDV1-PHN gây ra sau 36 giờ gây nhiễm trên tế bào Vero-DST. Tế bào Vero-DST không gây nhiễm virus Ca rê. Kết quả khuếch đại gene P phục vụ giải trình tự. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide gen Phosphor protein của chủng virus CDV1-PHN.

Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa những chủng virus nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự axitamin gen P của 3 chủng CDV nghiên cứu. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của những chủng virus Care nghiên cứu. 55 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.

Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng CDV1-PHN. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng CDV19-RHN. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng CDV28-HHN. 46 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Thị Hạnh Tên luận văn: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập ở Phía Bắc Việt Nam.

Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và lựa chọn được chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học phục vụ công tác chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Care. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp quan sát, thống kê sinh học; - Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể; - Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST; - Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml); - Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus; - Phương pháp Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh; - Phương pháp RT-PCR và PCR. Kết quả chính và kết luận 1.

Đã xác định được 37 chó mắc Care thuộc 5 giống khác nhau (Bắc Hà, Mông Cộc, Phú Quốc, Fox, Becgie) được thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam gồm Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Hải Dương và Hà Giang bằng phương pháp RT-PCR với các triệu chứng lâm sàng điển hình như gầy yếu, biếng ăn, ủ rũ, sốt, ho, tiêu chảy màu cà phê, nôn mửa, có dử mắt, dử mũi nhiều.