HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG ĐÌNH HUẤN XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC CỦA CHỦNG VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI TỈNH HƯNG YÊN TRÊN LỢN THÍ NGHIỆM Ngành: Thú y Mã số: 8.01 Người hướng dẫn khoa học: GS. Nguyễn Thị Lan TS. Trương Quang Lâm NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận văn Hoàng Đình Huấn i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc GS. Nguyễn Thị Lan và TS. Trương Quang Lâm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và bộ môn Bệnh lý thú y đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận văn Hoàng Đình Huấn ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan.
ii Mục lục. iii Danh mục các chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.
viii Trích yếu luận văn. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu chung.
Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả lợn Châu Phi trong và ngoài nước.
Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả lợn Châu Phi tại Việt Nam. Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả lợn Châu Phi ở nước ngoài. Virus gây bệnh Dịch tả lợn Châu Phi. Dịch tễ học.
Phương pháp chẩn đoán. Phòng bệnh. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. 21 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.
Động vật thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp gây bệnh cho lợn thí nghiệm. Phương pháp lấy máu.
Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể. Phương pháp ELISA. Phương pháp RT-PCR.
Phương pháp PCR. Phương pháp Realtime PCR. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.
Gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY cho lợn thí nghiệm. Kết quả kháng thể kháng virus DTLCP của lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm. Kết quả kiểm tra một số virus gây bệnh ở lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm. Kết quả đánh giá thân nhiệt và thể trạng của lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm.
Kết quả gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY cho lợn thí nghiệm. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn thí nghiệm sau gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY. 36 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn được gây nhiễm.
Kết quả kiểm tra virus huyết và bài thải virus chủng VNUA - ASFV – 02HY. Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn được gây nhiễm virus VNUA – ASFV – 02HY. Kết quả bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn thí nghiệm được gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY.
Kết luận và kiến nghị. 54 Tài liệu tham khảo. 54 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ ASF African swine fever Cs Cộng sự CSF Classical Swine Fever DNA DeoxyriboNucleic Acid DTLCP Dịch tả lợn Châu Phi ELISA Enzym Linked Immunorobent Assay PBS Phosphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRSV Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome Virus RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Khả năng tồn tại của virus DTLCP trong nhiều điều kiện môi trường.
Thông tin của chủng virus VNUA - ASFV – 02HY. Thành phần phản ứng RT-PCR. Thành phần phản ứng PCR. Kết quả hàm lượng kháng thể kháng virus DTLCP của lợn thí nghiệm bằng phương pháp ELISA.
Kết quả xét nghiệm sự có mặt của một số virus bằng phương pháp Realtime PCR/RT-PCR/PCR. Kết quả giá trị Ct của phương pháp Realtime PCR trên mẫu máu lợn thí nghiệm sau gây nhiễm chủng virus VNUA - ASFV – 02HY. Kết quả đo thân nhiệt trước khi gây nhiễm (0C). Thân nhiệt của lợn thí nghiệm sau khi gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY.
Triệu chứng lâm sàng của lợn thí nghiệm được gây nhiễm chủng virus VNUA - ASFV – 02HY. Kết quả giá trị Ct mẫu máu lợn thí nghiệm theo thời gian sau gây nhiễm chủng virus VNUA - ASFV – 02HY. Kết quả phương pháp Realtime PCR phát hiện virus VNUA - ASFV - L01 với mẫu swab phân và dịch nước bọt của lợn thí nghiệm theo thời gian sau gây nhiễm. Kết quả kiểm tra sự đồng nhiễm các virus khác của lợn thí nghiệm chết.
Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY. Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm. 50 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2. Tình hình DTLCP ở Châu Á (từ tháng 8 năm 2018 đến nay).
Ảnh hình thái cấu trúc virus Dịch tả lợn Châu Phi. Tóm tắt sơ đồ lây lan của bệnh DTLCP. Mối nguy chính gây lây nhiễm bệnh DTLCP với lợn nuôi. Các đường lây nhiễm bệnh DTLCP và cách phòng ngừa hiệu quả.
Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY. Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm được gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY (tiếp). Một số cơ quan nội tạng của lợn đối chứng. Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY.
Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY (tiếp). Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY (tiếp). 53 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Đình Huấn Tên luận văn: Xác định độc lực của chủng virus dịch tả lợn Châu Phi phân lập được tại tỉnh Hưng Yên trên lợn thí nghiệm Ngành: Thú y Mã số: 8.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định được khả năng gây bệnh của chủng virus VNUA – ASFV – 02HY phân lập được tại tỉnh Hưng Yên trên lợn thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu: Gây bệnh thực nghiệm cho lợn thí nghiệm bằng chủng virus VNUA – ASFV – 02HY.
Xác định triệu chứng lâm sàng của lợn thí nghiệm. Nghiên cứu biến đổi bệnh tích đại thể và vi thể của lợn thí nghiệm. Xác định sự bài thải của chủng virus VNUA – ASFV – 02HY trong dịch tiết (swab phân, dịch nước bọt) bằng phương pháp Realtime - PCR. Đối tượng nghiên cứu là chủng virus VNUA – ASFV – 02HY.
Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: Máy đúc tự động, máy cắt Microton, máy li tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel, tủ lạnh, máy đo thân nhiệt điện tử, kính hiển vi, tủ -800C, máy votex, tủ ấm 370C, máy ủ, máy đọc ELISA. Hóa chất dùng trong nghiên cứu: Formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, dung dịch PBS, Red Gel, thạch Agarose, bộ kít ELISA của hãng Ingenasa, bộ kít tách chiết của hãng Promega, kit QIAGEN OneStep RT-PCR Kit. Nghiên cứu sử dụng các phương pháp như: Phương pháp gây bệnh cho lợn thí nghiệm; Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể; Phương pháp làm tiêu bản vi thể; Phương pháp ELISA; Phương pháp Realtime - PCR, RT - PCR; Phương pháp PCR. Kết quả chính và kết luận 1.
Chủng virus VNUA – ASFV – 02HY có khả năng gây bệnh cho 4/4 lợn thí nghiệm. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu là sốt cao (41,0 đến 42,50C), ủ rũ, mệt mỏi, suy hô hấp và xuất huyết ngoài da, là triệu chứng điển hình của bệnh dịch tả lợn Châu Phi. Sau ngày thứ 2 gây nhiễm bắt đầu có sự xuất hiện virus trong máu ở cả 4 lợn thí nghiệm và virus nhân lên mạnh trong máu từ ngày 3-6 sau gây nhiễm. Có mối tương quan giữa triệu chứng sốt cao và khả năng nhân lên của chủng virus VNUA – ASFV – 02HY ở lợn được gây nhiễm.
Xác định sự bài thải chủng virus VNUA – ASFV – 02HY qua dịch tiết (swab phân và dịch nước bọt) lợn được gây nhiễm, kết quả cho thấy sau 5 ngày gây nhiễm đã ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phát hiện được virus trong dịch tiết của lợn thí nghiệm, sự bài thải liên tục đến khi lợn thí nghiệm chết. Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus VNUA – ASF – 02HY chủ yếu là xuất huyết ở các cơ quan nội tạng gồm các hạch lympho, lách, dạ dày, ruột, thận, phổi, não và tích dịch ở các xoang cơ thể.