Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus TGEV và PEDV dùng trong sản xuất vacxin nhược độc

Chuyên khảo phân tích Luận văn một số đặc tính sinh học của chủng tgev transmissible gastroenteritis virus và pedv, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giáp
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Một số đặc tính sinh học của chủng TGEV (transmissible gastroenteritis virus) và PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 2. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 3.1. Mục tiêu chung
• 3.2. Mục tiêu cụ thể
• 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS
• 5.1.1. Tình hình nghiên cứu về PEDV, TGEV tại Việt Nam
• 5.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus TGEV PEDV

Ngành chăn nuôi đóng góp lớn vào kinh tế Việt Nam, với chăn nuôi lợn chiếm vị trí quan trọng. Để bảo vệ đàn lợn khỏi các bệnh nguy hiểm như tiêu chảy do Virus TGEV và Virus PEDV, việc nghiên cứu và sản xuất vacxin nhược độc hiệu quả là vô cùng cần thiết. Hiện nay, các loại vacxin đang sử dụng thường là vacxin nhập khẩu hoặc auto vacxin, chưa thực sự phù hợp với các chủng virus lưu hành tại Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu các chủng virus địa phương và phát triển vacxin phù hợp là một yêu cầu cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá đặc tính sinh học virus của TGEV và PEDV để phục vụ cho quá trình sản xuất vacxin.

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu TGEV và PEDV

Bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) và tiêu chảy cấp ở lợn (PED) gây ra những thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi. Việc hiểu rõ cơ chế gây bệnh và đường truyền lây nhiễm của TGEV và PEDV là yếu tố then chốt để phát triển các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Nghiên cứu này sẽ cung cấp những thông tin quan trọng về đặc tính sinh học của hai loại virus này, từ đó góp phần vào việc xây dựng các chiến lược phòng chống dịch bệnh phù hợp.

1.2. Mục tiêu và ý nghĩa của nghiên cứu sản xuất vacxin

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá các đặc tính sinh học của chủng virus TGEV và PEDV phân lập tại Việt Nam, từ đó lựa chọn các chủng phù hợp cho việc sản xuất vacxin nhược độc. Vacxin được tạo ra từ các chủng virus địa phương sẽ có khả năng bảo hộ tốt hơn so với các vacxin nhập khẩu, do có sự tương đồng về di truyền với các chủng virus đang lưu hành. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại vacxin hiệu quả, góp phần bảo vệ sức khỏe đàn lợn và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Vacxin Nhược Độc TGEV PEDV

Việc sản xuất vacxin nhược độc phòng bệnh TGEV và PEDV đối mặt với nhiều thách thức. Một trong số đó là sự biến đổi di truyền nhanh chóng của virus, dẫn đến sự xuất hiện của các biến chủng virus mới. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải liên tục cập nhật thông tin về các chủng virus đang lưu hành và điều chỉnh công thức vacxin cho phù hợp. Bên cạnh đó, việc đảm bảo độ an toàn vacxin và hiệu quả bảo hộ vacxin cũng là những yếu tố quan trọng cần được quan tâm. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc giải quyết những thách thức này, nhằm tạo ra các loại vacxin an toàn và hiệu quả.

2.1. Sự biến đổi di truyền của virus và ảnh hưởng đến vacxin

Virus TGEV và Virus PEDV có khả năng biến đổi di truyền rất nhanh, dẫn đến sự xuất hiện của các biến chủng virus mới. Các biến chủng này có thể có độc lực khác nhau và khả năng kháng lại các loại vacxin hiện có. Do đó, việc theo dõi sự biến đổi di truyền của virus và cập nhật thông tin về các chủng virus đang lưu hành là vô cùng quan trọng để đảm bảo hiệu quả của vacxin. Các nghiên cứu về phân tích di truyền và giải trình tự gen đóng vai trò then chốt trong việc xác định các biến chủng virus mới.

2.2. Đảm bảo an toàn và hiệu quả của vacxin nhược độc

Vacxin nhược độc có ưu điểm là tạo ra miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài, nhưng cũng tiềm ẩn nguy cơ gây bệnh cho vật nuôi nếu virus không được nhược độc hoàn toàn. Do đó, việc kiểm tra độ an toàn vacxin là vô cùng quan trọng. Bên cạnh đó, hiệu quả bảo hộ vacxin cũng cần được đánh giá kỹ lưỡng thông qua các thử nghiệm lâm sàng trên động vật. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc phát triển các quy trình kiểm tra chất lượng vacxin nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn và hiệu quả.

III. Phương Pháp Đánh Giá Đặc Tính Sinh Học Virus TGEV PEDV

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để đánh giá đặc tính sinh học virus của TGEV và PEDV. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy virus, phân lập virus, đánh giá độc lực virus, đánh giá an toàn vacxin, và đánh giá hiệu quả bảo hộ vacxin. Ngoài ra, các kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật PCR, kỹ thuật ELISA, và giải trình tự gen cũng được sử dụng để phân tích di truyền virus và xác định các đột biến gen. Kết quả từ các phương pháp này sẽ cung cấp thông tin toàn diện về đặc tính sinh học của virus, giúp lựa chọn các chủng phù hợp cho việc sản xuất vacxin.

3.1. Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập virus TGEV PEDV

Nuôi cấy virus là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu đặc tính sinh học virus. TGEV và PEDV được nuôi cấy trên các tế bào chủ phù hợp, sau đó được phân lập để thu được các chủng virus thuần khiết. Quá trình nuôi cấy và phân lập cần được thực hiện trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt để tránh nhiễm tạp. Hiệu quả của quá trình nuôi cấy và phân lập được đánh giá bằng cách xác định hiệu giá virus.

3.2. Đánh giá độc lực và an toàn của chủng virus

Sau khi phân lập, độc lực virus cần được đánh giá để xác định khả năng gây bệnh của virus. Đánh giá độc lực virus thường được thực hiện bằng cách gây nhiễm virus cho động vật thí nghiệm và theo dõi các triệu chứng lâm sàng. Đánh giá an toàn vacxin cũng được thực hiện tương tự, nhưng với các chủng virus đã được nhược độc. Mục tiêu là đảm bảo rằng vacxin không gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng cho vật nuôi.

3.3. Phân tích di truyền và xác định đột biến gen

Phân tích di truyền và giải trình tự gen là các kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng giúp xác định các đột biến gen trong bộ gen virus. Các đột biến gen có thể ảnh hưởng đến độc lực virus, khả năng lây nhiễm, và khả năng kháng lại vacxin. Việc xác định các đột biến gen giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của virus và phát triển các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Sản Xuất Vacxin Nhược Độc Đa Giá

Kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học virus của TGEV và PEDV sẽ được ứng dụng để sản xuất vacxin nhược độc đa giá. Vacxin này sẽ có khả năng phòng ngừa đồng thời cả hai bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và tiêu chảy cấp ở lợn. Việc sử dụng vacxin đa giá sẽ giúp giảm chi phí và công sức tiêm phòng, đồng thời nâng cao hiệu quả phòng bệnh. Vacxin được sản xuất sẽ trải qua quá trình kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo độ an toàn vacxin và hiệu quả bảo hộ vacxin.

4.1. Quy trình sản xuất vacxin nhược độc đa giá

Quy trình sản xuất vacxin nhược độc đa giá bao gồm nhiều bước, từ việc lựa chọn chủng virus phù hợp, nuôi cấy virus, nhược độc virus, đến việc phối trộn các chủng virus và đóng gói sản phẩm. Mỗi bước trong quy trình đều cần được thực hiện theo các tiêu chuẩn nghiêm ngặt để đảm bảo chất lượng vacxin. Quá trình nhược độc virus thường được thực hiện bằng cách tiếp đời virus nhiều lần trên các tế bào chủ khác nhau.

4.2. Kiểm định chất lượng và đánh giá hiệu quả vacxin

Vacxin sau khi sản xuất cần được kiểm định chất lượng để đảm bảo đáp ứng các tiêu chuẩn về độ an toàn vacxin, hiệu lực vacxin, và độ ổn định vacxin. Đánh giá hiệu quả vacxin được thực hiện thông qua các thử nghiệm lâm sàng trên động vật thí nghiệm. Các thử nghiệm lâm sàng giúp xác định khả năng bảo vệ của vacxin chống lại sự lây nhiễm virus và mức độ giảm nhẹ các triệu chứng bệnh.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Ổn Định Di Truyền Của Virus

Nghiên cứu đã đánh giá đặc tính ổn định di truyền của các chủng virus TGEV và PEDV được sử dụng để sản xuất vacxin. Kết quả cho thấy các chủng virus này có tính ổn định cao trong quá trình tiếp đời, ít xảy ra các đột biến gen làm thay đổi độc lực virus hoặc khả năng lây nhiễm. Điều này đảm bảo rằng vacxin được sản xuất từ các chủng virus này sẽ có hiệu quả bảo hộ ổn định và kéo dài.

5.1. Phân tích trình tự gen và so sánh các chủng virus

Phân tích trình tự gen được sử dụng để so sánh bộ gen của các chủng virus TGEV và PEDV khác nhau. Việc so sánh trình tự gen giúp xác định các vùng gen có tính ổn định cao và các vùng gen dễ bị đột biến. Các vùng gen có tính ổn định cao thường được sử dụng làm mục tiêu cho việc phát triển các xét nghiệm chẩn đoán và vacxin.

5.2. Đánh giá sự thay đổi trình tự nucleotide và amino acid

Nghiên cứu đã đánh giá sự thay đổi trình tự nucleotide và amino acid trong bộ gen virus qua nhiều lần tiếp đời. Kết quả cho thấy sự thay đổi trình tự là rất ít, chứng tỏ tính ổn định di truyền cao của các chủng virus được sử dụng. Sự ổn định này là yếu tố quan trọng để đảm bảo hiệu quả và an toàn của vacxin.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Vacxin TGEV PEDV

Nghiên cứu đã thành công trong việc đánh giá đặc tính sinh học virus của TGEV và PEDV, cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất vacxin nhược độc đa giá. Vacxin này hứa hẹn sẽ là một công cụ hiệu quả để phòng ngừa bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và tiêu chảy cấp ở lợn tại Việt Nam. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải tiến công thức vacxin, nâng cao hiệu quả bảo hộ và giảm thiểu các tác dụng phụ.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đã xác định được các chủng virus TGEV và PEDV có tính ổn định di truyền cao và độc lực phù hợp cho việc sản xuất vacxin nhược độc. Vacxin được tạo ra từ các chủng virus này có khả năng bảo vệ đàn lợn khỏi bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và tiêu chảy cấp ở lợn, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và cải tiến vacxin

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải tiến công thức vacxin, ví dụ như sử dụng các tác nhân tăng cường miễn dịch để nâng cao hiệu quả bảo hộ. Ngoài ra, cần nghiên cứu về miễn dịch học để hiểu rõ hơn về cơ chế bảo vệ của vacxin và phát triển các loại vacxin thế hệ mới có khả năng tạo ra miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi giữ vai trò then chốt khi đóng góp khoảng 25% vào tổng thu nhập quốc nội của ngành nông nghiệp Việt Nam, trong đó chăn nuôi lợn chiếm tới 78% tổng sản lượng. Theo thống kê, tổng đàn lợn cả nước duy trì ở quy mô trên 28 triệu con, kéo theo nhu cầu cấp thiết về hàng chục triệu liều vacxin mỗi năm nhằm kiểm soát các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Trong số các nguyên nhân gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng nhất, dịch tiêu chảy cấp do Porcine Epidemic Diarrhea Virus và bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm do Transmissible Gastroenteritis Virus gây ra tỷ lệ tử vong từ 80% đến 100% ở lợn con theo mẹ. Các loại vacxin nhập khẩu hiện nay chủ yếu sử dụng các chủng virus cổ điển từ nước ngoài, dẫn đến sự khác biệt di truyền lớn và làm giảm hiệu quả bảo hộ chéo trước các chủng thực địa đang lưu hành tại Việt Nam.

Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá toàn diện các đặc tính sinh học của hai chủng virus giống gồm AVAC/VR/PED.98 ở đời cấy chuyển thứ 100 và AVAC/VR/TGE.15 ở đời cấy chuyển thứ 130. Mục tiêu trọng tâm là xác định độ ổn định hiệu giá, chứng minh tính nhược độc hóa trên mô hình lợn sơ sinh mẫn cảm và đánh giá sự ổn định di truyền của gen kháng nguyên bề mặt. Đề tài được triển khai từ ngày 01 tháng 10 năm 2018 đến ngày 30 tháng 09 năm 2019 tại Công ty TNHH Một thành viên AVAC Việt Nam và Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học tin cậy để sản xuất vacxin nhược độc nhị giá đông khô nội địa, mở ra hướng đi tự chủ sinh phẩm thú y và giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng vi sinh vật học thú y, dịch tễ học phân tử và miễn dịch học đường tiêu hóa. Cả Porcine Epidemic Diarrhea Virus và Transmissible Gastroenteritis Virus đều thuộc giống Alphacoronavirus trong họ Coronaviridae, sở hữu bộ gen RNA sợi đơn dương có kích thước lần lượt khoảng 28 kb và 30 kb.

Khung lý thuyết tập trung vào cấu trúc và chức năng của Spike glycoprotein, tức protein S, với khối lượng phân tử từ 180 kDa đến 220 kDa. Protein S đóng vai trò quyết định trong việc nhận diện và liên kết với thụ thể Aminopeptidase N trên bề mặt niêm mạc ruột non của lợn, đồng thời kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa. Đối với Transmissible Gastroenteritis Virus, các vị trí kháng nguyên chính A, B, C và D trên protein S chịu trách nhiệm tạo miễn dịch đặc hiệu. Đối với Porcine Epidemic Diarrhea Virus, vùng S1 chứa các epitope trung hòa then chốt. Cơ chế làm giảm độc lực dựa trên hiện tượng đột biến thích nghi khi cấy chuyển liên tục virus trên các dòng tế bào nuôi cấy nhân tạo, làm thay đổi cấu trúc gen S và gen phụ trợ ORF3, giúp virus mất khả năng gây bệnh lâm sàng nhưng vẫn bảo tồn hoàn toàn tính sinh miễn dịch.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm bao gồm các mẫu virus tiếp đời liên tiếp của hai chủng AVAC/VR/PED.98 từ đời 37 đến 150 trên dòng tế bào Vero và AVAC/VR/TGE.15 từ đời 5 đến 150 trên dòng tế bào tinh hoàn lợn ST. Cỡ mẫu đánh giá an toàn sinh học gồm các lô lợn sơ sinh khỏe mạnh chưa bú sữa đầu, được chọn mẫu ngẫu nhiên và đã kiểm tra âm tính tuyệt đối với mầm bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Lợn được nuôi cách ly hoàn toàn và dự phòng nhiễm khuẩn kế phát trước khi tiến hành thử nghiệm.

Các phương pháp phân tích chuyên sâu được lựa chọn dựa trên cơ sở khoa học chuẩn hóa quốc tế:

• Phương pháp chuẩn độ virus qua pha loãng tới hạn cơ số 10 trên đĩa 96 giếng và tính toán hiệu giá TCID50 theo công thức Spearman-Karber, giúp xác định chính xác hoạt lực virus ở từng lần tiếp đời.
• Phương pháp gây bệnh thực nghiệm với liều chuẩn 10 mũ 5,0 TCID50/ml trên lợn sơ sinh để theo dõi triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể ở đường ruột sau 72 giờ gây nhiễm.
• Phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối theo công thức 2 mũ âm delta delta CT nhằm đo lường chính xác động thái bài thải virus qua phân và mức độ phân bố virus tại các đoạn ruột.
• Phương pháp giải trình tự gen Sanger thế hệ mới sử dụng hệ thống 5 cặp mồi gối đầu đặc hiệu khuếch đại toàn bộ gen S, kết hợp phân tích tin sinh học bằng phần mềm BioEdit và MEGA để dựng cây phát sinh loài.

Quá trình phân tích được thực hiện liên tục trong khung thời gian 12 tháng từ cuối năm 2018 đến cuối năm 2019 nhằm đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy tuyệt đối của toàn bộ số liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện khoa học quan trọng:

Thứ nhất, hiệu giá virus của hai chủng giống duy trì ở mức rất cao và ổn định qua các lần tiếp đời. Chủng AVAC/VR/PED.98 đạt hiệu giá dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ml trên tế bào Vero, trong khi chủng AVAC/VR/TGE.15 đạt từ 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ml trên tế bào ST. Mức độ dao động hiệu giá giữa các đời tiếp cận không vượt quá 1 log10 TCID50/ml, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn sản xuất công nghiệp.

Thứ hai, tính nhược độc hóa được chứng minh an toàn tuyệt đối trên mô hình lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu. Sau 72 giờ gây nhiễm liều cao, 100% lợn ở nhóm virus nhược độc không biểu hiện bất kỳ triệu chứng nôn mửa hay tiêu chảy nào, thành ruột và nhung mao ruột duy trì cấu trúc sinh lý bình thường. Ngược lại, nhóm đối chứng dùng virus cường độc có tỷ lệ mắc bệnh 100%, tỷ lệ chết trên 80%, thành ruột mỏng trong suốt và nhung mao ruột bị teo nghiêm trọng.

Thứ ba, sự bài thải và phân bố virus ở đường tiêu hóa giảm rõ rệt. Kết quả realtime RT-PCR định lượng cho thấy tải lượng virus nhược độc bài thải qua phân thấp hơn từ 100 đến 1000 lần so với chủng cường độc, đồng thời mức độ cư trú tại niêm mạc tá tràng, không tràng và hồi tràng giảm nhanh sau 48 giờ.

Thứ tư, tính ổn định di truyền của gen S được duy trì vững chắc qua 20 lần cấy chuyển liên tiếp. Độ tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid suy diễn giữa các đời cấy chuyển đạt trên 99,8%, không xuất hiện bất kỳ đột biến đảo ngược nào có nguy cơ làm tăng lại độc lực virus.

Thảo luận kết quả

Độ ổn định cao về hiệu giá và khả năng tạo bệnh tích tế bào đặc trưng của hai chủng virus bắt nguồn từ quy trình thích nghi tối ưu trên môi trường tế bào nuôi cấy được bổ sung trypsin ở nồng độ thích hợp từ 3 đến 10 µg/ml. Việc virus duy trì được cấu trúc hợp bào điển hình trên tế bào Vero đối với PEDV và các đám tế bào co tròn đối với TGEV chứng minh chu trình nhân lên diễn ra thuận lợi mà không làm suy giảm hoạt lực kháng nguyên.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, chủng AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 thể hiện mức độ suy giảm độc lực tương đương với chủng P-5V của Nhật Bản và DR13 của Hàn Quốc. Tuy nhiên, hai chủng giống trong nghiên cứu này sở hữu ưu thế vượt trội nhờ sự tương đồng di truyền cao với các biến thể thực địa đang lưu hành tại các vùng chăn nuôi trọng điểm của Việt Nam, nơi các nghiên cứu dịch tễ trước đó ghi nhận sự biến đổi hơn 10% amino acid ở protein S so với các chủng vacxin nhập ngoại.

Các dữ liệu thực nghiệm có thể được hệ thống hóa trực quan thông qua biểu đồ đường thể hiện biến thiên hiệu giá virus qua các thế hệ cấy chuyển, bảng tổng hợp phân loại mức độ tổn thương bệnh lý đại thể và vi thể, cùng sơ đồ cây phát sinh chủng loại phân tử xây dựng bằng thuật toán Neighbor-Joining để chứng minh mức độ quan hệ họ hàng di truyền gần gũi của chủng nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, bốn nhóm khuyến nghị hành động cụ thể được đề xuất nhằm nhanh chóng chuyển giao kết quả vào thực tiễn:

• Ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất vacxin nhược độc nhị giá đông khô: Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y, cụ thể là Công ty AVAC, cần hoàn thiện dây chuyền nuôi cấy quy mô lớn trên hệ thống Bioreactor trước quý II năm 2020, đảm bảo kiểm soát nồng độ trypsin để giữ hiệu giá thành phẩm luôn đạt trên mức 7,5 log10 TCID50/ml cho mỗi liều vacxin.
• Chuẩn hóa hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm giống gốc: Phòng kiểm nghiệm chất lượng cần ban hành quy chuẩn kiểm soát định kỳ đối với các lô giống virus qua 20 lần tiếp đời, sử dụng phương pháp giải trình tự gen S và realtime RT-PCR định lượng tương đối để đảm bảo độ thuần khiết và ổn định di truyền đạt mức 100%.
• Mở rộng thử nghiệm lâm sàng thực địa: Nhóm nghiên cứu cần phối hợp với các cơ sở chăn nuôi thực hiện khảo sát trên quy mô tối thiểu 500 lợn nái chửa tại các tỉnh như Hưng Yên, Thái Bình và Tiền Giang trong vòng 6 tháng, nhằm đánh giá hiệu giá kháng thể IgA tiết trong sữa đầu và đo lường tỷ lệ bảo hộ sống sót của lợn con đạt mục tiêu trên 90%.
• Hoàn thiện thủ tục cấp phép và khuyến cáo sử dụng: Cục Thú y và các cơ quan chuyên trách cần xây dựng văn bản hướng dẫn quy trình tiêm phòng vacxin nhược độc đa giá nội địa cho đàn nái ở giai đoạn mang thai từ tuần thứ 12 đến tuần thứ 14, nhằm thay thế dần các nguồn vacxin nhập khẩu và giảm từ 30% đến 40% chi phí phòng bệnh cho các trang trại.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và số liệu khoa học của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho nhiều nhóm chuyên môn:

• Các nhà khoa học, giảng viên và nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y, Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp phương pháp luận chặt chẽ về phân lập, làm nhược độc virus và thiết kế mồi PCR giải trình tự gen phục vụ công tác đào tạo và nghiên cứu chuyên sâu.
• Đội ngũ chuyên viên nghiên cứu và phát triển sản phẩm tại các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vắc xin: Tài liệu cung cấp các thông số kỹ thuật chi tiết về điều kiện nuôi cấy tế bào Vero, tế bào ST và các chỉ số Spearman-Karber phục vụ trực tiếp quá trình mở rộng quy mô sản xuất.
• Bác sĩ thú y, cán bộ kỹ thuật tại các chi cục thú y và trạm chẩn đoán dịch bệnh: Giúp nâng cao hiểu biết về đặc tính dịch tễ, bệnh lý học đường tiêu hóa do Coronavirus và cơ chế phân bố, bài thải virus để xây dựng các kịch bản kiểm soát dịch tễ hiệu quả.
• Chủ trang trại chăn nuôi lợn quy mô công nghiệp và kỹ sư quản lý trại giống: Luận văn giúp người chăn nuôi hiểu rõ bản chất miễn dịch truyền qua sữa mẹ, từ đó xây dựng lịch tiêm phòng hợp lý cho đàn nái nhằm bảo vệ đàn lợn con ngay từ giai đoạn sơ sinh.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần nghiên cứu làm nhược độc các chủng virus PEDV và TGEV phân lập tại Việt Nam?
Các chủng virus lưu hành ngoài thực địa tại Việt Nam có sự biến đổi di truyền đáng kể ở gen S, khác biệt trên 10% amino acid so với các chủng vacxin nhập ngoại cổ điển. Việc nghiên cứu làm nhược độc chủng nội địa AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 giúp tạo ra vacxin có tính tương đồng kháng nguyên cao, mang lại khả năng bảo hộ chéo vượt trội cho đàn lợn trong nước.

Hai chủng virus nhược độc trong nghiên cứu có đảm bảo an toàn tuyệt đối cho lợn sơ sinh không?
Thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu với liều cao 10 mũ 5,0 TCID50/ml cho thấy 100% lợn khỏe mạnh, không bị tiêu chảy hay nôn mửa, niêm mạc ruột hoàn toàn nguyên vẹn. Ngược lại, nhóm đối chứng dùng virus cường độc có tỷ lệ chết lên tới hơn 80%, khẳng định tính nhược độc an toàn tuyệt đối của chủng giống.

Đặc tính ổn định hiệu giá qua các lần tiếp đời có ý nghĩa gì đối với việc sản xuất vacxin?
Hiệu giá của hai chủng virus luôn duy trì ổn định ở mức từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ml với PEDV và từ 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ml với TGEV qua hàng chục lần cấy chuyển. Sự biến động không vượt quá 1 log10 bảo đảm quy trình sản xuất vacxin quy mô công nghiệp luôn đạt hoạt lực đồng đều giữa các lô thương phẩm.

Cơ chế bảo vệ của vacxin nhược độc đối với lợn con theo mẹ diễn ra như thế nào?
Vacxin tiêm cho lợn nái chửa sẽ kích thích cơ thể mẹ sản sinh lượng lớn kháng thể đặc hiệu, đặc biệt là kháng thể IgA và IgG. Khi lợn con bú sữa đầu trong 24 đến 48 giờ đầu đời, lượng kháng thể này sẽ phủ lên niêm mạc ruột non, trung hòa trực tiếp mầm bệnh và bảo vệ lợn con khỏi nguy cơ nhiễm tiêu chảy cấp.

Phương pháp sinh học phân tử nào được dùng để xác nhận độ ổn định di truyền của virus?
Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger cho toàn bộ đoạn gen S với hệ thống 5 cặp mồi gối đầu, kết hợp phân tích căn chỉnh chuỗi bằng phần mềm BioEdit và xây dựng cây phát sinh loài trên phần mềm MEGA. Kết quả chứng minh độ tương đồng nucleotide đạt trên 99,8% qua 20 đời tiếp nối liên tiếp.

Kết luận

• Đã tuyển chọn và đánh giá thành công hai chủng giống virus nhược độc đạt chuẩn gồm AVAC/VR/PED.98 ở đời P100 và AVAC/VR/TGE.15 ở đời P130 phục vụ sản xuất vacxin.
• Hiệu giá virus duy trì ổn định ở mức cao, đạt 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ml trên tế bào Vero đối với PEDV và 8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ml trên tế bào ST đối với TGEV.
• Chứng minh tính nhược độc an toàn tuyệt đối trên mô hình lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu, không gây triệu chứng lâm sàng và giảm thiểu sự bài thải mầm bệnh qua phân.
• Xác lập tính ổn định di truyền bền vững của gen S với độ tương đồng trình tự đạt trên 99,8% qua 20 lần cấy chuyển liên tiếp in vitro.
• Cung cấp luận cứ khoa học vững chắc và quy trình công nghệ hoàn chỉnh để đưa vacxin nhược độc nhị giá phòng bệnh PED và TGE vào sản xuất thương mại tại Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo trong giai đoạn 12 đến 18 tháng tới là hoàn tất các thủ tục khảo nghiệm chất lượng diện rộng và đăng ký lưu hành sản phẩm. Các đơn vị nghiên cứu và trang trại chăn nuôi cần chủ động tiếp cận, ứng dụng các giải pháp phòng bệnh bằng vacxin đa giá nội địa nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế và xây dựng nền chăn nuôi an toàn sinh học bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi hiện chiếm 25% trong đóng góp của ngành nông nghiệp vào tổng thu nhập quốc nội. Đây cũng là ngành giữ vai trò then chốt trong cơ cấu ngành nông nghiệp, trong số các hoạt động chăn nuôi, chăn nuôi lợn là hoạt động chủ đạo, đóng góp 78% tổng sản lượng chăn nuôi. Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 2018, nước ta có trên 28 triệu con lợn , trong khi đó mỗi ná i trung bình đẻ 10 con/lứa. Như vâ ̣y để tiêm phòng đủ tổng đàn với liệu trình 2 liều/ con/lứa đẻ, thì chúng ta cần tới vài triệu liều vacxin phòng bệnh PED và TGE.

Hiện nay, để phòng chống bệnh tiêu chảy trên lơ ̣n do virus TGE và PED gây ra, 3 dòng vacxin phổ biến thường được sử dụng đó là vacxin vô hoa ̣t, vacxin nhươ ̣c đô ̣c và auto vacxin. Vacxin vô hoa ̣t có hiê ̣u quả thấ p, trong khi auto vacxin thường đươ ̣c sử du ̣ng ở các công ty lớn , đem la ̣i hiê ̣u quả cao , tuy nhiên thường chỉ đươ ̣c sử du ̣ng nô ̣i bô ̣. Các vacxin PED đơn giá hoặc đa giá PED và TGE hiện trên thị trường đều từ các hãng nổi tiếng như Intervet, Borhinger hay Merial, các chủng virus sử dụng để sản xuất vacxin là các chủng virus thuộc nhóm cổ điển, không phải là các chủng virus có nguồn gốc từ Việt Nam. Sự khác biê ̣t về di truyề n giữa các chủng vac xin và các chủng thực điạ dẫn đến khả năng bảo hộ của các vacxin PED chỉ ở mức đô ̣ thấ p hoă ̣c trung bình.

Do sự đa dạng và biến đổi nhanh chóng của các chủ ng virus dẫn đến khả năng bảo hô ̣ chéo bị giới hạn khi có các chủng virus khác nhau xâm nhiễm ,vacxin từ các chủng virus PED, TGE đươ ̣c phân lâ ̣p ở Việt Nam sẽ có khả năng bảo hộ tốt do tin ́ h tương đồ ng về di truyề n. Vì vậy,việc phân lập các chủng virus ngoài thực địa đồng thời đánh giá các đặc tính sinh học của virus để sản xuất vacxin là cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài “Một số đặc tính sinh học của chủngTGEV (transmissible gastroenteritis virus) và PEDV (porcine epidemic diarrhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Mục tiêu chung: đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của 2 chủng virus TGEV và PEDV dùng sản xuất vacxin nhược độc.

1 - Mục tiêu cụ thể: +) Đánh giá đă ̣c tiń h ổn định hiệu giá của giố ng virus vacxin. +) Đánh giá được tính nhược độc của hai chủng giố ng virus. +) Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng giố ng virus. Ý NGHĨA KHOA HỌC - Kết quả của đề tài là cơ sở để sử dụng 2 chủng giống TGEV và PEDV làm giống gốc cho nghiên cứu sản xuất vacxin nhược độc nhị giá.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS Trên thế giới các nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở lợn đã chỉ ra các tác nhân virus gây tiêu chảy chủ yếu gồm: Coronavirus và Rotavirus, Parvovirus. Trong đó Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) và Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) là 2 virus thuộc nhóm coronavirus, là hai virus gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp ở lợn. Ở Việt Nam có ít nghiên cứu về virus gây tiêu chảy đặc biệt là TGEV gây bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm và PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn.

Tình hình nghiên cứu về PEDV, TGEV tại Việt Nam Nghiên cứu về một số yếu tố liên quan và đặc điểm bệnh học của bệnh PED tại một số tỉnh phía Nam(Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012) đã tiến hành khảo sát 110 trại đang xảy ra bệnh tiêu chảy cấp đặc trưng trên lợn ở mọi lứa tuổi. Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên lợn con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và 81,67%). Hai tỷ lệ này giảm dần theo lứa tuổi. Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh gồm có khoảng cách đến với trại lợn bị bệnh, quy mô chăn nuôi, vệ sinh sát trùng và nguồn nước sử dụng.

Triệu chứng lâm sàng của bệnh PED: 100% tiêu chảy phân lỏng, 90,33% ói mửa. Bệnh tích thường gặp: 94,42% có biểu hiện dạ dày căng phồng, chứa nhiều thức ăn không tiêu và 86,33% thành ruột mỏng, phồng to, chứa nhiều nước và dịch chất bên trong. Cũng trong năm 2012, 2 tác giả này cũng tiến hành nghiên cứu các chủng PEDV tại miền Nam Việt Nam, kết quả cho thấy sự khác biệt lớn về trình tự nucleotide của gen S với các chủng tham chiếu khác phân lập ở châu Âu (Br1 / 87, CV777) và ở Hàn Quốc (Spk1, Chinju99, DR13 và KNU-0801). Nghiên cứu còn chỉ ra rằng các chủng PEDV Việt Nam hiện tại giống với các chủng phân lập Trung Quốc (JS-2004-2 và DX), Thái Lan (07NP01, 08NP02 và 08CB01) và gần đây là các chủng phân lập được tại Hàn Quốc (KNU-0802 và CPF299).

Các chủng PEDV phân lập được tại Việt Nam hiện tại có thểcó nguồn gốc từ cùng một tổ tiên của Trung Quốc trải qua biến thể di truyền và có thể hình thành một chủng PEDV mới tại Việt Nam. 3 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn ở một số tỉnh phía Bắc (Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Giang, Bắc Ninh và Hà Nội) cho biết lợn có biểu hiện tiêu chảy ở mọi lứa tuổi, điều trị bằng kháng sinh không hiệu quả, tỷ lệ chết tập trung ở lợn con theo mẹ (Nguyễn Văn Điệp và cs. Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán virus PED, TGE và Rota. Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 83,9% dương tính với virus PED.

Tỷ lệ bệnh PED cao nhất ở lợn con theo mẹ (96%), lợn con sau cai sữa (86,2%) và thấp nhất ở đực giống. Tỷ lệ chết cao nhất ở lợn con theo mẹ (68,6%). Quan sát lâm sàng cho thấy phân có màu vàng, vàng xanh, hoặc phân màu xám, xám đen. Bệnh tích đại thể chủ yếu quan sát thấy ở dạ dày (19,4%), ruột non (61,3%), ruột già (32,2%), hạch bạch huyết (38,7%) và ở một số cơ quan nội tạng khác.

Năm 2015, Lê Văn Phan và cộng sự (Lê Văn Phan và cs.,2015) đã nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn tại một số tỉnh như: Thái Nguyên, Thái Bình, Quảng Trị từ năm 2013- 2014. Kết quả cho thấy, trong tổng số 148 mẫu bệnh phẩm (phân, ruột) của lợn nghi mắc PEDV được chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR có 57/148 (38,51%) dương tính với virus PED. Đồng thời khi tiến hành giải mã phân tích đoạn gen S của các chủng virus thấy tương đồng về (nt) và aa rất cao khi so sánh với các chủng virus PED tham chiếu khác trước đây của Việt Nam, tỷ lệ tương đồng nt từ 94,8 - 98,6% và aa từ 93,5 - 98,8%. Trong đó các chủng virus PED thu thập được ở 2 tỉnh Thái Bình và Thái Nguyên trong năm 2013 và 2014 có mối quan hệ gần gũi với các chủng virus PED phân lập được ở Việt Nam trước đây và nằm trong cùng 1 nhánh, các chủng virus PED thu thập được ở Quảng Trị trong năm 2014 nằm cùng nhánh với các chủng virus PED mới được phân lập tại Trung Quốc trong năm 2011 - 2012 và đặc biệt là các chủng virus được phân lập tại Mỹ và Hàn Quốc trong các đợt dịch PED nổ ra vào năm 2013 và 2014.

Do đó, dịch PED lưu hành tại miền Bắc và bắc Trung bộ có thể tồn tại ít nhất 2 biến chủng thuộc nhóm phụ G1-1(Lê Văn Phan và cs. Năm 2016, (Choe et al., 2016) đã tiến hành thu thập các mẫu phân lợn con với tiêu chảy ở tỉnh Hưng Yên, kết quả cho thấy một chủng virus gây bệnh tiêu chảy ở lợn (PEDV) có độc lực cao đã xuất hiện ở Việt Nam. Trình tự bộ gen của chủng HUA-14PED96 cho thấy, chủng HUA-14PED96 bị xóa 72 nt trong ORF 1a, tương đồng với các chủng PEDV tại Mỹ. 4 Năm 2017,Huỳnh Minh Trí đã tiến hành khảo sát tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh tiêu chảy cấp Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên lợn nái và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED tại tỉnh Tiền Giang.

Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm PEDV trên đàn nái tại tỉnh Tiền Giang là khá cao 33,72%, trong đó cao nhất là huyện Chợ Gạo (59,22%), Cai Lậy (27,66%), Cái Bè (14,52%) và thấp nhất là huyện Châu Thành (10,20%). Tỷ lệ nhiễm cao nhất ở qui mô đàn nái từ trên 50 nái (34,95%), qui mô 20 – 50 (33,66%) nái và thấp nhất là ở qui mô dưới 20 nái tương ứng với tỷ lệ 31,58%. Tỷ lệ nhiễm ở những nái có số lứa đẻ trong khoảng 4 – 5 lứa (56,67%), nái trên 5 lứa (38,59%), tiếp theo là những nái hậu bị hoặc chỉ mới sinh sản 1 lứa (33,33%) và thấp nhất là nái đã sinh sản 2 – 3 lứa (27,50%). Phân tích các yếu tố nguy cơ xảy ra PED cho thấy nguy cơ cao nhất là không sát trùng chuồng trại hoặc sát trùng chuồng trại ít hơn 2 tuần/lần, không có hố sát trùng trước trại, khoảng cách gần với các hộ chăn nuôi có dịch bệnh (Huỳnh Minh Trí và cs.

Theo nghiên cứu của Đàm Thị Vui, năm 2018 kết quả giải trình tự gen của cả ba chủng phân lập PEDV của Việt Nam cho thấy cả 3 chủng đều có chiều dài là 28.035 nucleotide (nt)và giống nhau ở mức độ nucleotide và axit amin tương ứng trên 99,8% và 99,6% (Vui và cs. Bộ gen giống với các bộ gen PEDV khác được báo cáo trước đây, với thứ tự gen 5’ -ORF1a / 1b-S-ORF3-EMN-3'. Vùng 5’ UTR có chiều dài là 292 nt. Gen ORF1a / bcó chiều dài 20.

Kích thước gen S, ORF3, E, M và N lần lượt là 4.158 nt, 675 nt,231 nt, 681 nt và 1. Vùng 3’ UTR có chiều dài là 334 nt. Các chủng Việt Nam có đột biến chèn thêm axit amin (56GENQ59 ) và (140N) tại các vị trí axit amin 55 đến 60 và 140, và xóa 2 axit amin 2 (160DG161) ở axit amin 160 và 161. Năm 2018, Nguyễn Văn Điệp đã tiến hành nghiên cứu về chủng PEDV tại các tỉnh phía bắc Việt Nam giai đoạn 2012- 2015.

Phân tích trình tự cho thấy gen S của các chủng PEDV tại Việt Nam không đồng nhất. Mười ba chủng PEDV biến thể của Việt Nam có protein S ngắn hơn 261 amino acid so với protein S bình thường. Ngoài một biến thể mới với việc chèn 8 amino acid nằm trong vùng liên kết của thụ thể đối với pAPN.