Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Parvovirus Gây Tiêu Chảy Ở Chó Tại Thủ Đô Viêng Chăn - CHDCND Lào

Nghiên cứu đặc tính sinh học của parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại Viêng Chăn, Lào, cung cấp thông tin quan trọng cho thú y.

• Tác giả: SoukSaVanh Sisamouth
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Parvovirus Gây Tiêu Chảy Ở Chó Tại Viêng Chăn, Lào
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC
• 2.1. Danh mục bảng
• 2.2. Danh mục hình ảnh
• 2.3. Danh mục chữ viết tắt
• 3. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 4. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 5. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 6.1. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
• 6.1.1. Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus
• 6.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra trên thế giới
• 6.1.3. Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra tại Lào
• 6.2. Đặc điểm sinh học của Parvovirus
• 6.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus
• 6.2.2. Phân loại và phân bố các type Parvovirus
• 6.2.3. Sức đề kháng của Parvovirus
• 6.2.4. Đặc tính nuôi cấy. Đặc tính kháng nguyên
• 6.2.5. Khả năng miễn dịch
• 6.2.6. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh
• 6.2.7. Các phương pháp chẩn đoán
• 6.2.8. Phòng bệnh
• 6.3. Tổng quan tế bào
• 6.3.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
• 6.3.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
• 6.3.3. Điều kiện nuôi cấy
• 6.3.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
• 6.4. Phân lập VIRUS
• 6.4.1. Khái quát về phân lập virus
• 6.4.2. Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt
• 6.5. Giải trình tự gen. Cây phát sinh chủng loại (Phylogenetic Tree)
• 7. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. Đối tượng nghiên cứu
• 7.2. Địa điểm nghiên cứu
• 7.3. Nội dung nghiên cứu
• 7.4. Nghiên vật liệu
• 7.5. Trang thiết bị máy móc
• 7.6. Phương pháp nghiên cứu
• 7.6.1. Phương pháp lấy mẫu
• 7.6.2. Phương pháp tách DNA tổng số
• 7.6.3. Phương pháp PCR
• 7.6.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
• 7.6.5. Phương pháp giải trình tự gen
• 7.6.6. Phương pháp mở giống tế bào CRFK
• 7.6.7. Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK
• 7.6.8. Phương pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK
• 7.6.9. Phương pháp thu virus
• 7.6.10. Phương pháp đếm số lượng tế bào
• 7.6.11. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 7.6.12. Phương pháp phân tích phả hệ
• 8. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 8.1. Kết quả chẩn đoán canine parvovirus bằng phương pháp PCR
• 8.2. Kết quả xây dựng cây phả hệ (Phylogenetic Tree)
• 8.3. Kết quả phân tích sự tương đồng của Nuclotide của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu
• 8.4. Kết quả phân tích sự tương đồng của Amino acid của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu
• 8.5. Kết quả xây dựng cây phả hệ
• 8.6. Kết quả phân lập chủng Parvovirus trên môi trường nuôi cấy tế bào CRFK
• 8.7. Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK
• 8.8. Kết quả phân lập Parvovirus
• 8.9. Kết quả xác định hiệu giá của Parvovirus trên môi trường tế bào
• 8.10. Kết quả xác định đường cong sinh trưởng
• 8.11. Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus
• 8.12. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau
• 8.13. Đường cong sinh trưởng của virus
• 9. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Parvovirus Chó Gây Tiêu Chảy Ở Lào

Nghiên cứu về Parvovirus chó gây tiêu chảy ở chó tại Viêng Chăn, Lào là một vấn đề cấp thiết. Bệnh do Parvovirus gây ra gây thiệt hại lớn cho ngành thú y. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao, đặc biệt ở chó con. Khí hậu nóng ẩm của Lào tạo điều kiện cho virus phát triển mạnh. Điều này làm tăng nguy cơ lây nhiễm và gây bệnh. Các nghiên cứu về Parvovirus ở chó tại Lào còn hạn chế. Cần có thêm nghiên cứu chuyên sâu về đặc tính sinh học của virus. Mục tiêu là phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định đặc tính sinh học của Parvovirus phân lập từ chó bệnh tại Viêng Chăn. Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc kiểm soát dịch bệnh.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu Parvovirus ở Viêng Chăn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe chó ở Viêng Chăn. Parvovirus gây bệnh nặng và có thể gây tử vong. Việc hiểu rõ đặc tính sinh học của virus giúp phát triển vaccine hiệu quả. Vaccine giúp bảo vệ chó khỏi bệnh. Nghiên cứu cũng giúp cải thiện phương pháp chẩn đoán và điều trị. Điều này giúp giảm tỷ lệ tử vong và nâng cao sức khỏe chó. Nghiên cứu này đóng góp vào sự phát triển của ngành thú y Viêng Chăn.

1.2. Mục tiêu và phạm vi của nghiên cứu Parvovirus chó

Nghiên cứu tập trung vào xác định đặc tính sinh học của Parvovirus phân lập từ chó bệnh. Các đặc tính sinh học bao gồm đặc điểm hình thái, cấu trúc gen và khả năng gây bệnh. Nghiên cứu cũng xác định các chủng Parvovirus phổ biến tại Viêng Chăn. Phạm vi nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu bệnh phẩm từ chó bệnh. Phân lập và nuôi cấy virus trong phòng thí nghiệm. Phân tích di truyền và xác định đặc tính kháng nguyên của virus. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phòng và điều trị bệnh.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu và Kiểm Soát Parvovirus ở Lào

Nghiên cứu và kiểm soát Parvovirus ở Lào đối mặt với nhiều thách thức. Nguồn lực hạn chế là một vấn đề lớn. Các phòng thí nghiệm thú y thường thiếu trang thiết bị hiện đại. Điều này gây khó khăn cho việc chẩn đoán và nghiên cứu. Nhận thức của người dân về bệnh Parvovirus còn thấp. Nhiều chủ chó không tiêm phòng đầy đủ cho thú cưng. Việc kiểm soát dịch bệnh gặp nhiều khó khăn do chó thả rông. Khả năng lây lan của virus tăng lên. Cần có các biện pháp đồng bộ để giải quyết các thách thức này. Đầu tư vào cơ sở vật chất, nâng cao nhận thức cộng đồng và tăng cường kiểm soát chó thả rông là cần thiết.

2.1. Hạn chế về nguồn lực và cơ sở vật chất thú y

Các phòng thí nghiệm thú y ở Lào thường thiếu trang thiết bị hiện đại. Điều này gây khó khăn cho việc chẩn đoán chính xác bệnh Parvovirus. Việc nghiên cứu đặc tính sinh học của virus cũng bị hạn chế. Cần có sự đầu tư vào cơ sở vật chất và trang thiết bị. Điều này giúp nâng cao năng lực chẩn đoán và nghiên cứu. Đào tạo nhân lực thú y cũng rất quan trọng. Cán bộ thú y cần được trang bị kiến thức và kỹ năng để đối phó với dịch bệnh.

2.2. Nhận thức cộng đồng và tập quán chăn nuôi chó

Nhận thức của người dân về bệnh Parvovirus còn thấp. Nhiều chủ chó không tiêm phòng đầy đủ cho thú cưng. Điều này làm tăng nguy cơ mắc bệnh. Tập quán chăn nuôi chó thả rông cũng gây khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh. Cần có các chương trình nâng cao nhận thức cộng đồng. Tuyên truyền về tầm quan trọng của việc tiêm phòng và quản lý chó. Khuyến khích người dân thay đổi tập quán chăn nuôi chó.

2.3. Khó khăn trong kiểm soát dịch tễ học Parvovirus

Việc kiểm soát dịch tễ học Parvovirus gặp nhiều khó khăn. Chó thả rông dễ dàng lây lan virus. Việc truy vết và cách ly chó bệnh gặp nhiều khó khăn. Cần có sự phối hợp giữa các cơ quan chức năng. Xây dựng hệ thống giám sát dịch bệnh hiệu quả. Thực hiện các biện pháp kiểm soát chó thả rông. Tăng cường kiểm tra và xử lý chó nhập lậu.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Parvovirus Chó Ở Lào

Nghiên cứu đặc tính sinh học Parvovirus chó ở Lào sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Phương pháp PCR được sử dụng để chẩn đoán và xác định chủng virus. Giải trình tự gen giúp phân tích di truyền và xác định mối quan hệ giữa các chủng virus. Nuôi cấy virus trên tế bào CRFK giúp phân lập và nhân giống virus. Các phương pháp huyết thanh học được sử dụng để xác định kháng thể Parvovirus trong máu chó. Kết hợp các phương pháp này giúp có được cái nhìn toàn diện về đặc tính sinh học của Parvovirus.

3.1. Chẩn đoán và phân loại Parvovirus bằng PCR

Phương pháp PCR là một công cụ quan trọng trong chẩn đoán Parvovirus. PCR giúp phát hiện DNA của virus trong mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. PCR cũng được sử dụng để phân loại các chủng Parvovirus khác nhau. Các mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen đặc trưng cho từng chủng virus. Kết quả PCR giúp xác định chủng Parvovirus gây bệnh tại Viêng Chăn.

3.2. Giải trình tự gen và phân tích di truyền Parvovirus

Giải trình tự gen giúp xác định trình tự nucleotide của bộ gen Parvovirus. Phân tích di truyền giúp xác định mối quan hệ giữa các chủng virus. Các chủng virus có nguồn gốc từ đâu. Phân tích di truyền cũng giúp xác định các đột biến gen. Các đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của virus. Kết quả giải trình tự gen cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển vaccine.

3.3. Phân lập và nuôi cấy Parvovirus trên tế bào CRFK

Nuôi cấy virus trên tế bào CRFK giúp phân lập và nhân giống Parvovirus. Tế bào CRFK là một loại tế bào thận mèo. Tế bào này rất nhạy cảm với Parvovirus. Virus được nuôi cấy trong môi trường đặc biệt. Sau một thời gian, virus sẽ nhân lên trong tế bào. Virus được thu hoạch và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Nuôi cấy virus giúp có được lượng virus đủ lớn để nghiên cứu.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Phân Tích Chủng Parvovirus Tại Viêng Chăn

Nghiên cứu đã phân tích các chủng Parvovirus gây bệnh tiêu chảy ở chó tại Viêng Chăn. Kết quả cho thấy tỷ lệ chó dương tính với Parvovirus là rất cao. Các chủng CPV-2a và CPV-2c là phổ biến nhất. Phân tích di truyền cho thấy các chủng virus tại Viêng Chăn có mối quan hệ gần gũi với các chủng ở các nước lân cận. Nghiên cứu cũng xác định một số đột biến gen mới. Các đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của virus. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho việc kiểm soát dịch bệnh.

4.1. Tỷ lệ nhiễm Parvovirus và phân bố các chủng CPV

Tỷ lệ chó nhiễm Parvovirus tại Viêng Chăn rất cao. Điều này cho thấy bệnh Parvovirus là một vấn đề nghiêm trọng. Các chủng CPV-2a và CPV-2c là phổ biến nhất. Điều này phù hợp với tình hình dịch tễ học ở các nước lân cận. Cần có các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát bệnh hiệu quả. Tiêm phòng là biện pháp quan trọng nhất để bảo vệ chó khỏi bệnh.

4.2. Phân tích di truyền và mối quan hệ với các chủng khác

Phân tích di truyền cho thấy các chủng Parvovirus tại Viêng Chăn có mối quan hệ gần gũi với các chủng ở các nước lân cận. Điều này cho thấy virus có thể lây lan qua biên giới. Cần có sự hợp tác giữa các nước để kiểm soát dịch bệnh. Chia sẻ thông tin và kinh nghiệm giúp đối phó với dịch bệnh hiệu quả hơn.

4.3. Phát hiện các đột biến gen mới ở Parvovirus

Nghiên cứu đã phát hiện một số đột biến gen mới ở Parvovirus. Các đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của virus. Cần có các nghiên cứu tiếp theo để xác định tác động của các đột biến này. Thông tin này giúp phát triển vaccine và thuốc điều trị hiệu quả hơn.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Giải Pháp Phòng Bệnh Parvovirus Chó

Kết quả nghiên cứu có nhiều ứng dụng thực tiễn. Thông tin về các chủng Parvovirus phổ biến giúp lựa chọn vaccine phù hợp. Phát hiện các đột biến gen giúp theo dõi sự tiến hóa của virus. Điều này giúp dự đoán và đối phó với các biến chủng mới. Nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các biện pháp phòng và điều trị bệnh hiệu quả hơn. Tiêm phòng đầy đủ, vệ sinh môi trường và cách ly chó bệnh là các biện pháp quan trọng.

5.1. Lựa chọn vaccine phù hợp dựa trên kết quả nghiên cứu

Thông tin về các chủng Parvovirus phổ biến giúp lựa chọn vaccine phù hợp. Vaccine cần có khả năng bảo vệ chống lại các chủng virus đang lưu hành. Cần theo dõi sự thay đổi của các chủng virus để cập nhật vaccine. Điều này giúp đảm bảo hiệu quả bảo vệ của vaccine.

5.2. Phát triển các biện pháp phòng bệnh tổng hợp

Phòng bệnh Parvovirus cần có các biện pháp tổng hợp. Tiêm phòng đầy đủ là biện pháp quan trọng nhất. Vệ sinh môi trường giúp giảm nguy cơ lây nhiễm. Cách ly chó bệnh giúp ngăn chặn sự lây lan của virus. Cần có sự phối hợp giữa các cơ quan chức năng và cộng đồng để thực hiện các biện pháp này.

5.3. Nghiên cứu phát triển thuốc điều trị Parvovirus hiệu quả

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh Parvovirus. Các biện pháp điều trị chủ yếu là hỗ trợ. Cần có các nghiên cứu phát triển thuốc điều trị hiệu quả hơn. Thuốc cần có khả năng ức chế sự nhân lên của virus. Giảm các triệu chứng bệnh và tăng khả năng sống sót của chó.

VI. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Parvovirus và Sức Khỏe Chó

Nghiên cứu về Parvovirus và sức khỏe chó cần tiếp tục được đẩy mạnh. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của virus. Phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn. Nghiên cứu về vaccine thế hệ mới có khả năng bảo vệ rộng hơn. Nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự lây lan của virus. Điều này giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn. Hợp tác quốc tế là rất quan trọng để chia sẻ thông tin và kinh nghiệm.

6.1. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của Parvovirus

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của Parvovirus. Virus gây tổn thương cho các cơ quan nào. Các yếu tố nào ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng của bệnh. Hiểu rõ cơ chế gây bệnh giúp phát triển các biện pháp điều trị hiệu quả hơn.

6.2. Phát triển vaccine thế hệ mới và phương pháp chẩn đoán

Cần phát triển vaccine thế hệ mới có khả năng bảo vệ rộng hơn. Vaccine cần có khả năng bảo vệ chống lại nhiều chủng Parvovirus khác nhau. Phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn. Điều này giúp phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời.

6.3. Hợp tác quốc tế trong nghiên cứu và kiểm soát Parvovirus

Hợp tác quốc tế là rất quan trọng trong nghiên cứu và kiểm soát Parvovirus. Chia sẻ thông tin và kinh nghiệm giúp đối phó với dịch bệnh hiệu quả hơn. Cần có sự phối hợp giữa các nước để giám sát và kiểm soát sự lây lan của virus.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm ruột truyền nhiễm do Canine Parvovirus gây ra là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tỷ lệ tử vong cao từ 50% đến 100% ở chó con dưới 1 năm tuổi trên toàn cầu. Tại khu vực Đông Nam Á, đặc biệt là Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, sự phát triển và lây lan của các chủng vi sinh vật gây bệnh diễn ra vô cùng phức tạp. Tuy nhiên, các dữ liệu dịch tễ học phân tử và nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính sinh học của virus gây bệnh tại địa phương vẫn còn rất hạn chế.

Đề tài được tiến hành nhằm xác định các đặc tính sinh học phân tử của chủng Canine Parvovirus thông qua việc phân tích trình tự gen mã hóa protein capsid và phân lập thành công chủng virus thực địa trên hệ thống tế bào nuôi cấy. Nghiên cứu thực hiện khảo sát trên 24 mẫu bệnh phẩm phân thu thập từ những cá thể chó có biểu hiện tiêu chảy, nôn mửa tại Thủ đô Viêng Chăn trong tháng 02/2019. Quá trình phân tích chuyên sâu được triển khai tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y từ tháng 12/2018 đến tháng 06/2019.

Kết quả thu được mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi xác định tỷ lệ nhiễm bệnh thực tế lên tới 92% (22/24 mẫu dương tính). Đồng thời, việc phân lập thành công chủng virus có hiệu giá nhân lên đạt $10^6\text{ TCID}_{50}/\text{ml}$ trên dòng tế bào liên tục đã cung cấp nguồn vật liệu di truyền chuẩn hóa, mở ra tiềm năng sản xuất các chế phẩm sinh học và vaccine phòng bệnh đặc hiệu cho đàn thú cảnh tại Lào.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng nền tảng lý thuyết virus học hiện đại về họ Parvoviridae, giống Parvovirus, loài Canine Parvovirus type 2 (CPV-2). Cấu trúc virus có kích thước siêu vi 18–24 nm, không vỏ bọc, mang hệ gen DNA sợi đơn dạng thẳng dài khoảng 5.323 nucleotide với 2 khung đọc mở chính mã hóa cho các protein cấu trúc VP1, VP2 và protein phi cấu trúc NS1, NS2.

Lý thuyết tiến hóa kháng nguyên chỉ ra rằng quá trình biến đổi di truyền của CPV-2 đã hình thành ba biến thể lưu hành chính gồm CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c. Sự khác biệt cốt lõi giữa các biến thể này nằm ở axit amin tại vị trí 426 trên chuỗi polypeptide của protein VP2 (với Asn tương ứng thể 2a, Asp tương ứng thể 2b, và Glu tương ứng thể 2c). Bên cạnh đó, nghiên cứu kết hợp mô hình bệnh sinh học mô tả cơ chế virus phá hủy tế bào biểu mô mầm ruột non, gây bào mòn nhung mao, giảm thiểu tế bào lympho máu dẫn đến xuất huyết đường tiêu hóa và suy giảm miễn dịch nghiêm trọng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của đề tài được thu thập từ 24 mẫu phân chó nghi nhiễm bệnh tại các phòng khám thú y trên địa bàn Thủ đô Viêng Chăn. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng dựa trên triệu chứng lâm sàng điển hình (sốt nhẹ 39–39,5°C, ỉa chảy lẫn máu, nôn mửa) và kết quả thử nhanh dương tính bằng kit thử sắc ký miễn dịch kháng nguyên. Cỡ mẫu 24 ca đại diện cho nhiều giống chó ngoại nhập lẫn bản địa với độ tuổi dao động từ 3 đến 8 tháng tuổi.

Về phương pháp phân tích, toàn bộ mẫu phân được tách chiết DNA tổng số bằng bộ kít Genomic DNA Mini Kit với quy trình ly tâm cột lọc silica nhằm thu nhận vật liệu di truyền tinh sạch. Phản ứng khuếch đại gen PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 555for/555rev được lựa chọn nhờ độ nhạy vượt trội và tính đặc hiệu cao, cho phép khuếch đại chính xác phân đoạn gen VP2 có kích thước chuẩn 583 bp mà không cần chờ đợi thời gian nuôi cấy phân lập kéo dài.

Bốn mẫu đại diện dương tính được gửi giải trình tự Sanger trực tiếp và dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA 7 theo thuật toán toán học thống kê sinh học. Nhằm đánh giá hoạt tính sinh học, virus được phân lập trên môi trường tế bào thận mèo CRFK trong môi trường DMEM bổ sung 2% đến 5% huyết thanh thai bò (FBS). Hiệu giá virus được xác định trên đĩa 96 giếng sau 96 giờ theo công thức Spearman-Karber. Toàn bộ tiến trình nghiên cứu được triển khai đồng bộ trong mốc thời gian 7 tháng (từ tháng 12/2018 đến tháng 06/2019).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, phương pháp PCR đã phát hiện 22 trong tổng số 24 mẫu phân dương tính với Canine Parvovirus, chiếm tỷ lệ nhiễm lên tới 92%, trong khi chỉ có 8% (2/24 mẫu) cho kết quả âm tính. Sản phẩm PCR của tất cả các mẫu dương tính khi chạy điện di trên thạch agarose 1,2% đều hiển thị một vạch khuếch đại duy nhất ở kích thước chính xác 583 bp. Tỷ lệ nhiễm bệnh phân bố rộng rãi ở các giống chó như Poodle, Fox sóc, Corgi, Alaska, Becgie Bỉ và chó bản địa Lào.

Thứ hai, kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen VP2 của 4 chủng đại diện (ký hiệu L04, L05, L12, L14) cho thấy mức độ tương đồng nucleotide giữa các chủng nội bộ đạt từ 99,0% đến 99,6%, và tương đồng axit amin từ 97,1% đến 98,8%. Đáng chú ý, hai chủng L04 và L12 chia sẻ mức độ đồng nhất nucleotide cao nhất đạt 99,6% và tương đồng axit amin đạt 98,8%.

Thứ ba, chủng L04 thể hiện 7 vị trí sai khác axit amin đặc thù so với 3 chủng còn lại, bao gồm các vị trí 318, 320, 322, 380, 414, 429 và 430. Phân tích cây phát sinh chủng loại chỉ ra rằng cả 4 chủng phân lập tại Viêng Chăn đều thuộc kiểu gen CPV-2c và nằm cùng nhánh phả hệ với các chủng virus chuẩn từ Trung Quốc (tương đồng 97,5% đến 98,0%) và Việt Nam (tương đồng 97,8%).

Thứ tư, nghiên cứu đã phân lập thành công chủng virus thực địa trên tế bào thận mèo CRFK. Bệnh tích tế bào đặc trưng (CPE) bắt đầu xuất hiện rõ rệt sau 48 đến 72 giờ gây nhiễm với hiện tượng tế bào co tròn, thoái hóa và bong tróc thành mảng. Chuẩn độ hiệu giá sinh học sau 96 giờ gây nhiễm ghi nhận nồng độ virus đạt giá trị đỉnh $10^6\text{ TCID}_{50}/\text{ml}$.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ dương tính 92% phản ánh mức độ lưu hành rất cao của Parvovirus tại các quần thể chó nuôi ở Viêng Chăn. Điều này hoàn toàn phù hợp với thực trạng phần lớn đàn chó con trong diện điều tra (100% cá thể khảo sát) chưa được tiêm phòng vaccine phòng bệnh đầy đủ và đang bước vào giai đoạn 3 đến 8 tháng tuổi – thời điểm lượng kháng thể thụ động từ mẹ truyền bị suy giảm nghiêm trọng.

Sự hiện diện ưu thế của biến thể CPV-2c trong các mẫu phân lập minh chứng cho xu hướng dịch tễ khu vực, tương tự các phát hiện từ một nghiên cứu dịch tễ tại Lào năm 2016 khi ghi nhận tỷ lệ nhiễm 82,73%. Sự tương đồng di truyền cao giữa các chủng tại Lào với các chủng tại Việt Nam và Trung Quốc gợi ý sự giao lưu truyền bệnh qua đường biên giới thông qua hoạt động vận chuyển thú cảnh.

Về mặt trực quan hóa, toàn bộ dữ liệu dịch tễ có thể được mô tả sinh động thông qua biểu đồ phân bố lứa tuổi mắc bệnh, bảng ma trận đối sánh tỷ lệ phần trăm tương đồng nucleotide/axit amin giữa các chủng, và sơ đồ cây phát sinh chủng loại (Phylogenetic tree). Các hình ảnh vi thể về chu kỳ hủy hoại tế bào CRFK từ 12 giờ đến 96 giờ cũng cung cấp minh chứng rõ ràng cho đường cong sinh trưởng của virus trong môi trường nuôi cấy.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, tăng cường năng lực xét nghiệm sớm bằng việc áp dụng quy trình chẩn đoán PCR với cặp mồi 555for/555rev kết hợp kit thử nhanh sắc ký tại 100% các trạm và phòng khám thú y. Mục tiêu hướng tới là rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 3 giờ và nâng độ chính xác lên trên 95%, thực hiện định kỳ trong lộ trình 6 tháng bởi các cơ quan quản lý thú y địa phương.

Thứ hai, thiết lập ngân hàng lưu trữ nguồn giống gốc (Master Seed Virus) từ các chủng thực địa L04 và L12 đạt hiệu giá $10^6\text{ TCID}_{50}/\text{ml}$. Các viện nghiên cứu và trung tâm công nghệ sinh học thú y cần chủ trì kế hoạch 18 tháng để nghiên cứu quy trình sản xuất vaccine vô hoạt đa giá tương thích với biến thể CPV-2c đang lưu hành, nhằm đạt tỷ lệ bảo hộ miễn dịch trên 90% đàn thú cảnh.

Thứ ba, chuẩn hóa phác đồ điều trị hỗ trợ toàn diện bao gồm truyền dịch bù điện giải, sử dụng kháng sinh phổ rộng (như Gentamycin hoặc Ampicillin) chống nhiễm trùng thứ phát và thuốc trợ sức. Phác đồ này cần được triển khai ngay lập tức tại các cơ sở điều trị thú y nhằm giảm tỷ lệ tử vong ở chó mắc bệnh từ mức trên 50% xuống dưới mức 20%.

Thứ tư, phát động chương trình truyền thông nâng cao ý thức tiêm chủng với lịch tiêm mũi đầu tiên cho chó con từ 6 tuần tuổi, nhắc lại sau 3 tuần và duy trì tiêm định kỳ hàng năm. Đồng thời, các hộ nuôi cần thực hiện sát trùng chuồng trại bằng dung dịch Han-Iodine 10% hoặc Benkocid với tần suất 1–2 lần mỗi tuần để tiêu diệt mầm bệnh trong môi trường sống.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng đa chiều cho nhiều nhóm đối tượng chuyên môn:

• Bác sĩ thú y lâm sàng và kỹ thuật viên xét nghiệm: Nắm vững quy trình lấy mẫu phân, kỹ thuật chẩn đoán phân tử bằng PCR và quy chuẩn xây dựng phác đồ điều trị triệu chứng, hồi sức cấp cứu cho chó non mắc bệnh tiêu chảy ra máu.
• Các nhà nghiên cứu và dịch tễ học thú y: Sử dụng dữ liệu giải trình tự gen VP2 và cây phả hệ của các chủng CPV-2c tại Lào để đối sánh với các cơ sở dữ liệu quốc tế trên GenBank, phục vụ nghiên cứu tiến hóa virus học.
• Các đơn vị sản xuất dược phẩm và sinh phẩm thú y: Khai thác quy trình nuôi cấy, phân lập Parvovirus trên dòng tế bào CRFK và phương pháp chuẩn độ $\text{TCID}_{50}$ nhằm tối ưu hóa dây chuyền sản xuất kháng huyết thanh và vaccine vô hoạt.
• Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Thú y: Làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu vi sinh vật truyền nhiễm, thao tác an toàn sinh học phòng thí nghiệm và kỹ thuật xử lý số liệu di truyền.

Câu hỏi thường gặp

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 555for/555rev mang lại ưu thế gì so với chẩn đoán truyền thống? Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 583 bp giúp phát hiện chính xác vật liệu di truyền của Parvovirus với độ nhạy 92% ngay từ giai đoạn ủ bệnh, tiết kiệm thời gian đáng kể so với kỹ thuật nuôi cấy tế bào vốn mất từ 3 đến 5 ngày.

Hiệu giá virus đạt mức $10^6\text{ TCID}{50}/\text{ml}$ có ý nghĩa như thế nào trong nuôi cấy tế bào? Hiệu giá $10^6\text{ TCID}{50}/\text{ml}$ cho thấy virus có khả năng thích ứng và nhân lên rất mạnh mẽ trên dòng tế bào CRFK. Đây là chỉ số nồng độ lý tưởng để làm giống gốc phục vụ công tác sản xuất kháng nguyên và chế tạo vaccine thương mại đạt tiêu chuẩn bảo hộ cao.

Tại sao nghiên cứu lại tập trung phân tích đoạn gen mã hóa protein VP2? Protein VP2 chiếm tới 90% thành phần vỏ capsid của virus và đóng vai trò quyết định đến tính kháng nguyên cũng như khả năng gây bệnh. Các biến đổi axit amin trên gen VP2 (đặc biệt tại vị trí 426) là cơ sở xác định kiểu gen CPV-2a, 2b hay 2c.

Vì sao chó con trong độ tuổi từ 6 đến 12 tuần tuổi lại có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất? Trong giai đoạn từ 6 đến 12 tuần tuổi, hàm lượng kháng thể mẹ truyền qua sữa đầu bị suy giảm xuống dưới ngưỡng bảo vệ tự nhiên, trong khi hệ miễn dịch chủ động của chó con chưa hoàn thiện, tạo điều kiện thuận lợi cho virus xâm nhập và gây bệnh.

Các chủng Parvovirus phân lập tại Lào có mối quan hệ di truyền như thế nào với thế giới? Cả 4 chủng phân lập đều thuộc kiểu gen CPV-2c, có mức độ tương đồng nucleotide nội bộ đạt 99,0% đến 99,6% và nằm cùng nhánh tiến hóa với các chủng CPV-2c phổ biến tại Trung Quốc và Việt Nam với độ tương đồng trên 97,8%.

Kết luận

• Đề tài xác định tỷ lệ nhiễm Canine Parvovirus đạt mức cao 92% (22/24 mẫu) trên đàn chó nghi mắc bệnh tại Thủ đô Viêng Chăn, khẳng định mức độ lưu hành phổ biến của mầm bệnh.
• Toàn bộ 4 chủng đại diện được giải trình tự đều thuộc kiểu gen CPV-2c, chia sẻ mức tương đồng di truyền nội bộ từ 99,0% đến 99,6% nucleotide và 97,1% đến 98,8% axit amin.
• Phát hiện chủng L04 mang 7 đột biến axit amin đặc trưng trên chuỗi polypeptide capsid VP2, minh chứng cho sự đa dạng tiến hóa của virus thực địa.
• Phân lập thành công chủng Parvovirus trên dòng tế bào liên tục CRFK với hiệu giá sinh học đạt đỉnh $10^6\text{ TCID}_{50}/\text{ml}$ sau 96 giờ nuôi cấy.
• Cung cấp cơ sở khoa học tin cậy và nguồn vật liệu sinh học chuẩn hóa nhằm định hướng nghiên cứu sản xuất vaccine vô hoạt trong giai đoạn 2020–2025.

Các trạm thú y và nhà quản lý dịch tễ cần nhanh chóng áp dụng quy trình chẩn đoán PCR kết hợp mở rộng mạng lưới giám sát dịch tễ để bảo vệ sức khỏe đàn vật nuôi hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM SOUKSAVANH SISAMOUTH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS GÂY TIÊU CHẢY Ở CHÓ NUÔI TẠI THỦ ĐÔ VIÊNG CHĂN - CHDCND LÀO Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn SoukSaVanh Sisamouth i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Lê Văn Phan người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà luận văn của tôi đã được hoàn thành Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật truyền- nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn SoukSaVanh Sisamouth ii MỤC LỤC Lời cam đoan. Error! Bookmark not defined. Error! Bookmark not defined. iii Danh mục bảng.

vi Danh mục hình ảnh. vii Danh mục chữ viết tắt. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Tổng quan tài liệu. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus.

Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra trên thế giới. Tình hình dịch bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus gây ra tại Lào. Đặc điểm sinh học của parvovirus.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus. Phân loại và phân bố các type Parvovirus. Sức đề kháng của Parvovirus. Đặc tính nuôi cấy.

Đặc tính kháng nguyên. Khả năng miễn dịch. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh. Các phương pháp chẩn đoán.

Phòng bệnh. Tổng quan tế bào. Một số đặc điểm của tế bào động vật. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào.

Điều kiện nuôi cấy. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế. Phân lập VIRUS. Khái quát về phân lập virus.

Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất Vaccine vô hoạt. Giải trình tự gen. Cây phát sinh chửng loại (Phylogenetic Tree). Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Nghiên vật liệu.

Trang thiết bị máy móc. Phương pháp nghiên cứu. Phường pháp lấy mẫu. Phương pháp tách DNA tổng số.

Phương pháp PCR. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm. Phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp mở giống tế bào CRFK.

Phương pháp cấy chuyển tế bào CRFK. Phương pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK. Phương pháp thu virus. Phương pháp đếm số lượng tế bào.

Phương pháp xác định hiệu giá virus. Phương pháp phân tích phả hệ. Kết quả và thảo luận. Kết quả chẩn đoán canine parvovirus bằng phương pháp PCR.

Kết quả xây dựng cây phả hệ (Phylogenetic Tree). Kết quả phân tích sự tương đồng của Nuclotide của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu. Kết quả phân tích sự tương đồng của Amino acid của các chủng Parvovirus đã nghiên cứu. Kết quả xây dựng cây phả hệ.

Kết quả phân lập chủng Parvovirus trên môi trường nuôi cấy tế bào CRFK. Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK. Kết quả phân lập Parvovirus. Kết của xác định hiệu giá của Parvovirus trên môi trường tế bào.

Kết quả xác định đường cong sinh trưởng. Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau. Đường cong sinh trưởng của virus.

Kết luận và kiến nghị. 50 Tài liệu tham khảo. 52 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. Thông tin các mẫu phân nghi mắc bệnh parvovirus.

Thành phần của phản ứng PCR. Thông tin cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR (Canio Buonavoglia et al. Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR. Sơ đồ thí nghiệm xác định TCID50.

Thông tin mẫu bệnh phẩm và kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng phản ứng PCR. Kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng phản ứng PCR. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nt của các chủng Parvovirus trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu khác. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự aa của các chủng Parvovirus trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu khác.

Kết quả xác định hiệu giá Parvovirus trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng sau 96 giờ gây nhiễm. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus. Kết quả chuẩn độ TCID50 của các chai gây nhiễm thu hoạch ở các thời điểm khác nhau. 48 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.

Cấu tạo của Parvovirus. Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới. Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, và CPV2C. Cơ chế sinh bệnh của Parvovirus trên chó.

Chó bị tiêu chảy cấp, nôn mửa do Parvovirus. Kit thử nhanh Canine Parvovirus (CPV) Ag. Kết quả chạy PCR với cặp mồi định tính 555forc/555revc (Canio Buonavoglia et al. Sản phẩm có kích thước theo dự kiến là 583bp.

Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới. Sự tương đồng về amino acid giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới. Tế bào CRFK sau nuôi cấy 24h, 48h, 72h, 96h. Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau khi nuôi cấy 24, 48, 72, 96 giờ.

Hình ảnh tế bào CRFK sau khi gây nhiễm virus 24, 48, 72, 96 giờ. Hình ảnh bệnh tích tế bào và đối chứng âm của Parvovirus gây nhiễm trên tế bào CRFK các thời điểm 12, 24, 36, 48, 72, 96 giờ. Biểu đồ đường cong sinh trưởng của Parvovirus trên tế bào CRFK. 49 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt PCR Polymerase chain reaction FPV Panleucopenie feline DICT Dose Infectieuse Culture de Tissu MDCK Madin Darby Canine kidney CRFK Crandell Rees Feline Kidney HI Haemagglutination Inhibition ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay cs cộng sự CPV2 Canine Parvovirus type 2 HA Haemagglutination IHC Immunohistochemistry Tm Melting temperature dNTP Deoxynucleotide Triphosphate PBS Phosphate Buffered Saline P: C: I Phenol-chlorofrom-isoamyl-alcohol MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis version µl Microlit CPE Cyto Pathogenic Effect DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleoic acid PBS Phosphate buffered saline TBE Tris/Borate/EDTA RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain React nt Nucleotide aa Amino acid viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: SoukSaVanh SISAMOUTH Tên luận văn: ―Xác định một số đặc tính sinh học của Parvovirus gây tiêu chảy ở chó nuôi tại Thủ đô Viêng Chăn - CHDCND Lào‖ Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đặc tính sinh học của Parvovirus ở chó nuôi tại thủ đô Viêng Chăn- CHDCND Lào.

Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc sử dụng - Phương pháp lấy mẫu - Phương pháp tách DNA tổng số - Phương pháp PCR. - Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm - Phương pháp giải trình tự gen - Phương pháp phân lập parvovirus trên môi trường tế bào CRFK - Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml); - Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus; - Phương pháp xử lý số liệu Kết quả chính và kết luận Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001) cho thấy trong 24 có 22 mẫu dương tính với Parvovirus chiếm tỷ lệ (92%). Kết quả phân tích trình tự gen VP2 cho thấy 4 chủng virus trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng về nt và aa với nhau là 99 - 99,6% nt và 97,1 - 98,8% aa. Trong đó 2 chủng L04 và chủng L12 có mức độ tương đồng cao về nt và aa với nhau tương ứng là 99,6% và 98,8%.

Kết quả phân tích về trình tự nt và aa suy diễn của đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có 7 aa sai khác với 3 chủng L05, L12, L14. Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) và 430 (LS). Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự nt gen VP2 của các chủng ix Parvovirus cho thấy 4 chủng L04, L05, L12, L14 đều nằm trên cùng 1 nhánh phát sinh với các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó có mối quan hệ gần gữi với các chủng nằm trên Genotype 2c của Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) và chủng của Việt Nam (Genbank: LC214969). Đã phân lập thành công parvovirus trên môi trường tế bào CRFK. Chủng virus phân lập được có hiệu giá 106.

x THESIS ABSTRACT Master candidate: SoukSaVanh SISAMOUTH Thesis title: Identify some biological characteristics of Parvovirus causing diarrhea in dogs in Vientiane Capital - Lao PDR Major: Veterinary Code: 8640101 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Research on parvovirus biological characteristics isolated in dogs in Vientiane, Lao PDR. Materials and Methods used in the study - Sampling methods - Methods for DNA extraction - PCR method. - DNA electrophoresis method - Methods for gene sequencing - Method for parvovirus isolation on CRFK cells - Methods for viral titration (TCID50 / ml) - Methods for determination virus growth curve - Data processing methods Main findings and conclusions Diagnostic results by PCR using specific primers (555forc / 555revc) (Canio Buonavoglia et al., 2001) showed that in 24 samples, 22 were positive with Parvovirus (92%).