Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu đặc tính sinh học của canine parvovirus phân lập ở miền Bắc Việt Nam

Luận văn thạc sĩ VNUA nghiên cứu đặc tính sinh học của canine parvovirus phân lập ở phía Bắc Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho ngành thú y.

• Tác giả: Kham Ning Bun Pha Xay
• Người hướng dẫn: Gs. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học của Canine Parvovirus phân lập được ở Phía Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2.1. Mục tiêu chung
• 1.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PARVOVIRUS GÂY RA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới
• 2.1.2. Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam
• 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Ðịa Ðiểm nghiên cứu
• 3.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.3. Ðối tượng/vật liệu nghiên cứu
• 3.3.1. Ðối tượng nghiên cứu
• 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp mổ khám
• 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA
• 3.5.3. Phương pháp PCR
• 3.5.4. Phương pháp phân lập Parvovirus
• 3.5.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus
• 3.5.6. Xử lý số liệu
• 3.5.7. Phương pháp test kit xét nghiệm nhanh bệnh parvovirus trên chó
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thu thập mẫu chó mắc parvovirus
• 4.2. Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK
• 4.3. Kết quả phân lập Parvovirus
• 4.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu phân lập bằng phương pháp PCR
• 4.5. Xác định một số đặc tính sinh học của parvovirus
• 4.5.1. Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của Parvovirus
• 4.5.2. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng Parvovirus nghiên cứu
• 4.5.3. Xác định quy luật nhân lên của virus Parvo trên môi trường tế bào CRFK
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đặc tính sinh học của canine parvovirus

Nghiên cứu về canine parvovirus (CPV) tại miền Bắc Việt Nam đã trở thành một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực thú y. Bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV gây ra có tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt là ở chó con. Việc hiểu rõ về đặc tính sinh học của virus này sẽ giúp cải thiện công tác phòng chống và điều trị bệnh. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về virus mà còn giúp xây dựng các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Tình hình dịch bệnh canine parvovirus tại miền Bắc Việt Nam

Bệnh viêm ruột do canine parvovirus đã được ghi nhận tại miền Bắc Việt Nam từ những năm 1990. Tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, với nhiều ổ dịch xảy ra. Các giống chó như Labrador, Rottweiler thường bị ảnh hưởng nặng nề. Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 80% nếu không được điều trị kịp thời.

1.2. Đặc điểm sinh học của canine parvovirus

CPV là một virus DNA đơn, không có vỏ bọc, có kích thước khoảng 5.2kb. Virus này có khả năng nhân lên nhanh chóng trong tế bào, gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như nôn mửa, tiêu chảy có máu. Việc phân lập và nghiên cứu các chủng virus là cần thiết để hiểu rõ hơn về tính chất gây bệnh của chúng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu canine parvovirus

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về canine parvovirus, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định các chủng virus và đặc tính sinh học của chúng. Việc thiếu thông tin chi tiết về đường lây truyền và triệu chứng bệnh cũng như sự biến đổi của virus là một trong những vấn đề lớn. Điều này ảnh hưởng đến khả năng phát triển vaccine và phương pháp điều trị hiệu quả.

2.1. Thách thức trong việc phân lập virus

Phân lập canine parvovirus từ mẫu bệnh phẩm là một thách thức lớn. Các phương pháp hiện tại cần được cải tiến để tăng cường khả năng phát hiện virus trong các mẫu. Việc sử dụng tế bào CRFK đã cho thấy hiệu quả, nhưng cần có thêm nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình.

2.2. Khó khăn trong việc phát triển vaccine

Việc phát triển vaccine phòng bệnh do canine parvovirus gây ra gặp nhiều khó khăn do sự biến đổi của virus. Các chủng mới như CPV-2c đã xuất hiện và có thể gây ra các vấn đề trong việc tạo ra vaccine hiệu quả. Cần có nghiên cứu sâu hơn để phát triển vaccine phù hợp với các chủng virus hiện có.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh học của canine parvovirus

Nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập và xác định đặc tính sinh học của canine parvovirus. Các phương pháp như PCR, nuôi cấy tế bào CRFK, và xác định hiệu giá virus được áp dụng để thu thập dữ liệu chính xác về virus. Những phương pháp này giúp xác định khả năng gây bệnh và thời gian sinh trưởng của virus trong tế bào.

3.1. Phương pháp phân lập virus trên tế bào CRFK

Phân lập canine parvovirus trên tế bào CRFK là một trong những phương pháp chính được sử dụng. Tế bào CRFK cho phép virus nhân lên hiệu quả, từ đó giúp nghiên cứu các đặc tính sinh học của virus. Kết quả cho thấy virus có khả năng nhân lên nhanh chóng trong tế bào này.

3.2. Phương pháp PCR trong xác định virus

Phương pháp PCR được sử dụng để xác định sự có mặt của canine parvovirus trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này cho phép phát hiện virus với độ nhạy cao, giúp xác định nhanh chóng các trường hợp nhiễm bệnh. Kết quả từ PCR cho thấy tỷ lệ dương tính cao trong các mẫu thu thập.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy có 40 mẫu bệnh phẩm dương tính với canine parvovirus. Các chủng virus phân lập được đã cho thấy khả năng gây bệnh tích tế bào rõ rệt. Những thông tin này có thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh viêm ruột do CPV.

4.1. Kết quả phân lập và xác định hiệu giá virus

Kết quả phân lập cho thấy 4 chủng virus VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32 và VNUA-C35 có khả năng gây bệnh tích tế bào. Hiệu giá virus của các chủng này được xác định bằng phương pháp TCID50, cho thấy sự nhân lên mạnh mẽ trong tế bào CRFK.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine phòng bệnh cho chó. Việc hiểu rõ về đặc tính sinh học của các chủng virus sẽ giúp cải thiện hiệu quả của các chế phẩm sinh học và phương pháp điều trị hiện có.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu canine parvovirus

Nghiên cứu về canine parvovirus tại miền Bắc Việt Nam đã cung cấp nhiều thông tin quý giá về đặc tính sinh học của virus. Tuy nhiên, vẫn cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự biến đổi của virus và phát triển các phương pháp phòng chống hiệu quả. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc bảo vệ sức khỏe cho chó.

5.1. Kết luận về nghiên cứu

Nghiên cứu đã xác định được các chủng canine parvovirus gây bệnh tại miền Bắc Việt Nam và các đặc tính sinh học của chúng. Những thông tin này là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo và phát triển vaccine.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Tương lai của nghiên cứu về canine parvovirus cần tập trung vào việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị mới. Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế để nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh viêm ruột do CPV.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Canine Parvovirus (CPV) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trên loài chó, đặc biệt gây tỷ lệ tử vong cao từ 80% đến 100% ở chó con dưới 1 năm tuổi. Trong quần thể chó chưa được tiêm phòng đầy đủ, tỷ lệ mắc bệnh tự nhiên có thể lên tới 45% đến 50%, gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi và đặt ra thách thức lớn đối với công tác thú y lâm sàng. Vấn đề cốt lõi hiện nay là sự biến đổi kháng nguyên liên tục của virus với sự xuất hiện của các biến chủng mới như CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c, khiến các loại vaccine và kit chẩn đoán nhập ngoại có nguy cơ suy giảm hiệu lực bảo hộ. Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu chuyên sâu nhằm phân lập và giải mã đặc tính sinh học của các chủng CPV thực địa trên mô hình tế bào còn rất hạn chế.

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập thành công các chủng Canine Parvovirus đang lưu hành tại thực địa trên dòng tế bào liên tục, đồng thời xác định chi tiết các đặc tính sinh học bao gồm khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE), hiệu giá độc lực virus (TCID50) và quy luật động học nhân lên của virus. Phạm vi nghiên cứu được triển khai trên 40 mẫu bệnh phẩm thu thập tại các phòng khám thú y thuộc 3 tỉnh thành phía Bắc gồm Hà Nội, Bắc Ninh và Hải Dương trong mốc thời gian từ tháng 9/2018 đến tháng 9/2019. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi đạt tỷ lệ chẩn đoán khẳng định 100% bằng kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời tuyển chọn thành công 4 chủng virus thực địa có hoạt lực cao, tạo nguồn giống gốc phục vụ công tác chế tạo sinh phẩm chẩn đoán và sản xuất vaccine phòng bệnh tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên thuyết bệnh nguyên học virus truyền nhiễm và mô hình tương tác virus - tế bào chủ trong điều kiện in vitro. Các khung lý thuyết chính bao gồm: cơ chế xâm nhiễm và phá hủy mô đích của virus không vỏ chứa DNA sợi đơn thuộc họ Parvoviridae; nguyên lý nuôi cấy tế bào dòng liên tục phục vụ nhân dòng vi sinh vật; và phương pháp xác định độc lực sinh học thông qua đơn vị gây nhiễm mô nuôi cấy.

Hệ thống nghiên cứu vận dụng 5 khái niệm chuyên ngành then chốt:

1. Canine Parvovirus type 2 (CPV-2): Tác nhân gây viêm dạ dày - ruột xuất huyết và suy giảm miễn dịch cấp tính ở loài chó.
2. Hiệu ứng bệnh tích tế bào (Cytopathogenic Effect - CPE): Sự biến đổi hình thái, thoái hóa và hủy hoại cấu trúc tế bào chủ dưới tác động của virus.
3. Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50): Chỉ số định lượng hạt virus có khả năng gây tổn thương trên một nửa số đơn vị tế bào thí nghiệm.
4. Đa bội nhiễm (Multiplicity of Infection - MOI): Tỷ lệ số lượng hạt virus truyền nhiễm trên mỗi tế bào đích trong hệ thống nuôi cấy.
5. Protein vỏ VP2 (Viral Protein 2): Thành phần cấu trúc capsid chính chiếm 90% tiểu đơn vị protein, quyết định tính kháng nguyên và khả năng gắn kết thụ thể của Parvovirus.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của đề tài xuất phát từ 40 mẫu phân và bệnh phẩm đường tiêu hóa thu thập từ những cá thể chó biểu hiện hội chứng viêm ruột tiêu chảy cấp tính tại 3 địa bàn: Bắc Ninh (15 mẫu), Hà Nội (14 mẫu) và Hải Dương (11 mẫu). Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng nhằm thu thập chính xác các ca bệnh điển hình trên lâm sàng, sau đó sàng lọc sơ bộ bằng test kit kháng nguyên nhanh trước khi đưa vào phân tích chuyên sâu.

Phương pháp nghiên cứu được triển khai theo quy trình thực nghiệm nghiêm ngặt:

• Chẩn đoán xác định bằng kỹ thuật PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 555forc và 555revc để nhân bản đoạn gen VP2 có kích thước 550 bp. Lý do lựa chọn kỹ thuật này là nhằm đạt độ nhạy trên 99% và độ đặc hiệu trên 98%, giúp phát hiện chính xác DNA của virus ở nồng độ thấp mà không bị ảnh hưởng bởi tạp nhiễm sinh học.
• Mổ khám bệnh lý đại thể: Thực hiện tử thiết trên 10 cá thể chó bệnh tử vong để đánh giá tổn thương bệnh học vi thể và đại thể tại các cơ quan nội tạng.
• Phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK (Crandell Rees Feline Kidney): Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung từ 2% đến 10% huyết thanh thai bò (FBS). Dòng tế bào CRFK được lựa chọn vì tính mẫn cảm cao nhất với CPV, hỗ trợ virus bám dính và nhân lên tối ưu. Quy trình cấy chuyền được theo dõi qua 3 đời liên tiếp trong khung thời gian 96 giờ mỗi đời.
• Định lượng hiệu giá virus: Đánh giá chỉ số log TCID50/ml theo phương pháp toán học Reed-Muench trên khay 96 giếng với mật độ 20.000 tế bào mỗi giếng.
• Toàn bộ timeline nghiên cứu kéo dài liên tục 12 tháng tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, kết quả kiểm tra 40 mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng kit xét nghiệm nhanh và kỹ thuật PCR đều cho tỷ lệ dương tính đạt 100%. Phản ứng điện di sản phẩm PCR xuất hiện vạch sáng rõ nét tại đúng kích thước chuẩn 550 bp của gen VP2, khẳng định toàn bộ 40 ca bệnh khảo sát đều nhiễm Canine Parvovirus.

Thứ hai, triệu chứng lâm sàng ở đàn chó bệnh thể hiện tính chất tàn phá nghiêm trọng. Triệu chứng ủ rũ và mệt mỏi chiếm 100% (40/40 con); tiêu chảy phân lẫn máu có mùi tanh khắm đặc trưng chiếm 90,0% (36/40 con); phản ứng sốt cao trên 39°C và triệu chứng nôn mửa chiếm 80,0% (32/40 con) với thân nhiệt trung bình đạt 39,75°C (tăng cao hơn 1,35°C so với mức sinh lý bình thường); triệu chứng bỏ ăn chiếm 75,0% (30/40 con); biểu hiện mất nước da mất đàn tính chiếm 62,5% (25/40 con). Khảo sát bệnh tích đại thể trên 10 ca mổ khám ghi nhận 100% cá thể có ruột đầy hơi, sung huyết, xuất huyết niêm mạc; 100% bị xuất huyết dạ dày; 100% sưng phù hạch màng treo ruột; 80% có tổn thương hoại tử rìa lách và sưng túi mật.

Thứ ba, nghiên cứu đã phân lập thành công 4 chủng virus có khả năng thích ứng và gây bệnh tích tế bào đặc trưng trên dòng tế bào CRFK, đạt tỷ lệ phân lập 10% (4/40 mẫu). Ở đời cấy thứ nhất, chưa quan sát thấy bệnh tích tế bào; tuy nhiên từ đời thứ hai và thứ ba, 4 chủng virus gồm VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32 và VNUA-C35 đã gây hủy hoại tế bào mạnh mẽ với hiện tượng co tròn, vón cục và bong tróc bề mặt đạt từ 80% đến 90% diện tích giếng nuôi sau 72 đến 96 giờ.

Thứ tư, xác định chính xác quy luật động học nhân lên của 4 chủng virus phân lập được. Hàm lượng virus nội bào tăng trưởng nhanh chóng từ sau 24 giờ và đạt đỉnh cao nhất ở khoảng 60 đến 72 giờ sau khi gây nhiễm. Tại thời điểm cực đại, hiệu giá log TCID50/ml của chủng VNUA-C32 đạt mức cao nhất là 4,16; hai chủng VNUA-C17 và VNUA-C35 đạt 3,83; chủng VNUA-C31 đạt 3,50. Sau 72 giờ, hàm lượng virus trong tế bào giảm dần do tế bào bị ly giải giải phóng virus ra môi trường ngoài, hạ xuống mức 2,50 đến 3,83 log TCID50/ml tại thời điểm 96 giờ.

Thảo luận kết quả

Cơ chế bệnh sinh được làm rõ qua sự tương quan chặt chẽ giữa tổn thương vi thể và biểu hiện lâm sàng. Parvovirus có ái lực đặc biệt với các tế bào đang phân chia nhanh ở hạch lympho, tủy xương và tế bào biểu mô nếp nhung mao ruột. Quá trình nhân lên làm sụp đổ hàng rào niêm mạc ruột, dẫn đến hiện tượng xuất huyết ồ ạt, mất cân bằng điện giải và nhiễm trùng huyết thứ phát do vi khuẩn cơ hội.

So sánh với các công bố quốc tế và trong nước, quy luật nhân lên đạt đỉnh tại 60 đến 72 giờ trên tế bào CRFK hoàn toàn tương thích với các nghiên cứu vi sinh học kinh điển, nhưng tỷ lệ phân lập thành công 10% phản ánh tính thích ứng khắt khe của các chủng virus thực địa khi chuyển từ cơ thể sống sang môi trường ống nghiệm.

Về mặt trực quan hóa khoa học, dữ liệu động học nhân lên của 4 chủng virus có thể được trình bày tối ưu qua biểu đồ đường nhiều trục (line graph), biểu diễn sự biến thiên nồng độ log TCID50/ml theo các mốc 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 và 96 giờ. Đồng thời, bảng ma trận so sánh tỷ lệ tổn thương đại thể tại 8 cơ quan đích cung cấp cơ sở dữ liệu định lượng rõ ràng, giúp các nhà nghiên cứu hình dung toàn diện mức độ độc lực của từng chủng virus phân lập.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa và bảo tồn ngân hàng chủng giống gốc: Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y cần tiến hành tinh sạch, giải trình tự toàn bộ hệ gen và bảo quản đông lạnh 4 chủng virus VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32, VNUA-C35 tại nhiệt độ âm 80°C trong vòng 6 tháng tới, nhằm duy trì độ tinh khiết và tính ổn định di truyền đạt 100% phục vụ nghiên cứu dài hạn.
2. Sản xuất thử nghiệm vaccine vô hoạt bản địa: Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y cần sử dụng chủng VNUA-C32 (hiệu giá đạt 4,16 log TCID50/ml) để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy quy mô pilot trong giai đoạn 2020 - 2025, đặt mục tiêu tạo ra lô vaccine vô hoạt đạt tỷ lệ bảo hộ thực nghiệm trên 85% đối với chó nuôi tại Việt Nam.
3. Cải tiến bộ kit chẩn đoán nhanh tại thực địa: Các đơn vị nghiên cứu sinh phẩm cần khai thác kháng nguyên vỏ tái tổ hợp từ các chủng phân lập để nâng cấp kit thử sắc ký miễn dịch trong thời gian 12 tháng, hướng tới rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 10 phút với độ chính xác đạt trên 98%.
4. Triển khai quy trình giám sát và cách ly dịch tễ diện rộng: Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh miền Bắc phối hợp cùng mạng lưới phòng khám thú y tư nhân xây dựng hệ thống báo cáo ca bệnh định kỳ hàng quý, nâng tỷ lệ kiểm soát ổ dịch lên 90% và giảm thiểu tỷ lệ tử vong ở chó dưới 1 năm tuổi xuống dưới 20%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và học viên sau đại học ngành Thú y, Vi sinh vật học: Tài liệu cung cấp cơ sở phương pháp luận chuẩn xác về kỹ thuật nuôi cấy tế bào CRFK, quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR mồi đặc hiệu và phương pháp định lượng hiệu giá virus theo Reed-Muench để ứng dụng cho các đề tài nghiên cứu chuyên sâu.
2. Các công ty sản xuất vaccine và chế phẩm sinh học thú y: Khai thác thông tin chi tiết về đặc tính sinh học, động học tăng trưởng và hiệu giá độc lực của các chủng thực địa làm dữ liệu đầu vào cho việc thiết kế dây chuyền sản xuất vaccine bất hoạt quy mô công nghiệp.
3. Bác sĩ thú y lâm sàng tại các bệnh viện, phòng khám thú cưng: Nắm bắt các số liệu thống kê chi tiết về triệu chứng lâm sàng và tổn thương đại thể để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán phân biệt, đồng thời thiết lập phác đồ cấp cứu bù nước, giải độc và kháng sinh phòng bội nhiễm hiệu quả.
4. Cơ quan quản lý dịch tễ và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật: Đưa dữ liệu sinh học của các chủng Parvovirus phía Bắc vào hệ thống giám sát dịch bệnh quốc gia, phục vụ công tác quy hoạch vùng an toàn dịch bệnh và lưu trữ nguồn gen phục vụ an ninh sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao dòng tế bào CRFK lại được ưu tiên lựa chọn để phân lập Canine Parvovirus? Dòng tế bào CRFK (thận mèo) sở hữu cấu trúc thụ thể bề mặt có độ tương thích sinh học cao với các gai nhú protein capsid của Parvovirus. Kết quả thực nghiệm chứng minh tế bào CRFK giúp 4 chủng virus phân lập nhân lên mạnh mẽ, đạt hiệu giá từ 3,50 đến 4,16 log TCID50/ml và thể hiện bệnh tích tế bào rõ rệt sau 2 đến 3 đời cấy chuyền.

2. Thời điểm nào nồng độ virus trong tế bào nuôi cấy đạt giá trị cao nhất? Theo dõi quy luật động học nhân lên cho thấy nồng độ virus nội bào đạt cực đại trong khoảng thời gian từ 60 đến 72 giờ sau khi gây nhiễm. Điển hình như chủng VNUA-C32 đạt đỉnh 4,16 log TCID50/ml tại mốc 72 giờ, sau đó giảm dần ở mốc 96 giờ do hiện tượng thoái hóa và giải phóng virus ra ngoài môi trường.

3. Những dấu hiệu lâm sàng nào có giá trị cảnh báo sớm nhất bệnh Parvovirus ở chó? Hai triệu chứng có giá trị chẩn đoán cảnh báo hàng đầu là trạng thái mệt mỏi, ủ rũ xuất hiện ở 100% ca bệnh và tiêu chảy phân lẫn máu mùi tanh khắm chiếm 90,0%. Kết hợp với dấu hiệu sốt cao trung bình 39,75°C (cao hơn sinh lý 1,35°C) và nôn mửa ở 80,0% số cá thể, bác sĩ có thể định hướng ngay nguyên nhân do Parvovirus.

4. Vì sao ở đời cấy truyền thứ nhất trên tế bào CRFK lại chưa ghi nhận bệnh tích tế bào? Ở đời thứ nhất, lượng hạt virus ban đầu trong mẫu bệnh phẩm còn phân tán và cần thời gian để thích ứng với hệ thống enzyme của tế bào nuôi cấy in vitro. Khi chuyển sang đời thứ hai và thứ ba, virus đã thích nghi hoàn toàn, gia tăng mật độ và gây phá hủy tế bào đồng loạt với tỷ lệ tổn thương từ 80% đến 90%.

5. Ý nghĩa lớn nhất của việc phân lập thành công 4 chủng Parvovirus bản địa là gì? Thành công này phá vỡ sự phụ thuộc vào các nguồn mẫu ngoại lai, cung cấp 4 chủng giống thực địa (VNUA-C17, C31, C32, C35) chuẩn hóa cho ngân hàng gen quốc gia. Đây là nền tảng cốt lõi để nghiên cứu sản xuất vaccine vô hoạt có tính tương đồng kháng nguyên cao, nâng hiệu quả bảo hộ thực tế lên trên 85% cho đàn chó trong nước.

Kết luận

• Đã xác định chính xác 100% (40/40) mẫu bệnh phẩm chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy tại Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương dương tính với Canine Parvovirus bằng kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen VP2 kích thước 550 bp.
• Phân lập thành công 4 chủng Canine Parvovirus thực địa gồm VNUA-C17, VNUA-C31, VNUA-C32 và VNUA-C35 trên dòng tế bào CRFK sau 2 đến 3 đời cấy chuyền với tỷ lệ thành công 10%.
• Làm rõ quy luật động học nhân lên của virus đạt đỉnh cực đại tại 60 đến 72 giờ sau gây nhiễm với hiệu giá độc lực log TCID50/ml dao động từ 3,50 đến 4,16.
• Chứng minh bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu tại đường tiêu hóa với 100% ca mổ khám ghi nhận tổn thương xuất huyết niêm mạc ruột, dạ dày và viêm sưng hạch màng treo ruột.
• Tạo lập nguồn vật liệu sinh học chuẩn mực phục vụ trực tiếp cho công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất vaccine vô hoạt cũng như kit chẩn đoán nhanh trong nước.

Trong giai đoạn tiếp theo kéo dài từ 12 đến 24 tháng, các đơn vị chuyên môn cần khẩn trương hoàn thiện giải mã toàn bộ trình tự nucleotide của các chủng phân lập và tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng vaccine bất hoạt trên động vật thí nghiệm. Các nhà khoa học, cơ sở thú y và doanh nghiệp dược phẩm hãy tăng cường liên kết, khai thác tối đa nguồn chủng giống bản địa này nhằm chủ động sản xuất các chế phẩm phòng trị bệnh Parvovirus hiệu quả cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học canine parvovirus (CPV) phân lập được ở phía bắc Việt Nam”. Nhằm nghiên cứu quy trình phân lập Parvovirus; làm rõ đặc tính gây bệnh tích tế bào, thời gian sinh trưởng của các chủng Parvovirus phân lập từ thực địa trên môi trường tế bào thích hợp. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm cơ sở cho việc chọn chủng Parvovirus có đặc tính sinh học phù hợp dùng để chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán, chế phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị và phát triển vacxin phòng bệnh hiệu quả. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.

Mục tiêu chung - Phân lập được các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó tại một số tỉnh phía Bắc trên môi trường tế bào, xác định được các đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus. Mục tiêu cụ thể - Phân lập được các chủng Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK. - Xác định được đặc tính sinh học (khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus và đường cong sinh trưởng) của các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.

Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong nghiên cứu về bệnh do Parvovirus ở chó trong viện nghiên cứu, các trường có chuyên ngành thú y. Đây cũng là tư liệu khoa học cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ sở về bệnh do Parvovirus. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống Parvo virus phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gen quốc gia. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Parvovirus đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.

Chủng Parvovirus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo Kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PARVOVIRUS GÂY RA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus (Canine Parvovirus type 2 - CPV 2) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loài chó có tỉ lệ chết cao. Biểu hiện lâm sàng đặc trưng là hiện tượng viêm dạ dày ruột có xuất huyết. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới trong đó có Việt Nam. Bệnh hay xảy ra với các giống chó: Bergie, Labrador, Rottweiler, Dorberman, Yorshire terriers,.

Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới Đầu năm 1970, CPV 2 được phát hiện trên chó con với các triệu chứng bệnh tích như sốt cao, nôn mửa, tiêu chảy, phân lỏng lẫn máu, viêm dạ dày, viêm cơ tim,. Bệnh thường xảy ra ở dạng dịch địa phương hoặc nhiều ổ dịch xảy ra cùng một lúc. Bệnh xuất hiện vào mùa thu năm 1977 ở Texas và đến mùa hè năm 1978 đã xảy ra nhiều vùng khác nhau ở Hoa Kỳ và Canada. Đầu năm 1979, bệnh đã xuất hiện ở Úc, Bỉ, Hà Lan, Anh và Pháp.

Theo các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, tỷ lệ chó nhiễm CPV 2 là khác nhau ở các quốc gia, như báo cáo về tình hình chó bị nhiễm Parvovirus tại Nigeria là 40,00% (Chollom et al., 2013), tại Hungary là 84,00% (Csagola et al. Kết quả nghiên cứu gần đây của Kaur et al. (2015) về tỷ lệ nhiễm CPV 2 theo lứa tuổi chó, khi sử dụng kỹ thuật Nested PCR (Polymerase Chain Reaction) chẩn đoán bệnh CPV 2 cho thấy, tỷ lệ nhiễm CPV 2 trên chó từ 0 đến 3 tháng tuổi là 60,00%, 3 đến 6 tháng tuổi là 30,00%, 6 đến 9 tháng tuổi là 24,00%, trên 9 tháng tuổi là 6,00%. Theo các nghiên cứu cho thấy CPV-2 là một virus sợi đơn DNA, không có vỏ bọc, kích thước khoảng 5.2kp, bao gồm 2 khung đọc mở chính, một khung là mã hóa 2 capsid protein [VP1] và [VP2] và một khung là mã hóa 2 protein không cấu trúc [NS1] và [NS2].

Sau đó, một loại Parvovirus mới đã được phân lập trong nuôi cấy tế bào (Burtonboy et al.,1979; Johnson and Spradbrow, 1979;Kelly, 1978). Loại virus này được đặt tên là Canine Parvovirus loại 2 (CPV-2), để phân biệt nó với mô tả trước Parvovirus Canine Munite Virus (CMV hoặc CPV-1), đó là kháng nguyên không liên quan đến CPV-2 (Carmichael and 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Trong năm 1979 và 1980, một biến thể kháng nguyên của CPV được xác định ở một vài quốc gia khác bằng việc sử dụng Monoclonal antibodies (MAbs) và biến thể được cho là CPV loại 2a (Parrish, 1991). Giữa năm 1980, virus thêm một biến đổi kháng nguyên, và biến thể mới này được gọi là CPV loại 2b (Parrish, 1991).

Hiện nay, biến thể kháng nguyên của CPV đã thay thế hoàn toàn CPV-2 trước đó và được phân bố đa dạng ở khắp các loài chó trên toàn thế giới (Allen and 1998; D. Buonavoglia et al., 2000; Mochizuki Harasawa, andNakatani, 1993; Steinel et al. Hai biến thể kháng nguyên, CPV-2a và CPV-2b, hiện đang được phân phối trên toàn thế giới (Truyen U. Biến thể CPV thứ ba, có vị trí axit amin Glu-426 đột biến và sau đó được đặt tên thành CPV-2c, đã được phát hiện tại Ý năm 2000 (C.

Buonavoglia et al., 2001) và hiện đang lưu hành tại nước đó cùng với các loại 2a và 2b (Decaro et al., 2007; Martella et al.) Các biến thể mới 2c cũng đã được báo cáo trong Việt Nam bởi Nakamura et al. Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus đã được ghi nhận lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1990 trên chó nghiệp vụ (Trần Ngọc Bích và cs. Ở Việt Nam, cũng như ở các quốc gia khác ở châu Á, các chủng CPV-2a và CPV-2b khá phổ biến từ những đợt bùng phát dịch đầu tiên. Bệnh được công bố lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1994.

Chó ở mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh, thông thường hầu hết các con trưởng thành đều có kháng thể, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên chó con từ 6- 12 tuần tuổi rất đáng kể do có sự huỷ bỏ kháng thể mẹ truyền. Bệnh có khả năng lây lan nhanh. Tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 50%, tỷ lệ tử vong trên chó con từ 50-100% (Trần Ngọc Bích và cs. Theo kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thị Yến Mai và cs.

(2018) cho thấy tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do Parvovirus ở Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ là 30,00%; 34,00% và 30,00%. Chó từ ở độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở cả ba tỉnh với tỷ lệ lần lượt là (60,00%; 58,82%; 60,00%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê với chó ở độ tuổi >6 tháng tuổi ở cả 3 tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ (6,67%; 5,88%; 0,00%). Chó được tiêm ngừa vacxin phòng bệnh thì tỷ lệ bệnh thấp hơn 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] so với chó không được tiêm ngừa vacxin ở 3 tỉnh là (6,67% so với 93,33%; 5,88% so với 94,12%; 13,33% so với 86,67%;). Hiệu quả điều trị bệnh Parvovirus trên chó ở tỉnh Tiền Giang và Thành phố Cần Thơ là tương đương nhau với tỷ lệ là 86,67% và 58,82%.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS 2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus Parvovirus thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus, loài Canine Parvovirus. Cấu tạo của Parvovirus  Hình thái và cấu trúc: + Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. Parvovirus ở mỗi loài động vật khác nhau là khác nhau.

Chúng có kích thước 18– 24nm, nhân chứa DNA sợi đơn, không có vỏ bọc, bộ gen 5323 nucleotide. + Capsid có kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32 capsome với 60 tiểu đơn vị VP (viral protein) là VP1, VP2 (chiếm 90% tiểu đơn vị protein) (Reed, Jones, & Miller, 1988) + Lõi: DNA đơn, dạng thẳng. Hầu hết là DNA (-), ở hai đầu có đoạn palindrom (đoạn DNA mạch kép có trình tự nucleotide trên mỗi sợi giống nhau nhưng 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay cho mồi. Phân loại và phân bố các type Parvovirus Hình 2.2 Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới https://www.gov/pmc/articles/PMC5376324/ Từ bản đồ sự phân bố của các chủng CPV-2a/2b/2c trên toàn thế giới ta có thể nhận thấy Parvovirus phân bố trên khắp thế giới với các chủng khác nhau.

Cụ thể, chủng CPV-2a phân bố nhiều ở khu vực Châu Á và Nam Phi một phần ở vùng Nam Mỹ, chủng CPV-2b có thể thấy xuất hiện ở hầu hết các châu lục, riêng chủng CPV-2c thì tập trung nhiều ở châu Mỹ Latinh và Châu Âu. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đến năm 1984 trở đi thì có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2b. Trong khoảng thời gian 1986-1996 thì chủng CPV-2a lưu hành phổ biến. Từ sau năm 1996 có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2c, chủng CPV-2b có xu hướng giảm, các chủng CPV-2a và CPV-2c đang thịnh hành trên thế giới (Zhou P.

Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, và CPV-2c https://www.gov/pmc/articles/PMC5376324/ 2. Sức đề kháng của Parvovirus Parvovirus đề kháng mạnh với môi trường bên ngoài. Trong phân thì virus có 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thể tồn tại hơn 6 tháng ở nhiệt độ phòng. Nó đề kháng với tác động của ete, chloruaform, axit và nhiệt độ (56oC trong 30 phút).

Dễ bị tiêu diệt bởi ánh sáng mặt trời, tồn tại kéo dài vào mùa đông (ôn đới). Theo Tô Du và cs. (2006), virus có thể tồn tại 1 – 2 tuần ở nhiệt độ 15 – 25oC. Đặc tính nuôi cấy Virus chỉ nhân lên trong nhân tế bào và gây bệnh tích tế bào trên tế bào tim chó con còn bú hay trên tế bào ruột.

Theo Tô Du và cs. (2006), virus phát triển tốt trên môi trường tế bào thận chó, thận khỉ, chúng gây bệnh tích tế bào nên người ta thường phân lập virus từ nuôi cấy trên các môi trường này. Đặc tính kháng nguyên Sự nhân lên của Parvovirus ở chó làm xuất hiện kháng thể gây ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà huyết thanh.