Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu đa dạng thành phần loài nấm rễ nội cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất trồng ngô

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu đa dạng thành phần loài nấm rễ nội cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất trồng, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lưu Thị Dung
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hoàng Yến
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu đa dạng thành phần loài của nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng ngô
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nấm rễ nội cộng sinh
• 1.2. Lịch sử nghiên cứu
• 1.3. Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh
• 1.3.1. Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh
• 1.4. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật
• 1.4.1. Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng
• 1.4.2. Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza
• 1.4.3. Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi của môi trường
• 1.4.4. Giúp cây chống chịu với bệnh hại
• 1.4.5. Hấp thu lân
• 1.5. Tình hình nghiên cứu AMF trên thế giới
• 1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 1.7. Đặc điểm tự nhiên của địa điểm nghiên cứu
• 1.7.1. Đặc điểm tự nhiên của Duy Tiên – Hà Nam
• 1.7.2. Đặc điểm tự nhiên của Thường Tín - Hà Nội
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu và trang thiết bị
• 2.3.1. Nguyên vật liệu
• 2.4. Phương pháp
• 2.4.1. Lấy mẫu đất
• 2.4.2. Phân lập AMF
• 2.4.3. Tiệt trùng các bào tử AMF
• 2.4.4. Phân loại nấm rễ nội cộng sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân lập AMF từ mẫu đất thu thập
• 3.2. Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học
• 3.3. Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô
• 3.3.1. Dựa vào thành phần loài
• 3.3.2. Dựa vào tần suất xuất hiện
• 3.3.3. Dựa vào mật độ loài
• 3.3.4. Lựa chọn một số AMF có độ đa dạng cao để phân loại chúng bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đa dạng loài nấm rễ nội cộng sinh

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF) là một nhóm nấm quan trọng trong hệ sinh thái đất, đặc biệt trong đất trồng ngô. Nghiên cứu về sự đa dạng của chúng không chỉ giúp hiểu rõ hơn về vai trò của nấm trong sự phát triển của cây trồng mà còn cung cấp thông tin quý giá cho việc cải thiện năng suất nông nghiệp. AMF có khả năng tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng và nước cho cây trồng, từ đó nâng cao sức đề kháng với các điều kiện bất lợi.

1.1. Định nghĩa và vai trò của nấm rễ nội cộng sinh

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF) là nhóm nấm sống cộng sinh trong rễ của thực vật, giúp cây hấp thụ dinh dưỡng và nước hiệu quả hơn. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe của cây trồng và tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

1.2. Lịch sử nghiên cứu về nấm rễ nội cộng sinh

Nghiên cứu về nấm rễ nội cộng sinh đã bắt đầu từ thế kỷ 19, với những phát hiện đầu tiên về mối quan hệ giữa nấm và rễ cây. Qua các năm, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tầm quan trọng của AMF trong nông nghiệp và sinh thái học.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh

Mặc dù nấm rễ nội cộng sinh có vai trò quan trọng, nhưng việc nghiên cứu chúng vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn là sự đa dạng loài của AMF trong các vùng sinh thái khác nhau, đặc biệt là trong đất trồng ngô. Việc thiếu thông tin về sự phân bố và đặc điểm của các loài nấm này gây khó khăn cho việc ứng dụng chúng trong nông nghiệp.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập và phân loại nấm

Phân lập nấm rễ nội cộng sinh từ đất là một quá trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn cao. Nấm AMF không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, do đó việc xác định và phân loại chúng chủ yếu dựa vào bào tử trong đất.

2.2. Thiếu thông tin về sự đa dạng loài AMF

Nhiều nghiên cứu về AMF vẫn còn hạn chế, đặc biệt là ở Việt Nam. Việc thiếu thông tin về sự đa dạng loài và mối quan hệ giữa chúng với cây trồng gây khó khăn cho việc ứng dụng trong thực tiễn nông nghiệp.

III. Phương pháp nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh hiệu quả

Để nghiên cứu sự đa dạng của nấm rễ nội cộng sinh, cần áp dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Việc phân lập bào tử nấm từ đất và phân loại chúng dựa trên hình thái học là những bước quan trọng trong nghiên cứu này.

3.1. Phương pháp phân lập bào tử nấm từ đất

Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh được thực hiện thông qua việc lấy mẫu đất và sử dụng phương pháp sàng ướt kết hợp với ly tâm. Phương pháp này giúp tách bào tử nấm ra khỏi đất một cách hiệu quả.

3.2. Phân loại nấm rễ nội cộng sinh dựa trên hình thái học

Sau khi phân lập, bào tử nấm sẽ được phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng và màu sắc. Việc này giúp xác định các loài nấm khác nhau trong mẫu đất.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của nấm rễ nội cộng sinh

Kết quả nghiên cứu về nấm rễ nội cộng sinh trong đất trồng ngô cho thấy sự đa dạng cao của các loài nấm. Những loài nấm này không chỉ giúp cây trồng hấp thụ dinh dưỡng tốt hơn mà còn tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi.

4.1. Đánh giá đa dạng thành phần loài nấm trong đất trồng ngô

Nghiên cứu cho thấy có nhiều loài nấm rễ nội cộng sinh khác nhau trong đất trồng ngô, với sự phân bố không đồng đều giữa các vùng sinh thái. Điều này mở ra cơ hội cho việc lựa chọn các loài nấm phù hợp để cải thiện năng suất cây trồng.

4.2. Ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh trong nông nghiệp

Việc ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh trong nông nghiệp có thể giúp tăng cường năng suất cây trồng, cải thiện sức khỏe đất và giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học. Điều này không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn bảo vệ môi trường.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh

Nghiên cứu về nấm rễ nội cộng sinh trong đất trồng ngô đã chỉ ra tầm quan trọng của chúng trong nông nghiệp. Việc hiểu rõ hơn về sự đa dạng và vai trò của AMF sẽ giúp phát triển các phương pháp canh tác bền vững hơn trong tương lai.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã xác định được nhiều loài nấm rễ nội cộng sinh trong đất trồng ngô, cho thấy sự đa dạng và vai trò quan trọng của chúng trong việc hỗ trợ cây trồng.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc ứng dụng các loài nấm rễ nội cộng sinh trong thực tiễn nông nghiệp, nhằm nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi - AMF) thuộc ngành Glomeromycota là nhóm vi sinh vật đất có mối quan hệ cộng sinh hỗ sinh với hơn 90% các loài thực vật bậc cao trên toàn cầu. Đối với cây ngô (Zea mays), loại cây lương thực chủ lực đứng thứ hai tại Việt Nam sau cây lúa, sự hiện diện của mạng lưới sợi nấm AMF trong vùng rễ đóng vai trò then chốt giúp gia tăng khả năng hấp thu khoáng chất, đặc biệt là nâng cao hiệu suất hấp thu phospho từ 35% đến 98%, đồng thời giúp cây trồng giảm từ 30% đến 45% tác hại do các bệnh rễ và khô hạn gây ra. Mặc dù sở hữu giá trị nông học to lớn, các dữ liệu thực nghiệm về cấu trúc quần xã, mật độ bào tử và tính đa dạng thành phần loài của AMF trong đất chuyên canh ngô tại vùng đồng bằng sông Hồng trước đây vẫn chưa được khảo sát một cách toàn diện và có hệ thống.

Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Vi sinh vật học mã số 60420107 của học viên Lưu Thị Dung được thực hiện trong giai đoạn từ tháng 1/2016 đến tháng 11/2017 tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội, dưới sự tài trợ kinh phí từ đề tài khoa học mã số QG 16.35 và sự hướng dẫn của TS. Lê Thị Hoàng Yến cùng TS. Mai Thị Đàm Linh. Nghiên cứu đặt ra mục tiêu phân lập, giám định hình thái, định danh phân tử và đánh giá mức độ đa dạng thành phần loài AMF tại 30 điểm thu mẫu đất trồng ngô thuộc hai huyện Duy Tiên (tỉnh Hà Nam) và Thường Tín (thành phố Hà Nội). Kết quả thu thập và phân loại 3174 bào tử nấm rễ nội cộng sinh từ công trình không chỉ cung cấp cơ sở dữ liệu vi sinh vật học đất có giá trị học thuật cao, mà còn tạo tiền đề khoa học vững chắc để tuyển chọn các chủng nấm ưu thế bản địa phục vụ sản xuất phân bón vi sinh, hướng đến mục tiêu giảm thiểu từ 20% đến 30% lượng phân bón hóa học trong canh tác nông nghiệp bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở lý luận của đề tài được xây dựng trên thuyết cộng sinh nấm - thực vật (Mycorrhizal Symbiosis) đã tồn tại hơn 400 triệu năm trong lịch sử tiến hóa tự nhiên. AMF là vi sinh vật cộng sinh nội bào bắt buộc, xâm nhiễm qua lớp biểu bì rễ vào mô vỏ để hình thành hai cấu trúc chuyên hóa đặc trưng: cấu trúc dạng chùm arbuscule thực hiện chức năng trao đổi ion khoáng và cấu trúc túi bọt vesicle có chức năng dự trữ năng lượng. Mối quan hệ hội sinh này vận hành theo cơ chế trao đổi hai chiều: thực vật chủ cung cấp từ 10% đến 20% sản phẩm quang hợp dạng cacbon hữu cơ cho nấm, đổi lại hệ sợi nấm ngoài rễ phát triển dày đặc với tổng chiều dài từ 1 đến 20 mét sợi nấm trên mỗi gam đất, vượt qua vùng cạn kiệt dinh dưỡng quanh rễ để huy động nguồn phospho vô cơ bị cố định, các ion kẽm, đồng và nước cung cấp ngược lại cho cây.

Hệ thống phân loại trong nghiên cứu áp dụng khung lý thuyết phân loại học của Morton và Benny (1990) kết hợp với các tiêu chuẩn mô tả hình thái của Trung tâm Dữ liệu Nấm rễ Quốc tế INVAM. Các khái niệm và chỉ số nghiên cứu cốt lõi bao gồm: mật độ bào tử (Spore Density - xác định bằng số lượng bào tử trên 100g đất), tần suất xuất hiện (Frequency of Occurrence - tỷ lệ phần trăm mẫu đất xuất hiện loài/chi nghiên cứu với ngưỡng loài ưu thế trên 10%), mật độ loài (Species Richness - số loài ghi nhận trên một đơn vị mẫu) và đặc điểm vi giải phẫu bào tử (kích thước đo bằng micromet, số lượng lớp vách từ 1 đến 4 lớp, màu sắc và phản ứng hóa học bắt màu với thuốc thử Melzer).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập cỡ mẫu thực nghiệm gồm 30 mẫu đất trồng ngô đại diện, chia đều cho 2 vùng sinh thái thổ nhưỡng: 15 mẫu tại huyện Duy Tiên (Hà Nam) và 15 mẫu tại huyện Thường Tín (Hà Nội). Phương pháp chọn mẫu phân tầng theo các loại chất đất đặc trưng được áp dụng nhằm phản ánh chính xác tính đa dạng sinh học theo điều kiện vi khí hậu và thổ nhưỡng (bao gồm đất phù sa pha cát tơi xốp, đất thịt vàng nhạt, đất cát khô và đất cứng nén dẽ). Quy trình lấy mẫu thực địa tuân thủ nghiêm ngặt kỹ thuật lấy mẫu vùng rễ: loại bỏ 3 cm tầng thảm mục bề mặt nhằm triệt tiêu các vi sinh vật hoại sinh, dùng dụng cụ vô trùng đào lấy khối đất bao quanh hệ rễ non ở độ sâu từ 3 đến 20 cm với khối lượng 500 gam mỗi mẫu, sau đó đưa về phòng thí nghiệm phơi khô tự nhiên trong bóng râm và bảo quản ở nhiệt độ từ 2 đến 5 độ C trong tối thiểu 4 ngày trước khi phân tích.

Quy trình phân tích kết hợp đồng bộ giữa phương pháp hình thái học truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại nhằm khắc phục triệt để nguy cơ nhầm lẫn do hiện tượng biến dị hình thái bào tử trong tự nhiên. Bào tử nấm được phân lập bằng phương pháp sàng ướt đa cấp qua hệ thống màng rây có kích thước mắt lưới giảm dần gồm 500, 250, 100 và 50 micromet, kết hợp ly tâm phân tầng trong thang dung dịch đường sucrose nồng độ 30% đến 50% ở tốc độ 2500 vòng/phút trong thời gian từ 2 đến 5 phút. Sau khi khử trùng bề mặt bằng cloramin 2% hoặc natri hypochlorit 0,005%, các bào tử đơn lẻ được nhuộm bằng dung dịch Melzer (pha chế từ 1,5g KI, 0,5g I2 và 20g cloral hydrat) và quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus. Đối với các chủng nấm có độ phong phú cao, kỹ thuật Nested-PCR (PCR lồng) được áp dụng với cặp mồi ngoài NS1/NS4 và cặp mồi trong đặc hiệu AML1/AML2 để nhân bản đoạn gen 18S rRNA có độ dài xấp xỉ 800 cặp bazơ (bp). Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 0,8%, tinh sạch và giải trình tự tự động trên máy ABI 3100 Avant, tiếp tục đối chiếu dữ liệu BLAST trên ngân hàng gen quốc tế và thiết lập cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Clustal X phiên bản 1.8 theo phương pháp Neighbor-Joining.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 30 mẫu đất khảo nghiệm tại hai địa phương, nghiên cứu đã phân lập và thu nhận thành công 3174 bào tử nấm rễ nội cộng sinh AMF. Sự phân bố số lượng bào tử thể hiện tính phân hóa sâu sắc giữa hai vùng sinh thái: khu vực Duy Tiên (Hà Nam) ghi nhận số lượng vượt trội với 2486 bào tử (chiếm tỷ lệ 78,32% tổng số), trong khi khu vực Thường Tín (Hà Nội) chỉ thu được 688 bào tử (chiếm 21,68%). Mật độ bào tử trung bình tại Hà Nam đạt mức 165,75 bào tử/100g đất, cao gấp 3,61 lần so với mật độ trung bình tại Hà Nội là 45,83 bào tử/100g đất. Đáng chú ý, tại địa bàn Hà Nội, mật độ bào tử có sự phân tầng rõ rệt: ở 5 mẫu đất cát pha ẩm (từ mẫu N06 đến N10), số lượng bào tử tăng vọt lên 77,33 đến 102,00 bào tử/100g đất, cao hơn gấp 8 lần so với các mẫu đất thịt nén cứng chỉ đạt 9,33 đến 10,33 bào tử/100g đất (như mẫu N01, N02). Tại Hà Nam, mật độ bào tử duy trì ở mức rất cao, dao động từ 110,66 đến đỉnh điểm là 304,00 bào tử/100g đất tại mẫu N04.

Công trình đã giám định và định danh được 20 loài nấm rễ nội cộng sinh thuộc 6 chi chính: Acaulospora, Glomus, Gigaspora, Dentiscutata, Centraspora và Racocetra. Trong đó, hai chi Acaulospora và Glomus chiếm ưu thế tuyệt đối về tần suất xuất hiện và độ đa dạng loài. Các loài đặc trưng được mô tả chi tiết gồm: Acaulospora gerdemanii (kích thước 100-140 x 180-240 micromet, vách 2 lớp tế bào), Acaulospora morrowiae (kích thước 120-150 x 180-240 micromet, vách dày 4 lớp tạo xoáy đồng tâm), Glomus intraradices (kích thước 150-200 x 240-270 micromet), Gigaspora margarita (kích thước lớn từ 260 đến 400 micromet, vách sần sùi) và Racocetra gregaria (kích thước 120-180 x 150-220 micromet). Phân tích chuỗi trình tự vùng gen 18S rRNA cho thấy sự tương thích hoàn toàn giữa kết quả giám định hình thái học và dữ liệu phát sinh chủng loại phân tử với độ tương đồng chuỗi đạt trên 97% so với các chủng chuẩn trên GenBank.

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt rõ rệt về mật độ bào tử giữa hai vùng nghiên cứu bắt nguồn từ các yếu tố lý hóa thổ nhưỡng và chế độ canh tác thực tế. Huyện Duy Tiên nằm trong vùng hạ lưu châu thổ sông Hồng và sông Châu Giang, sở hữu diện tích đất phù sa màu mỡ lên tới 6679 ha (chiếm 48,55% diện tích tự nhiên). Đất có kết cấu tơi xốp, giàu ẩm và độ thông khí cao, tạo môi trường vi sinh vật tối ưu kích thích hệ sợi nấm xâm nhiễm rễ ngô và hình thành mật độ bào tử cực đại đạt 304,00 bào tử/100g đất. Trái lại, vùng đất Thường Tín có tới 57,45% là đất phù sa chua, chịu tác động của cường độ thâm canh cao và sử dụng phân bón hóa học lâu năm, dẫn đến hiện tượng chai cứng đất, làm suy giảm mật độ bào tử AMF xuống mức 45,83 bào tử/100g đất.

So sánh với các nghiên cứu trong nước, mật độ bào tử AMF trong đất trồng ngô tại Hà Nam (165,75 bào tử/100g) tương đương với mật độ trong đất trồng cà chua (173 bào tử/100g) và đất trồng lúa (181 bào tử/100g) tại Hà Nội do Trần Thị Như Hằng công bố năm 2012. Tuy nhiên, con số này thấp hơn so với mật độ tự nhiên tại rừng mưa nhiệt đới Tây Song Bản Nạp (Trung Quốc) của Zhao (2003) đạt trung bình 675 bào tử/100g đất, minh chứng cho thấy hoạt động canh tác nông nghiệp có tác động làm giảm mật độ bào tử tự nhiên. Để dữ liệu được minh họa sinh động trong các nghiên cứu mở rộng, toàn bộ các biến thiên này có thể được biểu diễn trực quan qua biểu đồ cột so sánh mật độ bào tử giữa các nhóm đất và bảng ma trận thể hiện tần suất xuất hiện của 20 loài AMF trên từng vùng sinh thái.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát huy tối đa tiềm năng sinh học của nấm rễ nội cộng sinh bản địa phục vụ phát triển nông nghiệp xanh, 4 nhóm giải pháp cụ thể được đề xuất:

• Tuyển chọn và nhân nuôi sinh khối các chủng AMF bản địa ưu thế: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học phối hợp cùng Bộ môn Vi sinh vật (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) thực hiện quy trình phân lập thuần khiết và nhân giống in vivo các chủng có khả năng thích nghi cao như Glomus intraradices, Acaulospora morrowiae và Gigaspora margarita trên cây ký chủ ngô trong thời gian từ 6 đến 12 tháng, đặt mục tiêu tạo ra nguồn giống đạt mật độ từ 500 đến 1000 bào tử hoạt tính trên mỗi gam giá thể.
• Sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật AMF thế hệ mới: Các viện nghiên cứu nông nghiệp liên kết với các doanh nghiệp sản xuất phân bón sinh học trong giai đoạn 2019-2021 để chuẩn hóa quy trình công nghệ tạo chế phẩm dạng bột hoặc hạt bao bọc sợi nấm và bào tử, hướng tới mục tiêu nâng cao khả năng hòa tan và hấp thu lân của cây trồng thêm 25% đến 40%, đồng thời tiết giảm từ 20% đến 30% lượng phân lân vô cơ bón vào đất.
• Triển khai mô hình canh tác ngô hữu cơ ứng dụng nấm rễ tại địa phương: Trung tâm Khuyến nông các tỉnh Hà Nam và Hà Nội chủ trì áp dụng quy trình xử lý hạt giống ngô kết hợp bón chế phẩm nấm rễ liều lượng từ 80 đến 140 kg/ha tại các vùng chuyên canh trong giai đoạn 2020-2022, hướng tới mục tiêu tăng năng suất hạt từ 5% đến 15% và giảm 40% tỷ lệ cây chết do bệnh thối đen gốc rễ.
• Ban hành quy trình kỹ thuật canh tác bảo tồn hệ sinh thái vi sinh vật đất: Cơ quan khuyến nông hướng dẫn người nông dân giảm 50% số lần cày xới sâu quá 20 cm, hạn chế tối đa các loại thuốc trừ nấm hóa học phổ rộng và áp dụng chế độ luân canh ngô với các cây họ đậu nhằm duy trì mật độ bào tử AMF tự nhiên luôn ổn định trên mức 150 bào tử/100g đất qua các vụ mùa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Giảng viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học và Khoa học đất: Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình chuẩn hóa từ kỹ thuật lấy mẫu rễ tầng 3 đến 20 cm, phương pháp sàng ướt ly tâm gradient sucrose, đến kỹ thuật Nested-PCR khuếch đại đoạn gen 18S rRNA dài 800 bp phục vụ công tác giảng dạy và thực hiện các đề tài nghiên cứu chuyên sâu.
• Các nhà khoa học tại Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Viện Bảo vệ Thực vật và Viện Công nghệ Sinh học: Nguồn tư liệu trực quan về hình thái học hiển vi, khóa phân loại của 20 loài AMF và bộ dữ liệu giải trình tự gen là cơ sở tham chiếu chính xác cho các nghiên cứu đánh giá đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại vi nấm đất tại Việt Nam.
• Cán bộ quản lý kỹ thuật tại các Trung tâm Khuyến nông và Chi cục Trồng trọt: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về sự khác biệt mật độ bào tử từ 45,83 đến 165,75 bào tử/100g đất giữa các vùng đất cát pha và đất thịt chua, giúp cán bộ kỹ thuật xây dựng các giải pháp cải tạo đất và chuyển giao kỹ thuật bón phân vi sinh phù hợp cho từng tiểu vùng sinh thái.
• Doanh nghiệp sản xuất phân bón sinh học và chế phẩm vi sinh nông nghiệp: Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng về các đặc tính sinh học của các chi nấm ưu thế như Glomus và Acaulospora để lập dự án đầu tư công nghệ nhân sinh khối, sản xuất chế phẩm sinh học Mycorrhiza thương mại quy mô công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

• Nấm rễ nội cộng sinh AMF đem lại những lợi ích sinh học cụ thể nào đối với cây ngô? Hệ sợi nấm AMF phát triển kéo dài từ 1 đến 20 mét trên mỗi gam đất giúp mở rộng vùng hấp thu khoáng chất ngoài rễ, tăng cường hiệu quả hấp thu phospho vô cơ khó tan từ 35% đến 98%. Ngoài ra, AMF kích thích cây tiết enzyme phòng vệ giúp giảm từ 30% đến 45% nguy cơ nhiễm nấm bệnh vùng rễ và duy trì năng suất ngô tăng từ 5% đến 15% trong điều kiện hạn hán.

• Tại sao nghiên cứu cần phối hợp cả phương pháp hình thái học và sinh học phân tử? AMF là vi sinh vật nội sinh bắt buộc không thể nuôi cấy trên đĩa thạch dinh dưỡng thông thường, trong khi bào tử tự nhiên dễ bị biến đổi hình thái do tác động môi trường. Việc kết hợp nhuộm Melzer nhận diện cấu trúc vách bào tử và thực hiện Nested-PCR mồi AML1/AML2 khuếch đại gen 18S rRNA dài 800 bp giúp đảm bảo độ chính xác định danh tuyệt đối với độ tương đồng chuỗi đạt trên 97%.

• Mật độ bào tử AMF tại Duy Tiên (Hà Nam) và Thường Tín (Hà Nội) có sự chênh lệch như thế nào? Mật độ bào tử trung bình tại Duy Tiên đạt 165,75 bào tử/100g đất, cao gấp 3,61 lần so với mức 45,83 bào tử/100g đất tại Thường Tín. Nguyên nhân chính là do đất phù sa Duy Tiên tơi xốp, giữ ẩm tốt, trong khi đất tại Thường Tín bị nén dẽ và chịu ảnh hưởng tiêu cực từ việc thâm canh sử dụng nhiều phân bón vô cơ.

• Loại đất canh tác nào ghi nhận mật độ bào tử AMF cao nhất trong kết quả nghiên cứu? Các mẫu đất phù sa pha cát tơi xốp và đất cát pha ẩm tạo môi trường thuận lợi nhất cho sự sinh sản của AMF. Nghiên cứu ghi nhận mẫu N04 tại Hà Nam đạt mật độ cao nhất lên đến 304,00 bào tử/100g đất, và các mẫu đất cát pha ẩm N06 đến N10 tại Hà Nội cũng đạt mật độ vượt trội từ 77,33 đến 102,00 bào tử/100g đất.

• Quy trình phân lập bào tử nấm AMF từ đất trồng ngô được tiến hành qua các bước cơ bản nào? Quy trình gồm lấy 100g đất xử lý qua hệ thống rây lọc kích thước 500, 250, 100 và 50 micromet, sau đó chuyển phần cặn vào dung dịch đường sucrose nồng độ 30% đến 50% để ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 2 đến 5 phút. Bào tử thu được tiếp tục được khử trùng bề mặt bằng dung dịch cloramin 2% trước khi soi tách đơn bào tử dưới kính hiển vi.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công 3174 bào tử và xác định được 20 loài nấm rễ nội cộng sinh thuộc 6 chi chính trong đất trồng ngô tại miền Bắc Việt Nam, khẳng định sự ưu thế của hai chi Acaulospora và Glomus.
• Công trình chứng minh tính đa dạng sinh học và mật độ bào tử tại vùng đất phù sa Duy Tiên - Hà Nam (trung bình 165,75 bào tử/100g đất) cao vượt trội gấp 3,61 lần so với vùng đất Thường Tín - Hà Nội (trung bình 45,83 bào tử/100g đất).
• Xây dựng hoàn chỉnh hệ thống quy trình chuẩn kết hợp giữa kỹ thuật sàng ướt ly tâm, phân loại hình thái học qua thuốc thử Melzer và định danh sinh học phân tử qua đoạn gen 18S rRNA bằng cặp mồi đặc hiệu AML1/AML2.
• Cung cấp cơ sở khoa học và nguồn dữ liệu thực nghiệm giá trị phục vụ lộ trình giai đoạn 2019-2025 về nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm rễ sinh học nhằm nâng cao năng suất ngô và giảm thiểu phân bón hóa học.
• Các nhà khoa học, cơ quan quản lý nông nghiệp và doanh nghiệp phân bón vi sinh cần tăng cường liên kết để sớm đưa các chủng AMF bản địa ưu thế vào sản xuất thương mại, thúc đẩy nền nông nghiệp hữu cơ bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nấm rễ nội cộng sinh (AMF - Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhóm nấm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao. Đây là quần hợp nấm - thực vật đƣợc biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng nhƣ hệ sinh thái. AMF đƣợc phát hiện từ ít nhất 400 triệu năm trƣớc, có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển, sinh sản của cả thực vật và nấm. Đây đƣợc xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng, đƣợc tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng 90% các loài thực vật [74].

Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhƣng mối quan hệ giữa nấm và thực vật đƣợc đƣợc coi là mối quan hệ “Hội sinh”, do nó mang lại lợi ích cho cả vật chủ và nấm. Trƣớc hết, nấm nhận đƣợc các sản phẩm quang hợp từ thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lƣới hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dƣỡng và cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất khác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nƣớc và chất dinh dƣỡng nhƣ phốt pho, lƣu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dƣỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ. Ngoài ra, sự cộng sinh của nấm đã đƣợc chứng minh là giúp cho cây trồng có khả năng chống chịu đƣợc sự khô hạn hay đề kháng với một số tác nhân gây bệnh [55,57]. Cây ngô là nhóm cây chủ lực của Việt Nam, đứng thứ hai sau cây lúa.

Tuy nhiên, sự đa dạng nấm AMF trong đất trồng ngô ở Việt Nam cũng nhƣ mối tƣơng quan giữa điều kiện môi trƣờng sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô còn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Việc nghiên cứ sự có mặt của AMF trong đất trồng ngô sẽ góp phần làm rõ hơn về sự đa dạng của nhóm nấm này trên cây ngô. Đồng thời, từ kết quả nghiên cứu có thể lựa chọn đƣợc những loài ƣu thế, tìm hiểu đƣợc vai trò và có những đặc tính của AMF trong việc ứng dụng nâng cao năng suất cây trồng. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Xuất phát từ những lý do nếu trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng thành phần loài nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng ngô” đƣợc tiến hành với các mục tiêu nghiên cứu sau: 1.

Phân lập, phân loại các chủng nấm rễ nội cộng sinh từ đất trồng ngô tại Hà Nội và Hà Nam. Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tƣơng quan giữa điều kiện môi trƣờng sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Nấm rễ nội cộng sinh Nấm rễ (Mycorrhizal) là một hình thức sinh trƣởng cộng sinh giữa thực vật và nấm. Đây là quần hợp nấm - thực vật đƣợc biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng nhƣ nhiều hệ sinh thái, với hơn 90% các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vào mối quan hệ này để tồn tại [67].

Có hai loại nấm rễ: nấm rễ nội sinh và nấm rễ ngoại sinh [63]. Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF) là nhóm cộng sinh bắt buộc với thực vật và thuộc ngành Glomeromycota. Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizal) là sợi nấm bao quanh rễ dinh dƣỡng chƣa hóa gỗ, không xuyên qua mô tế bào mà chỉ kéo dài giữa các vách tế bào. Để phát triển, đầu tiên bào tử nấm thâm nhập qua tế bào vỏ của rễ cây, sau đó màng sinh chất của tế bào chủ bao quanh sợi nấm, tạo ra những vòng xoắn của sợi nấm ở bên trong tế bào.

Nấm rễ cộng sinh vào rễ thực vật, hình thành hệ sợi, mở rộng thành mạng lƣới vào đất xung quanh rễ và hình thành một mối liên kế cơ bản và quan trọng giữa thực vật và môi trƣờng xung quanh nó. Sự nội cộng sinh nấm và rễ cây thực chất là hình thức hỗ sinh. Cả hai bên sử dụng chất dinh dƣỡng trong mối quan hệ tƣơng hỗ, nấm rễ giúp thực vật lấy dinh dƣỡng nhƣ photpho, sulfur, nitrogen và các vi lƣợng từ đất. Sự cộng sinh của nấm làm cải thiện khả năng hấp thụ và tuổi đời rễ, tăng cƣờng hấp thu các dinh dƣỡng đặc biệt là phốt phát và giảm khả năng nhiễm bệnh của cây [55,57].

Các nấm này đồng thời cũng giảm những ảnh hƣởng gây ra bởi các vi sinh vật nhiễm vào rễ, đất mặn, hay bởi nƣớc tù [46].2 Lịch sử nghiên cứu Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ). Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này.

Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V). Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A). Do vậy, tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây. Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [26].

Những nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nấm AMF, còn sự hình thành thể V không thấy có mặt ở tất cả nấm nội cộng sinh. Do vậy, loại hình cộng sinh này còn có tên gọi là “Arbuscular Mycorrhiza” tuy nhiên tên này vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất. Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu đƣợc công bố sau này, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” bắt đầu từ năm 2008 [30].3 Phƣơng pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh 1.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh Nấm rễ nội cộng sinh có đặc điểm không thể nuôi cấy đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng mà chỉ có thể sinh trƣởng phát triển trong rễ cây nên việc phân lập nấm rễ nội cộng sinh phải gián tiếp dựa vào sự có mặt của các bào tử trong đất xung quanh rễ thực vật.

Hay nói các khác, việc phân lập nấm rễ nội cộng sinh đƣợc thực hiện thông qua việc phân lập các bào tử của loài nấm này. Bào tử AMF phân bố rộng rãi trong lòng đất, từ bề mặt phía trên đến độ sâu 2,2m. Tuy nhiên, 70-85% các bào tử là đƣợc tìm thấy ở lớp đất bề mặt 3-10 cm 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Do vậy, để phân lập AMF, lấy các mẫu đất đã đƣợc loại bỏ lớp bên ngoài (3 cm ở phía trên) để đảm bảo mật độ, cấu trúc quần thể nấm AMF không bị ảnh hƣởng của các yếu tố (ánh sáng, nhiệt độ,…).

Để phân lập AMF, trƣớc hết cần tách bào tử từ đất bằng phƣơng pháp sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc Gerdemann, 1963 đã cải biên cho phù hợp với nấm nội cộng sinh [38]. Trên cơ sở đó, nhóm tác giả Daniel và Skipper, 1982 và tiếp sau đó tác giả Tommerup, 1992 đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng ƣớt (wet sieving) kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [28,70]. Phƣơng pháp tích cực và hiệu quả nhất thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu của Brundrett, 1996 là dùng sàng lọc với các kích cỡ màng khác nhau: 250µm, 100µm và 45µm đƣờng kính lỗ sàng kết hợp với ly tâm ở các nồng độ đƣờng khác nhau [28].

Bào tử AMF sau khi phân lập đƣợc phân loại dựa vào hình thái, kích thƣớc theo khóa phân loại của Monton, 1988; Schenck và Pertez, 1990 [51,62].1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái học Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung. Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF.

Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra rằng nhóm Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh là Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới). Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ đã phân 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone) [36]. Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [71], đến năm 1987 Walker cũng đề xuất nhƣ trên [74]. Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới Glomales [52].

Thông thƣờng, việc phân loại nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và cấu trúc của các loại bào tử. Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton [51].