MỞ ĐẦU Nấm rễ nội cộng sinh (AMF - Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhóm nấm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao. Đây là quần hợp nấm - thực vật đƣợc biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng nhƣ hệ sinh thái. AMF đƣợc phát hiện từ ít nhất 400 triệu năm trƣớc, có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển, sinh sản của cả thực vật và nấm. Đây đƣợc xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng, đƣợc tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng 90% các loài thực vật [74].
Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhƣng mối quan hệ giữa nấm và thực vật đƣợc đƣợc coi là mối quan hệ “Hội sinh”, do nó mang lại lợi ích cho cả vật chủ và nấm. Trƣớc hết, nấm nhận đƣợc các sản phẩm quang hợp từ thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lƣới hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dƣỡng và cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất khác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nƣớc và chất dinh dƣỡng nhƣ phốt pho, lƣu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dƣỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ. Ngoài ra, sự cộng sinh của nấm đã đƣợc chứng minh là giúp cho cây trồng có khả năng chống chịu đƣợc sự khô hạn hay đề kháng với một số tác nhân gây bệnh [55,57]. Cây ngô là nhóm cây chủ lực của Việt Nam, đứng thứ hai sau cây lúa.
Tuy nhiên, sự đa dạng nấm AMF trong đất trồng ngô ở Việt Nam cũng nhƣ mối tƣơng quan giữa điều kiện môi trƣờng sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô còn chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Việc nghiên cứ sự có mặt của AMF trong đất trồng ngô sẽ góp phần làm rõ hơn về sự đa dạng của nhóm nấm này trên cây ngô. Đồng thời, từ kết quả nghiên cứu có thể lựa chọn đƣợc những loài ƣu thế, tìm hiểu đƣợc vai trò và có những đặc tính của AMF trong việc ứng dụng nâng cao năng suất cây trồng. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Xuất phát từ những lý do nếu trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng thành phần loài nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng ngô” đƣợc tiến hành với các mục tiêu nghiên cứu sau: 1.
Phân lập, phân loại các chủng nấm rễ nội cộng sinh từ đất trồng ngô tại Hà Nội và Hà Nam. Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tƣơng quan giữa điều kiện môi trƣờng sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Nấm rễ nội cộng sinh Nấm rễ (Mycorrhizal) là một hình thức sinh trƣởng cộng sinh giữa thực vật và nấm. Đây là quần hợp nấm - thực vật đƣợc biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng nhƣ nhiều hệ sinh thái, với hơn 90% các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vào mối quan hệ này để tồn tại [67].
Có hai loại nấm rễ: nấm rễ nội sinh và nấm rễ ngoại sinh [63]. Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF) là nhóm cộng sinh bắt buộc với thực vật và thuộc ngành Glomeromycota. Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizal) là sợi nấm bao quanh rễ dinh dƣỡng chƣa hóa gỗ, không xuyên qua mô tế bào mà chỉ kéo dài giữa các vách tế bào. Để phát triển, đầu tiên bào tử nấm thâm nhập qua tế bào vỏ của rễ cây, sau đó màng sinh chất của tế bào chủ bao quanh sợi nấm, tạo ra những vòng xoắn của sợi nấm ở bên trong tế bào.
Nấm rễ cộng sinh vào rễ thực vật, hình thành hệ sợi, mở rộng thành mạng lƣới vào đất xung quanh rễ và hình thành một mối liên kế cơ bản và quan trọng giữa thực vật và môi trƣờng xung quanh nó. Sự nội cộng sinh nấm và rễ cây thực chất là hình thức hỗ sinh. Cả hai bên sử dụng chất dinh dƣỡng trong mối quan hệ tƣơng hỗ, nấm rễ giúp thực vật lấy dinh dƣỡng nhƣ photpho, sulfur, nitrogen và các vi lƣợng từ đất. Sự cộng sinh của nấm làm cải thiện khả năng hấp thụ và tuổi đời rễ, tăng cƣờng hấp thu các dinh dƣỡng đặc biệt là phốt phát và giảm khả năng nhiễm bệnh của cây [55,57].
Các nấm này đồng thời cũng giảm những ảnh hƣởng gây ra bởi các vi sinh vật nhiễm vào rễ, đất mặn, hay bởi nƣớc tù [46].2 Lịch sử nghiên cứu Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ). Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này.
Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V). Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A). Do vậy, tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây. Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [26].
Những nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nấm AMF, còn sự hình thành thể V không thấy có mặt ở tất cả nấm nội cộng sinh. Do vậy, loại hình cộng sinh này còn có tên gọi là “Arbuscular Mycorrhiza” tuy nhiên tên này vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất. Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu đƣợc công bố sau này, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” bắt đầu từ năm 2008 [30].3 Phƣơng pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh 1.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh Nấm rễ nội cộng sinh có đặc điểm không thể nuôi cấy đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng mà chỉ có thể sinh trƣởng phát triển trong rễ cây nên việc phân lập nấm rễ nội cộng sinh phải gián tiếp dựa vào sự có mặt của các bào tử trong đất xung quanh rễ thực vật.
Hay nói các khác, việc phân lập nấm rễ nội cộng sinh đƣợc thực hiện thông qua việc phân lập các bào tử của loài nấm này. Bào tử AMF phân bố rộng rãi trong lòng đất, từ bề mặt phía trên đến độ sâu 2,2m. Tuy nhiên, 70-85% các bào tử là đƣợc tìm thấy ở lớp đất bề mặt 3-10 cm 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Do vậy, để phân lập AMF, lấy các mẫu đất đã đƣợc loại bỏ lớp bên ngoài (3 cm ở phía trên) để đảm bảo mật độ, cấu trúc quần thể nấm AMF không bị ảnh hƣởng của các yếu tố (ánh sáng, nhiệt độ,…).
Để phân lập AMF, trƣớc hết cần tách bào tử từ đất bằng phƣơng pháp sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc Gerdemann, 1963 đã cải biên cho phù hợp với nấm nội cộng sinh [38]. Trên cơ sở đó, nhóm tác giả Daniel và Skipper, 1982 và tiếp sau đó tác giả Tommerup, 1992 đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng ƣớt (wet sieving) kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [28,70]. Phƣơng pháp tích cực và hiệu quả nhất thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu của Brundrett, 1996 là dùng sàng lọc với các kích cỡ màng khác nhau: 250µm, 100µm và 45µm đƣờng kính lỗ sàng kết hợp với ly tâm ở các nồng độ đƣờng khác nhau [28].
Bào tử AMF sau khi phân lập đƣợc phân loại dựa vào hình thái, kích thƣớc theo khóa phân loại của Monton, 1988; Schenck và Pertez, 1990 [51,62].1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái học Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung. Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF.
Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra rằng nhóm Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh là Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới). Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ đã phân 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone) [36]. Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [71], đến năm 1987 Walker cũng đề xuất nhƣ trên [74]. Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới Glomales [52].
Thông thƣờng, việc phân loại nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và cấu trúc của các loại bào tử. Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton [51].