Luận văn thạc sĩ về hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất và rễ cam tại Nghệ An

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất và rễ cam tại quỳ hợp tỉnh nghệ an, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Lê Thị Thủy
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hệ Nấm Cộng Sinh Arbuscular Mycorrhiza Trong Đất Và Rễ Cam Tại Quỳ Hợp - Nghệ An
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA FUNGI (AMF)
• 1.2. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA
• 1.2.1. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF
• 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA
• 1.3.1. Phương pháp tách bào tử
• 1.3.2. Quan sát, đếm số lượng bào tử
• 1.3.3. Xác định dạng xâm nhiễm
• 1.4. SỰ PHÁT TÁN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA AMF ĐỐI VỚI THỰC VẬT CHỦ

Tóm tắt

I. Tổng quan về hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất và rễ cam

Hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza (AMF) đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây trồng, đặc biệt là cây cam tại Quỳ Hợp, Nghệ An. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự phân bố và tác động của AMF trong đất và rễ cam. AMF giúp cây hấp thu dinh dưỡng hiệu quả hơn, đặc biệt trong điều kiện đất nghèo dinh dưỡng. Việc nghiên cứu hệ nấm này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cho sản xuất nông nghiệp.

1.1. Khái niệm về nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza

Nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza là loại nấm sống cộng sinh với rễ cây, giúp cây hấp thu nước và khoáng chất. Chúng tạo ra mối quan hệ tương hỗ, trong đó nấm cung cấp dinh dưỡng cho cây, trong khi cây cung cấp carbohydrate cho nấm.

1.2. Vai trò của AMF trong sinh thái đất

AMF có vai trò quan trọng trong việc cải thiện cấu trúc đất, tăng cường độ phì nhiêu và khả năng giữ nước. Chúng cũng giúp giảm thiểu tác động của các yếu tố bất lợi như hạn hán và đất nghèo dinh dưỡng.

II. Thách thức trong nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza tại Nghệ An

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu hệ nấm cộng sinh tại Nghệ An gặp phải một số thách thức. Đất trồng cam thường có độ pH thấp và thiếu hụt dinh dưỡng, điều này ảnh hưởng đến sự phát triển của AMF. Ngoài ra, việc xác định thành phần loài AMF trong đất cũng gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của chúng.

2.1. Đặc điểm đất trồng cam tại Quỳ Hợp

Đất trồng cam tại Quỳ Hợp thường có độ pH thấp, ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mycorrhiza. Đặc điểm này cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để tìm ra giải pháp cải thiện.

2.2. Khó khăn trong việc xác định loài AMF

Việc xác định loài AMF trong đất trồng cam gặp khó khăn do sự đa dạng và biến đổi của chúng. Cần áp dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định chính xác thành phần loài.

III. Phương pháp nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza

Nghiên cứu hệ nấm arbuscular mycorrhiza được thực hiện thông qua các phương pháp phân lập và xác định loài. Các mẫu đất và rễ cam sẽ được thu thập và phân tích để xác định sự hiện diện và phân bố của AMF. Phương pháp sinh học phân tử sẽ được áp dụng để xác định chính xác các loài nấm.

3.1. Phương pháp thu thập mẫu đất và rễ

Mẫu đất và rễ cam sẽ được thu thập từ các khu vực khác nhau tại Quỳ Hợp. Việc thu thập mẫu cần đảm bảo tính đại diện cho toàn bộ khu vực nghiên cứu.

3.2. Phân tích và xác định loài AMF

Các mẫu sẽ được phân tích bằng phương pháp sàng ướt và nhuộm màu để xác định sự hiện diện của AMF. Phương pháp sinh học phân tử sẽ được sử dụng để xác định chính xác các loài nấm.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của hệ nấm cộng sinh

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của nhiều loài AMF trong đất và rễ cam tại Quỳ Hợp. Những loài này có khả năng cải thiện sự phát triển của cây cam, giúp tăng năng suất và chất lượng quả. Việc ứng dụng AMF trong canh tác cam có thể giúp nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp tại địa phương.

4.1. Thành phần loài AMF trong đất trồng cam

Nghiên cứu xác định được nhiều loài AMF có mặt trong đất trồng cam, cho thấy sự đa dạng sinh học của hệ nấm này. Những loài này có khả năng tương tác tốt với cây cam.

4.2. Tác động của AMF đến năng suất và chất lượng cam

Việc áp dụng AMF trong canh tác cam đã cho thấy sự cải thiện rõ rệt về năng suất và chất lượng quả. Điều này mở ra hướng đi mới cho sản xuất nông nghiệp bền vững.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza

Nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất và rễ cam tại Quỳ Hợp đã chỉ ra tầm quan trọng của AMF trong việc cải thiện năng suất cây trồng. Các kết quả nghiên cứu mở ra nhiều triển vọng cho việc ứng dụng AMF trong sản xuất nông nghiệp tại Nghệ An.

5.1. Tầm quan trọng của AMF trong nông nghiệp

AMF không chỉ giúp cây trồng phát triển tốt hơn mà còn cải thiện chất lượng đất. Việc ứng dụng AMF trong nông nghiệp có thể giúp tăng cường độ phì nhiêu của đất.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo về AMF

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các loài AMF và tác động của chúng đến các loại cây trồng khác nhau. Việc này sẽ giúp tối ưu hóa ứng dụng AMF trong sản xuất nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF) hiện diện ở khoảng 60% đến 80% các loài thực vật trên toàn cầu, đóng vai trò sống còn trong việc tăng cường hấp thu dinh dưỡng và nâng cao khả năng chống chịu stress sinh học lẫn phi sinh học. Tại Việt Nam, với hơn 3.317.270 ha đất trồng trọt trên cạn, sản xuất nông nghiệp thường xuyên đối mặt với thách thức đất chua, nghèo dinh dưỡng và khô hạn. Trong đó, vùng trồng cam đặc sản Phủ Quỳ thuộc tỉnh Nghệ An với 50% đến 60% diện tích phân bố trên nền đất đỏ bazan đang đứng trước nguy cơ suy thoái độ phì nhiêu của đất và thoái hóa giống nghiêm trọng.

Trước thực trạng đó, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học tập trung giải quyết bài toán cốt lõi: Đánh giá hiện trạng đa dạng sinh học và tiềm năng ứng dụng của hệ nấm AMF trong việc phục hồi, cải thiện chất lượng cây cam đặc sản. Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu bao gồm: xác định thành phần loài và đặc điểm hình thái bào tử AMF; khảo sát quy luật phân bố của AMF theo các giống cam chủ lực như Xã Đoài, Vân Du, V2 và theo các tầng phẫu diện đất từ 0 đến 60 cm; đồng thời đánh giá khả năng cộng sinh thực nghiệm trên cây con và nhân bản đoạn gen chỉ thị phân tử SSU rDNA. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 60 mẫu đất và rễ thu thập tại xã Minh Tân, huyện Quỳ Hợp trong các đợt khảo sát vào tháng 8 và tháng 10 năm 2011. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc cung cấp cơ sở sinh học để phát triển chế phẩm vi sinh hữu cơ, giúp kích thích chiều dài rễ cây con tăng trưởng gấp hơn 2,7 lần và giảm thiểu phụ thuộc vào phân bón hóa học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng thuyết cộng sinh tương hỗ Mycorrhiza và nguyên lý dinh dưỡng khoáng thực vật, trong đó nấm AMF đóng vai trò mở rộng mạng lưới hấp thu nước và photpho khó tiêu qua hệ sợi nấm ngoài rễ để đổi lấy nguồn hợp chất cacbon từ cây chủ. Hệ thống phân loại học của Morton và Benny (1990) kết hợp với bảng phân loại của Trung tâm Nghiên cứu AMF Đài Loan (ACT, 1998) được sử dụng làm khung đối chiếu hình thái học. Các khái niệm then chốt được vận dụng xuyên suốt đề tài gồm: thể chùm (Arbuscular) - cấu trúc trao đổi chất chính bên trong tế bào vỏ rễ; thể túi (Vesicular) - cấu trúc lưu trữ lipid; sợi nấm nội sinh (Hyphae); bào tử phân sinh (Chlamydospore); và hệ số xâm nhiễm rễ.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 60 mẫu đất và rễ được thu thập có chủ đích theo phương pháp lấy mẫu lát cắt ngang của Hayman (1983) tại 3 tầng phẫu diện: tầng mặt 0 - 20 cm, tầng giữa 20 - 40 cm và tầng sâu 40 - 60 cm. Việc phân tầng mẫu giúp phản ánh chính xác mối tương quan giữa sự phân bố vi sinh vật và mật độ rễ hút của cây cam.

Quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm được tiến hành qua các bước tiêu chuẩn:

• Tách chiết bào tử từ 50 g mẫu đất bằng phương pháp sàng ướt qua hệ thống rây kích thước giảm dần từ 1000 µm đến 45 µm, kết hợp ly tâm phân tầng trong thang nồng độ dung dịch sucrose 50% ở tốc độ 11.000 vòng/phút trong 2 phút.
• Nhuộm cấu trúc xâm nhiễm nội sinh trong rễ bằng thuốc nhuộm Trypan blue 0,005% sau khi đã xử lý mô rễ bằng dung dịch KOH 10% ở 90°C trong 2 giờ.
• Đánh giá khả năng cộng sinh thực nghiệm trên 20 cây cam con gieo từ hạt, bổ sung từ 10 đến 15 bào tử AMF/bầu đất và theo dõi chỉ tiêu sinh trưởng định kỳ trong 3 tháng.
• Phân tích sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp cải tiến từ White (1990), thực hiện phản ứng PCR nhân đoạn gen SSU 18S rRNA bằng cặp mồi chuyên biệt VANS1_5 và NS21 với chu trình nhiệt 30 chu kỳ ở nhiệt độ gắn mồi tối ưu 50°C trong 1 phút, sau đó điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và tinh sạch sản phẩm bằng cột ly tâm silica.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 5 phát hiện then chốt về mặt cấu trúc quần thể và hiệu ứng sinh học của hệ nấm AMF tại vùng đất trồng cam Quỳ Hợp:

1. Đa dạng thành phần loài: Đã phát hiện 16 kiểu hình bào tử AMF thuộc 6 chi, 3 họ và 2 bộ phụ. Trong đó, chi Acaulospora chiếm ưu thế lớn nhất với 6 loài (chiếm 37,5%), chi Glomus có 3 loài (chiếm 18,75%), các chi Entrophospora, Sclerocystis và Gigaspora mỗi chi có 2 loài (chiếm 12,5%), và chi Glomites xuất hiện 1 loài duy nhất (chiếm 6,25%).
2. Phân hóa theo giống cây trồng: Giống cam bản địa Xã Đoài có độ đa dạng loài phong phú nhất với 16/16 loài hiện diện thuộc đầy đủ cả 6 chi. Giống nhập nội V2 ghi nhận 12 loài thuộc 4 chi (chiếm 75%), trong khi giống Vân Du có mức độ đa dạng thấp nhất với 9 loài thuộc 4 chi (chiếm 56,25%).
3. Phân bố theo độ sâu phẫu diện đất: Số lượng loài AMF giảm dần theo chiều sâu. Tầng đất mặt 0 - 20 cm tập trung toàn bộ 16 loài (100%), tầng 20 - 40 cm còn 12 loài (giảm 25%), và tầng sâu 40 - 60 cm chỉ còn 9 loài (giảm 43,75%).
4. Hiệu ứng kích thích sinh trưởng vượt trội: Sau 3 tháng nuôi cấy thực nghiệm, lô cây cam con được bổ sung 10 - 15 bào tử AMF đạt chiều dài rễ trung bình 13,0 ± 0,02 cm và số lượng rễ đạt 6,0 ± 0,05 rễ/cây. Ngược lại, lô đối chứng không bổ sung nấm chỉ đạt chiều dài rễ 4,8 ± 0,13 cm và 4,0 ± 0,02 rễ/cây, chứng minh AMF giúp tăng chiều dài rễ lên tới 170,8% và tăng số lượng rễ thêm 50%.
5. Khuếch đại thành công chỉ thị phân tử: Sản phẩm PCR đoạn gen SSU 18S rRNA cho một băng DNA duy nhất, đặc hiệu và sáng rõ ở kích thước xấp xỉ 0,5 kb (500 bp), tạo nguồn nguyên liệu tinh khiết phục vụ công tác giải trình tự gen.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác rõ rệt về thành phần loài AMF giữa các giống cam bắt nguồn từ đặc tính di truyền và sinh lý bộ rễ. Giống cam bản địa Xã Đoài phát triển hệ rễ khỏe, tán rộng và tiết ra lượng dịch rễ phong phú, tạo môi trường thuận lợi để thu hút nhiều chi nấm cộng sinh hơn so với các giống cam nhập nội. Quy luật phân bố giảm dần theo tầng đất phản ánh đúng đặc điểm giải phẫu rễ cam, nơi có tới 60% rễ hút (đường kính dưới 1 mm) tập trung ở tầng 0 - 20 cm - nơi có độ tơi xốp, giàu dưỡng khí và chất hữu cơ cao.

Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các công bố khoa học của Redhead (1980) và Tortora (2002) về xu hướng suy giảm mật độ vi sinh vật vùng rễ theo độ sâu. Khả năng kích thích sinh trưởng rễ cam con cũng củng cố vững chắc nhận định của Schonbeck (1989) và Dehne (1982) về vai trò hòa tan photpho khó tiêu và thúc đẩy hấp thu khoáng của sợi nấm. Các dữ liệu này được trực quan hóa thông qua biểu đồ cột so sánh số loài theo từng giống cây, bảng phân loại kích thước bào tử dao động từ 100 µm đến 200 µm và ảnh chụp điện di gel agarose hiển thị dải vạch 0,5 kb sắc nét.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm, 4 nhóm giải pháp kỹ thuật và quản lý được đề xuất nhằm nâng cao năng suất vùng cam:

1. Xây dựng quy trình nhân nuôi chế phẩm AMF bản địa: Giao Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Nghệ An phối hợp với các viện nghiên cứu vi sinh tuyển chọn các chủng ưu thế thuộc chi Acaulospora và Glomus, hướng đến mục tiêu sản xuất và cung ứng 50.000 liều chế phẩm nấm rễ cho các vườn ươm giống trong vòng 12 đến 24 tháng tới.
2. Áp dụng kỹ thuật lây nhiễm nấm sớm tại vườn ươm: Các hợp tác xã và hộ nông dân cần chủ động bổ sung 10 - 15 bào tử AMF vào từng bầu ươm ngay sau khi hạt nảy mầm từ 15 đến 20 ngày, đặt mục tiêu nâng tỷ lệ sống của cây con sau khi trồng ra đồng ruộng lên trên 95% và rút ngắn thời gian xuất vườn từ 15% đến 20% trong giai đoạn 2026 - 2027.
3. Cải tiến kỹ thuật canh tác bảo tồn hệ vi sinh vật tầng mặt: Nông dân vùng Quỳ Hợp cần hạn chế cày xới sâu quá 20 cm nhằm tránh làm đứt gãy mạng sợi nấm, định kỳ bón phân hữu cơ vi sinh 2 lần/năm để duy trì nguồn thức ăn cho nấm, đồng thời giảm lượng phân lân hóa học từ 30% đến 40%.
4. Mở rộng nghiên cứu giải trình tự và lưu trữ nguồn gen: Nhóm nghiên cứu tại các trường đại học cần tiếp tục giải trình tự đoạn gen 0,5 kb SSU rDNA đã phân lập, kết hợp phân tích các vùng gen ITS và LSU trong lộ trình 3 năm tới để đăng ký bản quyền nguồn gen nấm bản địa trên ngân hàng GenBank.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Nhà khoa học, giảng viên và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Nông học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn xác về quy trình sàng ướt ly tâm sucrose 50%, phương pháp nhuộm Trypan blue 0,005% và quy trình tối ưu hóa phản ứng PCR khuếch đại gen SSU 0,5 kb.
2. Kỹ sư nông nghiệp và cán bộ khuyến nông địa phương: Nắm bắt cơ sở khoa học về hệ vi sinh vật đất để thiết kế các gói kỹ thuật thâm canh cam an toàn sinh học và cải tạo đất thoái hóa tại khu vực Bắc Trung Bộ.
3. Chủ trang trại, hợp tác xã và nông hộ sản xuất giống cam: Vận dụng kỹ thuật cấy nấm AMF sớm nhằm tăng sinh khối rễ cây con lên hơn 170%, nâng cao sức đề kháng trước khô hạn và tiết kiệm chi phí phân bón.
4. Doanh nghiệp sản xuất phân bón sinh học và chế phẩm vi sinh: Khai thác 16 kiểu hình bào tử AMF đã được sàng lọc để phát triển dòng sản phẩm phân bón lá, phân bón gốc vi sinh hữu cơ chuyên dùng cho cây có múi.

Câu hỏi thường gặp

Nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF) mang lại lợi ích gì cho cây cam? AMF tạo mạng lưới sợi nấm len lỏi vào các khe đất nhỏ, giúp hòa tan photpho khó tiêu và hấp thu vi lượng hiệu quả. Thực nghiệm cho thấy cây cam con bổ sung AMF có chiều dài rễ đạt 13,0 cm, tăng hơn 170% so với cây không bổ sung, đồng thời nâng cao khả năng chịu hạn và ức chế các loài nấm bệnh hại rễ.

Tại sao giống cam Xã Đoài lại có số lượng loài nấm AMF đa dạng nhất? Cam Xã Đoài là giống bản địa lâu đời thích nghi tốt với điều kiện thổ nhưỡng Phủ Quỳ, sở hữu bộ rễ phân nhánh mạnh và tiết ra lượng dịch rễ dồi dào. Điều này thu hút đầy đủ 16 loài AMF thuộc 6 chi cộng sinh, trong khi các giống nhập nội như V2 hay Vân Du chỉ có từ 9 đến 12 loài.

Vì sao mật độ nấm AMF lại giảm mạnh ở các tầng đất sâu dưới 20 cm? Khoảng 60% lượng rễ hút của cây cam tập trung tại tầng đất mặt 0 - 20 cm do tầng này thoáng khí và giàu chất hữu cơ. Càng xuống sâu, lượng oxy giảm và mật độ rễ hút thưa thớt khiến số lượng loài AMF giảm từ 16 loài ở tầng mặt xuống còn 9 loài tại tầng 40 - 60 cm.

Phương pháp sinh học phân tử nào đã được sử dụng để định danh nấm AMF? Tác giả đã tách chiết DNA tổng số từ rễ nhiễm nấm và sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt VANS1_5 và NS21 để nhân đoạn gen chỉ thị 18S rRNA (SSU). Phản ứng chạy 30 chu kỳ ở nhiệt độ gắn mồi 50°C, tạo ra sản phẩm đặc hiệu có kích thước chuẩn khoảng 0,5 kb.

Ứng dụng nấm AMF vào thực tế có giúp giảm lượng phân bón hóa học không? Trong thực tế, hệ sợi nấm AMF giúp cây hấp thu triệt để các khoáng chất khó tiêu bị giữ chặt trong đất đỏ bazan. Nhờ khả năng chuyển hóa dinh dưỡng tự nhiên này, các vườn cam ứng dụng AMF có thể giảm từ 30% đến 40% lượng phân lân vô cơ mà cây vẫn sinh trưởng khỏe mạnh.

Kết luận

Luận văn đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với những đóng góp khoa học và thực tiễn nổi bật:

• Phát hiện và định danh 16 kiểu hình bào tử AMF thuộc 6 chi, 3 họ và 2 bộ phụ trong đất trồng cam tại Quỳ Hợp.
• Chứng minh giống cam bản địa Xã Đoài có độ đa dạng AMF phong phú nhất với toàn bộ 16 loài hiện diện.
• Khẳng định quy luật phân bố của AMF tập trung cao nhất ở tầng đất mặt 0 - 20 cm, tương thích với 60% mật độ rễ hút.
• Kiểm chứng thực nghiệm cho thấy AMF kích thích chiều dài rễ cam con đạt 13,0 cm (tăng 170,8% so với đối chứng 4,8 cm).
• Nhân bản và tinh sạch thành công đoạn gen chỉ thị phân tử SSU 18S rRNA có kích thước 0,5 kb phục vụ công tác định danh nguồn gen.

Trong lộ trình 6 đến 12 tháng tới, nhóm nghiên cứu dự kiến hoàn tất giải trình tự chuỗi nucleotide và triển khai thử nghiệm diện rộng tại các vùng chuyên canh cam. Quý bạn đọc, nhà khoa học và các đơn vị sản xuất nông nghiệp quan tâm hãy tham khảo chi tiết toàn văn tài liệu để ứng dụng các giải pháp công nghệ sinh học tiên tiến vào canh tác cây trồng bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA FUNGI (AMF) Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức – đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [53]. Sƣ̣ cộng sinh của Mycorrhiza với rễ đƣợc mô tả nhƣ (hình 1. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ).

Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae. Tuy nhiên, tên gọi này tồn tại không lâu vì không có ý nghĩa [33]. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này. Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V).

Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A). Do vậy, tên gọi “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây [19]. Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular –A rbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [23]. Những nghiên cƣ́u sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nhƣng không phải tất cả nấm nội cộng sinh đều hình thành thể V.

Do vậy, loại hình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn 4 cộng sinh này có thể đƣợc đổi tên là “Arbuscular Mycorrhiza”. Nói chung, tên gọi của nó vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất. Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại Lisboa – Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu mới đƣợc công bố, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” vào năm 2008 [28].

Sƣ̣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại của Gerdemann, 1963) [32] bảng 1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www. Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF Kích Tên chi Tên loài Hình dạng Mầu sắc thước Đặc điểm (µm) Có mầu nâu, mầu nâu đỏ, một số có Aggregatum Hình cầu, hình trứng, có cuống nhỏ 120-175 Thành bào tử mỏng, có 2 lớp.

mầu vàng nhạt Glomus Ambisporum Hình cầu hoặc hình trứng Mầu nâu, nâu đậm 100-150 Thành bào tử mỏng. Marcaropus Hình cầu hoặc hình trứng Nâu hoặc mầu vàng nhạt 100-125 Thành bào tử mỏng, có quả bào tử. Appendicul Hình cầu Có mầu vàng nhạt 150-175 Thành bào tử dày, 1-6 µm. a Delicate có quả bào tử, hình cầu Có mầu nâu, nâu đậm 100-175 Thành bào tử dày.

Dilatata Hình cầu, có quả bào tử Có mầu nâu, đen 125-200 Thành bào tử dày,có nhiều lớp. Acaulospora Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần Myriocarpa, Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử dày, có vách ngăn. Bireticulata Hình cầu, dạng quả lê Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt 150-200 Thành bào tử dày, có 3-4 lớp. Hình cầu Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử mỏng,1-2 lớp colombiana Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 Hình cầu hoặc hình trứng Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng nhạt 120-200 nhóm Entrophora schenckii.

Hình cầu ,hình tròn Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng 150-200 Thành dày chia bào tử thành 3 lớp. Coccogena Bào tử có dạng hình cầu, gần hình Có mầu nâu nhạt 100-150 Thành bào tử mỏng có 2 lớp. Sclerocystis cầu, elip Thành bào tử có 3 lớp,chia làm 2 Coremioides Bào tử có hình cầu, Có mầu nâu, nâu đậm 120-180 nhóm. Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên Glomites Rhyniensis Hình cầu hoặc hình elip Có mầu nâu đậm 150-200 tiếp, gồm nhiều lớp.

Bào tử thƣờng có hình cầu và gần Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 Candida, Có mầu nâu, nâu đậm, mầu nâu đỏ 120–160 Gigaspora hình cầu, một số có hình elip nhóm Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp, Albida Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150 gồm 3 – 5 lớp. 5 Căn cứ về mặt hình thái có thể chia nấm rễ thành 3 loại chủ yếu: Nấm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh. * Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza): Đây là một loại nấm hình thành mạng lƣới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút. Nấm r ễ ngoại cộng sinh thƣờng có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận thấy bằng mắt thƣờng).

* Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza): Đặc trƣng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lƣới Hartig. Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular). * Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza): Mang đặc trƣng của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng nhƣ sinh lý.

Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy có 7 hình thức cộng sinh: * Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF): Cộng sinh kiểu tạo bụi (chùm). * Ectomycorrhizas (ECM): Nấm rễ ngoại cộng sinh. * Orchid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây họ Lan (Orchidaceae). * Ericoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ Quyên (Ericales).

* Ectendo Mycorrhizas: Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh. * Arbutoid Mycorrhizas: Nấm rễ có cả nội cộng sinh và ngoại cộng sinh nhƣng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi Arbutus, Arctostaphylos và Arctous của họ Đỗ Quyên (Ericaceae). * Monotropoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh xuất hiện trong họ Monotropaceae của bộ Đỗ Quyên (Ericales). Theo thống kê của Harley (1959), khoảng 3% số cây có hoa ở các loài cây gỗ và cây bụi có ECM, 90% các loài cây thân cỏ có AMF, ngoài ra một số loài cây gỗ có cả ECM và AMF [32].

Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF (http://www.au/research/mycorrhiza [62]) 7 1. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF Thông thƣờng, việc phân loại nấm nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và cấu trúc (Bảng 1. Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton. Phƣơng pháp ADN và giải phẫu sẽ đƣợc dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn do Smith và Tinker đề xuất 1997 [51].

Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đƣa ra vào năm 1990 và đƣợc hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [39]. Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung.

Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF. Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra rằng Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh: Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) [31]. Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học – Viện Hàn lâm khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone). 8 Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [58], đến năm 1987 Walker cũng đề xuất nhƣ trên [60].

Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới Glomales [39]. Năm 1998,Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) đề nghị công nhận 2 chi mới là Glomites và Jimtrappea. Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT thƣờng đƣợc sử dụng ở các nƣớc châu Á. Năm 2008, Shipra Singh và đtg tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là: Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là: Archacospora và Paraglomus [49].

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA Phương pháp tách bào tử Muốn tiến hành phân loại thì công việc đầu tiên là tách bào tử từ đất. Thông thƣờng, bào tử đƣợc tách bằng sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để lọc tuyến trùng từ đất do Gerdermann đã cải biên cho phù hợp với nấm nội cộng sinh [32]. Trên cơ sở đó nhóm tác giả Daniel và Skipper (1982) và tiếp sau đó tác giả Tommerup (1992) đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng ƣớt (wet sieving) qua rây kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [25, 56].

Quan sát, đếm số lượng bào tử Tùy vào kích cỡ, quá trình quan sát bào tử có thể đƣợc thực hiện trên kính lúp hoặc kính hiển vi có độ phóng đại nhỏ. Số lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng Satorrius [24]. 9 Xác định dạng xâm nhiễm Để xác định các dạng xâm nhiễm, ngƣời ta tiến hành nhuộm Tryphan blue (0,005%) làm biến màu thể cần xác định trong rễ của cây chủ, do Philip và Hayman đề xuất cụ thể nhƣ sau: Đầu tiên, nấm rễ cộng sinh đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất nhằm loại bỏ đất và các tạp chất hữu cơ bám trên bề mặt của rễ sau đó đun nóng bằng dung dịch KOH 10% ở nhiệt độ 90 oC trong vòng 2h, sau đó rửa bằng axít và biến màu bởi Tryphan blue, kết quả là sợi nấm sẽ bắt màu xanh [43]. Đối với thực vật có nhiều sắc tố trong rễ, Kormanik và cộng sự đề xuất phƣơng pháp sử dụng fuschin làm mất màu những mẫu rễ cây cần quan sát [35].