CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA FUNGI (AMF) Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức – đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [53]. Sƣ̣ cộng sinh của Mycorrhiza với rễ đƣợc mô tả nhƣ (hình 1. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ).
Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae. Tuy nhiên, tên gọi này tồn tại không lâu vì không có ý nghĩa [33]. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này. Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V).
Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A). Do vậy, tên gọi “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây [19]. Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular –A rbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [23]. Những nghiên cƣ́u sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nhƣng không phải tất cả nấm nội cộng sinh đều hình thành thể V.
Do vậy, loại hình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn 4 cộng sinh này có thể đƣợc đổi tên là “Arbuscular Mycorrhiza”. Nói chung, tên gọi của nó vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất. Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại Lisboa – Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu mới đƣợc công bố, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” vào năm 2008 [28].
Sƣ̣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại của Gerdemann, 1963) [32] bảng 1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www. Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF Kích Tên chi Tên loài Hình dạng Mầu sắc thước Đặc điểm (µm) Có mầu nâu, mầu nâu đỏ, một số có Aggregatum Hình cầu, hình trứng, có cuống nhỏ 120-175 Thành bào tử mỏng, có 2 lớp.
mầu vàng nhạt Glomus Ambisporum Hình cầu hoặc hình trứng Mầu nâu, nâu đậm 100-150 Thành bào tử mỏng. Marcaropus Hình cầu hoặc hình trứng Nâu hoặc mầu vàng nhạt 100-125 Thành bào tử mỏng, có quả bào tử. Appendicul Hình cầu Có mầu vàng nhạt 150-175 Thành bào tử dày, 1-6 µm. a Delicate có quả bào tử, hình cầu Có mầu nâu, nâu đậm 100-175 Thành bào tử dày.
Dilatata Hình cầu, có quả bào tử Có mầu nâu, đen 125-200 Thành bào tử dày,có nhiều lớp. Acaulospora Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần Myriocarpa, Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử dày, có vách ngăn. Bireticulata Hình cầu, dạng quả lê Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt 150-200 Thành bào tử dày, có 3-4 lớp. Hình cầu Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử mỏng,1-2 lớp colombiana Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 Hình cầu hoặc hình trứng Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng nhạt 120-200 nhóm Entrophora schenckii.
Hình cầu ,hình tròn Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng 150-200 Thành dày chia bào tử thành 3 lớp. Coccogena Bào tử có dạng hình cầu, gần hình Có mầu nâu nhạt 100-150 Thành bào tử mỏng có 2 lớp. Sclerocystis cầu, elip Thành bào tử có 3 lớp,chia làm 2 Coremioides Bào tử có hình cầu, Có mầu nâu, nâu đậm 120-180 nhóm. Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên Glomites Rhyniensis Hình cầu hoặc hình elip Có mầu nâu đậm 150-200 tiếp, gồm nhiều lớp.
Bào tử thƣờng có hình cầu và gần Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 Candida, Có mầu nâu, nâu đậm, mầu nâu đỏ 120–160 Gigaspora hình cầu, một số có hình elip nhóm Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp, Albida Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150 gồm 3 – 5 lớp. 5 Căn cứ về mặt hình thái có thể chia nấm rễ thành 3 loại chủ yếu: Nấm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh. * Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza): Đây là một loại nấm hình thành mạng lƣới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút. Nấm r ễ ngoại cộng sinh thƣờng có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận thấy bằng mắt thƣờng).
* Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza): Đặc trƣng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lƣới Hartig. Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular). * Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza): Mang đặc trƣng của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng nhƣ sinh lý.
Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy có 7 hình thức cộng sinh: * Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF): Cộng sinh kiểu tạo bụi (chùm). * Ectomycorrhizas (ECM): Nấm rễ ngoại cộng sinh. * Orchid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây họ Lan (Orchidaceae). * Ericoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ Quyên (Ericales).
* Ectendo Mycorrhizas: Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh. * Arbutoid Mycorrhizas: Nấm rễ có cả nội cộng sinh và ngoại cộng sinh nhƣng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi Arbutus, Arctostaphylos và Arctous của họ Đỗ Quyên (Ericaceae). * Monotropoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh xuất hiện trong họ Monotropaceae của bộ Đỗ Quyên (Ericales). Theo thống kê của Harley (1959), khoảng 3% số cây có hoa ở các loài cây gỗ và cây bụi có ECM, 90% các loài cây thân cỏ có AMF, ngoài ra một số loài cây gỗ có cả ECM và AMF [32].
Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF (http://www.au/research/mycorrhiza [62]) 7 1. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF Thông thƣờng, việc phân loại nấm nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và cấu trúc (Bảng 1. Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton. Phƣơng pháp ADN và giải phẫu sẽ đƣợc dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn do Smith và Tinker đề xuất 1997 [51].
Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đƣa ra vào năm 1990 và đƣợc hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [39]. Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung.
Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF. Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra rằng Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh: Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) [31]. Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học – Viện Hàn lâm khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone). 8 Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [58], đến năm 1987 Walker cũng đề xuất nhƣ trên [60].
Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới Glomales [39]. Năm 1998,Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) đề nghị công nhận 2 chi mới là Glomites và Jimtrappea. Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT thƣờng đƣợc sử dụng ở các nƣớc châu Á. Năm 2008, Shipra Singh và đtg tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là: Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là: Archacospora và Paraglomus [49].
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA Phương pháp tách bào tử Muốn tiến hành phân loại thì công việc đầu tiên là tách bào tử từ đất. Thông thƣờng, bào tử đƣợc tách bằng sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để lọc tuyến trùng từ đất do Gerdermann đã cải biên cho phù hợp với nấm nội cộng sinh [32]. Trên cơ sở đó nhóm tác giả Daniel và Skipper (1982) và tiếp sau đó tác giả Tommerup (1992) đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng ƣớt (wet sieving) qua rây kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [25, 56].
Quan sát, đếm số lượng bào tử Tùy vào kích cỡ, quá trình quan sát bào tử có thể đƣợc thực hiện trên kính lúp hoặc kính hiển vi có độ phóng đại nhỏ. Số lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng Satorrius [24]. 9 Xác định dạng xâm nhiễm Để xác định các dạng xâm nhiễm, ngƣời ta tiến hành nhuộm Tryphan blue (0,005%) làm biến màu thể cần xác định trong rễ của cây chủ, do Philip và Hayman đề xuất cụ thể nhƣ sau: Đầu tiên, nấm rễ cộng sinh đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất nhằm loại bỏ đất và các tạp chất hữu cơ bám trên bề mặt của rễ sau đó đun nóng bằng dung dịch KOH 10% ở nhiệt độ 90 oC trong vòng 2h, sau đó rửa bằng axít và biến màu bởi Tryphan blue, kết quả là sợi nấm sẽ bắt màu xanh [43]. Đối với thực vật có nhiều sắc tố trong rễ, Kormanik và cộng sự đề xuất phƣơng pháp sử dụng fuschin làm mất màu những mẫu rễ cây cần quan sát [35].
