TS SGene Dc es eee a TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHITP _ VIEN CONG NGHE SINH HOC LAM NGHIEV ST cac Ngành : Công nghệ sinh học MESO Soh TT Gido view huony dar eee eee a eee Sink vien thực Hiện 00701107 000U MSV ;j954051431 Lú) D SG d0 sổ: [197127111102 a ou on a Ie a CIL AS 003.23 A4-/660>% | LV9334 TRUONG DAI HOC LAM NGHIEP VIEN CONG NGHE SINH HOC LAM NGHIEP „TA KHOA LUAN TOT NGHIEP PHAN TiCH MOI QUAN HE DI TRUYEN QUAN THE LONG NAO (Cinnamomum camphora) BANG KY THUAT RAPD LAM CO SO CHO BAO TON VA CAI THIEN GIONG Ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 307 Giáo viền hướng dẫn TS. Hà Văn Huân Sinh viên thựchiện =: Vai Thay Linh 0954051481 54- CNSH 2009 - 2013 Hà Nội - 2013 LOI CAM ON Để hoàn thành khóa luận này, tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập tại Viện. Tôi chân thành cảm ơn quý thay, cô tróng. Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, đã tận tình truyền đạt kiến thức €ho tôi suốt 4 năm học tập tại trường.
Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình họe không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hà Văn Huân - phó Viện Trưởng — Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, đã-tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, đồng kính chúc các cô, chú, anh, chị trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, nghiệp đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong cuộc sông, cũng như trong sự nghiên cứu giảng dạy. Tôi xin chân thành cm ơn! MUC LUC LOI CAM ON MUC LUC BANG DANH MUC TU VIET TAT DANH MUC BANG DANH MỤC HÌNH 6912719052. TÔNG QUAN TÀI LIỆU. sec⁄©< Đại cương về đối tượng nghiên CỨU.S ereer erie« -c«cs.
VỊ trí và phân. k e ĐT TÚ HH Hee 3 ccc2H 3 -ccce. Đặc điểm hình thái. Đặc tính sinh thái học.
oooo ooe 5 esscsesnencorenenevenesnensarassenenns 5 1. Gid tri str dung. Da dang di trayOn sss pescsscccconnscsssssconooroccecassssssnesnnsnasestsnsnee 1. Nguyên nhân phát sinh tính đa dạng di truyền.
Ý nghĩa của đa dạng di TTC6. su ly enrussoesosidiniodprogesftisfe --------cerererrrererrrrer 10 1. Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học. Nghiên cứu đá đạng sinh học trên Thể giới.
Nghiên cứu đa dạng sinh học tại Việt Nam. Nguyên lý của phản ứng PCR.------ trong phân tích đa 1. Các chỉ thị phân tử dựa vào phản ứng PCR dùng dạng di truyềez,„. CáccñỮỦM phântử khác RIÌP.
Kỹ ý thuậtthuật RÉLP. ------++cc+erseeer eerrerrtertereree 23 1. Kỹ thuật đa hình các Nueleotit đơn. Kỹ thuật SSCP.
KY thuat STS oo sssssssscsssssussecssssssscssssuvecsssssesesssvesessueesssseteessesecs 24 5. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. - Lsct Hs Son TH HT HH TH EE E11 Errrrerkrsessrses 26 2.
Mâu thực VẬT. SH HH HH gen CN gv vsrerrkekersex 26 VN 9. Hoa chat — thidt Di. Mục tiêu — Nội dung - Yêu 0 8 ẻẽa kẽ vx.
28 -- - cv Tà HH. Mục tiêu nghiên CỨU.oc s c s c6 06128186806 6S VÀ cung xi c SG SỜ ha 05018160 0010080401 g. Phương pháp nghiên cỨus. Phương pháp tách chiết ADN tổng sỐ.
Kiểm tra kết quả tách €hiết ADN tổng số. Phương pháp phân tích số liệu RAPD. KET QUA VÀ THẢO LUẬN. Hoàn thiện quy trình tách chiết ADN tổng số mẫu lá Long 3.
Kết quả tách chiết ADN tông số mẫu lá Long não. Kết quả sàng lọc môi phù hợp với đối tượng Long não. Kết quả phản ứng PCR— RAPD.nnnennnerreerrerrrerreree vào phân tích chỉ thị Quan-hệ-di truyền: của các cá thê Long não dựa BANG DANH MUC TU VIET TAT ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 8 Gam g/l Gam/lit Kb Kilobase LB Luria Bertani Mg/1 Miligam/lit NADH Nicotiamide Adenine Dinucleotide Hydroxyl PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic AND RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS Sodium dodecyl! sulphate STS Sequence Tagged Sites SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris — Acetic acid - EDTA Taq p9)yer2se Thermus aquaticus polymerase TE [ ` \, ‘Tris — ethylenediaminetetraacetic acid vit c [J - Vòngjphút DANH MUC BANG Bảng 2.1: Danh mục kí hệu các mẫu Long não được phân tích.2: Thành phần phản ứng PCR - RAPD.3: Chu trình nhiệt chạy PCR — RAPD.-2-©s-©csc2xvrerrsrrrrzrs 32 Bang 2.4: Tên và trình tự nucleotide của 9 mỗi RAPD.1: Nồng độ và độ tính sạch của dung dịch ADN tách chiết từ các mẫu oi.ốố ốố ố ẽẽ'Y .2: Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên của 15 mẫu Long não với môi CP14, được mã hóa thành ký hiệu 1 và Ö.3: Bảng ma trận biểu diễn hệ số tương đồng giữa các mẫu Long não phần tÍGÌissssssssssssssneasieisssn cooocooCoooo DUssssiosioO Thưnngungiggaonsrienasod N 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mô tả đặc điểm lá, hoa và quả Long não.2: Cành mang lá và hoa Løng não::.3: Gỗ Long não đùng đóng COME TED. nnn ecrsesrarsnansecarcecsnuasoennnaveneeene 6 Hình 1.4: Cây Long não lâu năm ở Buôn Ma Thuật.1: Hình ảnh điện đi ADN tông số của 10 mẫu Long não.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR - RAPD của 15 mẫu Long não MO DAU Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới, gió mùa ẩm, thuận lợi cho việc phát triển hệ thực vật phong phú.
Theo đánh giá của các chuyên gia bảo tồn trên Thế giới, Việt Nam là một trong số 16 quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất trên Thế gidi (WWF, IUCN, 2000). Gần đây, do.ảnh hưởng của thiên tai và khai thác bừa bãi, đặc biệt là các loài cây gỗ quý nên diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hạn hẹp. Hàng trăm-loài cây đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau, một số loài đang đứng trước nguy cớ' bị tuyệt chủng mà nguyên nhân chủ yếu vẫn là hậu quả của việc khai thác bừa bãi và tàn phá môi trường sống (Quách Thị Liên, Nguyễn Hoàng Nghĩa và cộng sự, 2004). Chi Qué 1a mét trong những chỉ điển hình của nhiều löài cây thân gỗ, đang bị khai thác cạn kiệt do giá trị kinh tế và giá trị sinh thái cao, trong đó được nhắc tới nhiều nhất là cây Long não.
Long não (Cinnamomum camphora) là một loài cây thân gỗ thuộc họ Re (Lauraceae), chi Qué (Cinnamomum), la cay gỗ có giá trị kinh tế cao, được ứng dụng rộng rãi trong y dược. Theo y học cổ truyền Long não có tác dụng: trừ thấp sát trùng, trị các chứng: ghẻ lở, cước khí sưng đau, đau răng. Do cây có giá trị kinh tế lớn rên bị khai thác mạnh, vì vậy công tác bảo vệ và nhân điểm giống là rất cần thiết. Mặt khác, đõ mỗi cây, mỗi xuất xứ có một đặc các xuất riêng nên cần phải phân loại, đánh giá đa dạng loài để tìm ra các cây, hiệu quả.
xứ có các gen tốt phục vụ cho công tác bảo tồn và nhân giống có quần Cũng như một số loài cây khác, việc đánh giá đa dạng di truyền thé modi chi ta frung vào một số đặc điểm hình thái. Theo phương pháp kết truyền thống Sử dụng. ac › gi thị hình thái, tuy nhiên phương pháp này cho n các kỹ thuậ os phan tử đã tạo nên một cuộc cách mang trong nghiê Cứu sự biến đổi. trực tiếp ở cấp độ ADN và có thể phát hiện ra lượng đến kỹ thuật RAPD.
RAPD lớn tính đa hình tạo ra đột biến, trong đó phải kể là một kỹ thuật cho phép phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền của quần thẻ, vì phương pháp này khá đơn giản, không đòi hỏi kỹ thuật cao, không phải sử dụng đồng vị phóng xạ, có thể phát hiện ra nhiều locus một lúc, nên được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá đa dang di truyén của nhiều loài sinh vật. Tại khu rừng thực nghiệm của trường ĐH Lâm Nghiệp, số lượng cá thể Long não không nhiều. Để có cơ sở dữ liệu, góp phần bảo tồn và sử dụng hiệu quả nguồn gen giống cây này, từ những giá trị kinh tế mà loài này mang lại và những ứng dụng triển vọng của kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, tôi đã lựa chọn đề tài: “Phân tích mỗi quan hệ di truyền quan thé Long néo (Cinnamomum camphora) bằng kỹ thuật RAPD lam co sở cho bảo tôn và cải thiện giông”. CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU 1.
Đại cương về đối tượng nghiên cứu 1. VỊ trí và phân loại Long não còn có tên gọi khác là: Dã hương, Rã hương, Chữơng não, Triéu não, hay Mão tử. VỊ trí: Gidi (Regnum): Plantae - Gidi phụ : Tracheobionta - Thuc vật có mạch - B6é (Ordo): Laurales - Ho (Familia): Lauraceae - Chi (Genus): Cinnnamomum - Loai (Species): C. Phan loai: Một công trình đã được công bố năm 1967, dựa vào thành phần hóa hoc tinh dầu của lá, người ta đã phân chỉa ra 5 type Long não khác nhau: - Cây Long não Li8alol - tỉnh đầu lá có chứa 80% linalol - Cây Long não Cineol - tinh dầu lá có chứa 76% cinelol - Cây Long.não Sesquitêrpen — tinh dầu lá có chứa 40 — 60% nerolidol - Cây Loñg não SafroL~ tỉnh dầu lá có chứa 80% safrol là các - Cây Long não Eucamphor — thành phần chủ yếu của tỉnh dầu lá hợp chất h 1.
Long não la cây gỗ lớn, có thể cao tới 40m, đường kính có thể đạt tới © nhãn, cành già màu nâu vàng, Vỏ xám tro, đứt dọc, cành non màu xanh mit doc. Chdi nhiều vay xép lop. Phiên lá hình trứng ngược Lá đơn mọc cách, mép nguyên lượn dài, đuôi nêm hoặc trái xoan dài 4-8,5cm, rộng 3-4,5cm, dau có mũi nhọn 3 rộng, mặt lá nhẫn, lưng lá phủ phắn trắng. Gân lá hình lông chim, đôi gân gần gốc dài và nỗi rõ, nách gân lá thường có tuyến nhẫn dạng sẹo.
Cuống lá mảnh, dài gần bằng 2/3 phiến lá. Khi non cuống lá màu nâu, khi già có màu trắng. Trên ngọn có vảy chỗi to. Chéi ngủ bao bọc qua mùa đông.
Hoa tự xim viên chùy mọc ở nách lá. Hoa lưỡng tính màu vàng nhạt, bao phấn 4 ngăn mở bằng nắp. Quả hạch hình cầu, đường kính 0,5cm. Khi chín màu tím đeñ; đế mập hình cốc, phần trên xòe rộng hình đĩa nâng quả.
Đặc tính sinh thái học. Long não là loài cây ưa sáng, hoàn toàn thích hợp nơi âm ướt. O Viét Nam, Long não mọc tương đối chậm.