MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Catechin là tên gọi chung của các hợp chất polyphenol được chiết xuất từ lá trà xanh Camellia sinensis .Catechin có các loại chính như: epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG), epicatechin (EC), catechin (C), gallocatechin gallate (GCG), gallocatechin (GC) và catechin gallate (CG) [1]. Catechin là hoạt chất sinh học có khả năng làm giảm các gốc tự do (được sinh ra và tích lũy trong quá trình sống, là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hóa ở người) và được dùng như một tác chất kháng oxi hóa có nguồn gốc tự nhiên, sử dụng rất hiệu quả và an toàn trong công nghệ thực phẩm để thay thế các chất kháng oxi hóa tổng hợp dễ gây tác dụng phụ có hại [2], [3]. Catechin có khả năng ức chế các enzym có nguồn gốc từ vi khuẩn và tiêu diệt các loại vi khuẩn làm hư hỏng thực phẩm và loại bỏ các độc tố do chúng gây ra do đó catechin là tác nhân kháng khuẩn được ứng dụng nhiều trong thực phẩm và là thành phần trong nhiều loại thực phẩm chức năng [2].
Catechin có khả năng ức chế sự tạo thành mạch mới, ức chế tăng trưởng tế bào và cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis), do đó catechin có khả năng ngăn ngừa và điều trị một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh răng miệng và có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá và gia tăng tuổi thọ [4]. Catechin cũng có tác dụng kháng viêm (bệnh viêm khớp, bệnh liên quan tim mạch, tuổi già, ung thư…), nhờ làm tăng cường sự tạo thành IL (Interleukin)- 10, một cytokine quan trọng trong quá trình kháng viêm [5]. 1 Nhờ những tác dụng quý giá như nói trên nên catechin có giá trị cao trên thị trường hiện nay. Tuy nhiên quy trình chiết tách catechin và đánh giá hoạt tính sinh học của catechin tại Việt Nam vẫn chưa được chuẩn hóa và thực hiện một cách bài bản.
Do đó, chúng tôi đề nghị thực hiện đề tài “Chiết xuất và đánh giá hoạt tính sinh học của catechin từ lá trà xanh Camellia sinensis”. Mục tiêu của đề tài Xây dựng quy trình tạo chế phẩm catechin từ lá trà xanh và đánh giá hoạt tính sinh học của catechin thu nhận được nhằm mục đích tạo được chế phẩm catechin có tiềm năng ứng dụng cao. Mục tiêu cụ thể: -Giai đoạn 1: Tối ưu hóa quy trình ly trích catechin từ lá trà xanh -Giai đoạn 2: Đánh giá hoạt tính sinh học của catechin 3. Ý nghĩa khoa học - Tiềm năng ứng dụng và tính mới của đề tài 3.
Ý nghĩa khoa học Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình tách chiết catechin từ lá trà xanh nhằm thu nhận sản phẩm bột catechin tạo nguyên liệu và cơ sở khoa học ban đầu để hướng đến ứng dụng catechin trong thực phẩm. Tiềm năng ứng dụng Trong lĩnh vực thực phẩm: Nhờ khả năng diệt cả 2 loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương nên có thể dùng làm chất kháng khuẩn. Nhờ có khả năng kháng oxi hóa, catechin có thể được dùng trong công nghệ thực phẩm để thay thế các chất chống oxi hóa tổng hợp dễ gây tác dụng phụ có hại. Trong lĩnh vực y dược: Nhờ khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào thường, catechin nên được dùng thay thế hoặc kết hợp cho các hóa 2 chất đang được dùng trong hóa trị liệu hiện nay nhằm làm giảm tác dụng phụ của chúng đồng thời giúp bệnh nhân hồi phục nhanh hơn.
Nhờ đặc tính tiêu diệt được cả những dòng tế bào kháng thuốc điều trị (như kháng thuốc Imatinid trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) và ung thư mô đệm đường tiêu hóa (GIST)), catechin có thể ứng dụng trong các trường hợp này giúp tăng cường hi vọng cho các bệnh nhân mắc phải. Catechin còn có khả năng tiêu diệt hiệu quả những dòng vi khuẩn đa kháng thuốc kháng sinh chẳng hạn như Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli (E. Coli) do đó catechin có thể góp phần kiểm soát vấn nạn này qua đó giúp giảm gánh nặng chi phí do phải bắt buộc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền. Tính mới của đề tài Trong đề tài chúng tôi thử nghiệm một quy trình cải tiến trong quá trình ly trích catechin từ lá trà xanh chưa được tiến hành ở cả trong và ngoài nước.
Chúng tôi cũng cập nhật, ứng dụng nhiều phương pháp và kỹ thuật mới, hiện đại, chính xác và chuyên biệt hơn để đánh giá hoạt tính sinh học của bột catechin ly trích được như hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng oxi hóa, kháng viêm và kháng ung thư. Tổng quan tài liệu 1. Giới thiệu chung về trà xanh Trà là một trong những loại thức uống được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới Trà được chiết xuất từ lá của cây trà Camellia sinensis, tùy thuộc vào phương pháp kỹ thuật được áp dụng trong quá trình chế biến mà trà được phân ra làm 4 loại sau: trà trắng, trà xanh, trà ô long và trà đen. Theo Trịnh Xuân Ngọ (2009) cây trà có nguồn gốc từ Đông Nam Á.
Đây là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao, được trồng ở hơn 30 quốc gia. Trà có nhiều giống khác nhau, các giống trà phổ biến hiện nay là: Thea Jiunnanica, Thea Assamica, Thea Ainensis, có nguồn gốc từ Trung Quốc và miền Bắc nước ta. Ngày nay, ở hầu hết các tỉnh có đều kiện thuận lợi đều trồng trà, trong đó có ba vùng trồng trà lớn nhất đó là: • Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái) chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc. • Vùng chè trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên).
Đây là vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy sản xuất lớn. • Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ yếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô Long. Thuộc tính hóa học của catechin Trong lá chè tươi, catechin chiếm khoảng từ 25-35% tổng trọng lượng khô, ngoài ra còn có caffeine (3.04%) và methylxanthines, lignin (6.5%) và các chất màu khác, theanine (4%) và các amino acid tự do (1–5.5%), và nhiều hợp chất tạo mùi khác [6]. 4 Catechin thuộc nhóm flavan-3-ols với cấu trúc cơ bản là 1 nhóm diphenylpropane với 2 vòng benzen (vòng A và B) được liên kết bởi 1 vòng dihydropyran heterocylic (vòng C) - hình thành từ 3 chuỗi carbon kín chứa oxygen.
Do đó, sườn cấu trúc của phân tử flavonoid là C6-C3-C6. Trong đó, vòng C có thể chứa 1 nhóm hydroxyl tại phân tử carbon số 3 (Hình 1. Catechin có 2 dạng đồng phân hình học (trans-isomer và cis-isomer) và 2 dạng đồng phần quang học (có 2 carbon ở vị trí C- 2 và C-3 trên vòng C) nên catechin thường tồn tại ở 4 dạng đồng phân cấu hình: 2 cấu hình trans- và 2 cấu hình cis- [7]. Đồng phân trans- và cis-isomer lần lượt tạo nên catechin và epiatechin.
Đồng phân epicatechin phổ biến nhất là (-)-epicatechin [7]. Hơn nữa vòng C có thể cấu dạng thành 2 đồng phân sau: đồng phân cấu dạng E (vòng B nằm trên mặt phẳng xích đạo giả) và đồng phân cấu dạng A (vòng B nằm trên mặt phẳng trục giả). Các nhóm chức chẳng hạn như ortho-34-dihydroxyl hoặc 345- trihydroxyl trên vòng B, 1 nhóm gallate tại vị trí C-3 của vòng C, và nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và C-7 của vòng A được báo cáo là có liên quan tới hoạt tính kháng oxi hóa của catechin [2], [7] Hình 1. Cấu trúc hóa học của flavonoid với khung sườn cơ bản C6-C3-C6 Catechin gồm các hợp chất chính như (+)-catechin (C); ()-epicatechin (EC); (+)-gallocatechin (GC); ()-epicatechin gallate (ECG); ()-epigallocatechin (EGC), và ()-epigallocatechin gallate (EGCG), trong đó EGCG là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất [8] (Hình 1.
Các hợp chất chính của catechin Catechin rất dễ bị oxi hóa bởi enzyme, acid và nhiệt độ [6]. Khi có sự hiện diện của enzyme polyphenol oxidase (PPO), catechin dễ dàng bị oxi hóa thành theaflavin và thearubigin (Hình 1. Trong suốt quá trình chế biến trà ô long hoặc trà đen, PPO được kích hoạt để oxi hóa toàn bộ catechin, do đó hàm lượng catechin trong trà đen và trà oolong thấp hơn so với trà xanh (PPO bị bất hoạt ngay khi thu hoạch xong) [6], [9]. Chính vì thế hàm lượng EGCG trong trà xanh rất cao (550mg/L) khi so với lượng EGCG trong trà đen (300mg/L) [6].
Cơ chế tạo thành theaflavin và thearubigin từ catechin, có xúc tác bằng enzyme PPO Trong công nghệ sản xuất trà trên thế giới [10], [11], Tannase được sử dụng nhiều là enzyme xúc tác phản ứng cắt nối ester giữa nhóm galloy và các hợp chất khác như EGCG hoặc ECG. Sản phẩm tạo thành là Gallic acid (GA) một hợp chất có hoạt tính kháng oxi hóa cao. Hơn nữa cứ 1 mol EGCG bị thủy phân 6 sẽ tạo ra 1 mol EGC và 1 mol GA và như vậy hoạt tính kháng oxi hóa trong dịch thu được ước tính sẽ cao hơn nhiều [10] (Hình 1. Vì đặc tính đó mà, tuy nhiên ở Việt Nam đến nay vẫn chưa được đưa vào nghiên cứu thử nghiệm cũng như ứng dụng.
Phản ứng phân giải EGCG thành EGC và GA có xúc tác bằng enzyme Tannase 1. Hoạt tính sinh học của catechin 1. Hoạt tính kháng oxi hóa Catechin có khả năng thu dọn các gốc tự do ROS bằng cách tạo ra các gốc phenol bền hơn. Trong nhóm catechin thì EGCG là hợp chất được khảo sát nhiều nhất vì chiếm tỉ lệ cao trong trà xanh và có sở hữu nhóm galloyl trên vòng B và vòng D.
Dùng phương pháp phổ cộng hưởng thuận từ electron (Electron paramagnetic resonance spectroscopy) cho thấy rằng EGCG phản ứng với O2– làm oxi hóa vòng D [12]. Kết quả cũng cho thấy EGCG thu dọn gốc tự do của OH và O2– [3]. Có rất nhiều phương pháp được phát triển và sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của trà xanh, thường dùng là phân tích ferric reducing/antioxidant power (FRAP), oxygen radical absorbance capacity (ORAC) và 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Kết quả phân tích cho thấy có một mối tương quan thuận giữa hàm lượng phenol trong trà xanh và hoạt tính kháng oxi hóa và khả năng kháng oxi hóa của trà xanh cũng cao hơn so với trà ô long và trà đen [13].
Ngoài ra, khi được quy đổi ra mức độ kháng oxi hóa 7 tương đương với Trolox, thì trà xanh cho thấy mức độ kháng oxi hóa tương đương với 1300 μmol trolox là 1g lá trà khô [14]. Cũng giống như FRAP, ORAC cũng cho thấy có sự tương quan thuận giữa giá trị ORAC và hàm lượng polyphenol trong trà xanh [15]. Phương pháp DPPH cũng cho ra kết quả tương tự [16].