Nghiên Cứu Chế Phẩm Mangosteen Từ Vỏ Măng Cụt

Khóa luận trình bày tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm chiết xuất từ vỏ măng cụt Garcinia mangostana, góp phần vào nghiên cứu hóa học.

• Tác giả: Đoàn Thị Hồng Vân
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Thị Mộng Ngọc
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Chế Phẩm Mangosteen Từ Vỏ Măng Cụt
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ON
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Tổng quan về dược liệu có trong cao khô chế phẩm MANGOSTEEN
• 2.2. Hình thức cảm quan của chế phẩm MANGOSTEEN
• 2.3. Công dụng của chế phẩm MANGOSTEEN
• 2.4. Liều dùng của chế phẩm MANGOSTEEN
• 2.5. Bảo quản chế phẩm MANGOSTEEN
• 2.6. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
• 2.6.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lớp mỏng
• 2.7. Phổ tử ngoại - khả kiến (Phổ UV - VIS)
• 2.7.1. Hoạt động của phổ tử ngoại - khả kiến
• 2.8. Thám định quy trình phân tích
• 2.8.1. Các bước thám định quy trình phân tích
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Dung môi — Hóa chất — Trang thiết bị
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Khảo sát độ tinh khiết của chế phẩm
• 3.2.2. Độ đồng đều khối lượng
• 3.2.3. Thời gian tan rã
• 3.2.4. Dựa vào phản ứng hóa học
• 3.2.5. Định lượng œ-mangostin trong chế phẩm
• 3.2.6. Khảo sát quy trình định lượng œ-mangostin
• 3.2.7. Khảo sát hàm lượng a-mangostin trong chế phẩm
• 3.2.8. Khảo sát độ đồng đều hàm lượng a-mangostin trong chế phẩm
• 3.3. Phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
• 4.1. Khảo sát độ tinh khiết của chế phẩm
• 4.1.1. Độ đồng đều
• 4.2. Định tính a-mangostin trong chế phẩm
• 4.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
• 4.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
• 4.3. Định lượng a-mangostin trong chế phẩm
• 4.3.1. Khảo sát quy trình định lượng a-mangostin bằng phương pháp đo mật độ quang dựa trên chất chuẩn œ-mangostin
• 4.3.2. Khảo sát độ hấp thu cực đại
• 4.3.3. Độ đồng đều hàm lượng a-mangostin trong chế phẩm
• 4.4. Khảo sát tác dụng antioxidant invitro
• 4.4.1. Thẩm định hấp thu cực đại và mật độ quang của dung dịch chứng trong Methanol
• 4.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa (antioxidant) trong chất chuẩn cao mềm Mangosteen
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ & KIẾN NGHỊ
• PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chế phẩm mangosteen từ vỏ măng cụt

Chế phẩm mangosteen từ vỏ măng cụt đang thu hút sự chú ý trong nghiên cứu dược liệu. Vỏ măng cụt chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là các xanthones. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Việc chiết xuất và phát triển chế phẩm từ vỏ măng cụt không chỉ mang lại giá trị dinh dưỡng mà còn có tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý.

1.1. Vỏ măng cụt và các hợp chất có lợi

Vỏ măng cụt chứa nhiều xanthones, tannins và các hợp chất phenolic. Những hợp chất này có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa. Nghiên cứu cho thấy, xanthones trong vỏ măng cụt có thể giúp cải thiện sức khỏe tim mạch và tăng cường hệ miễn dịch.

1.2. Lịch sử sử dụng vỏ măng cụt trong y học

Từ lâu, vỏ măng cụt đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia châu Á. Người dân đã sử dụng vỏ măng cụt để điều trị các bệnh như tiêu chảy, viêm nhiễm và các vấn đề về tiêu hóa. Sự quan tâm đến vỏ măng cụt trong y học hiện đại đang gia tăng nhờ vào các nghiên cứu khoa học.

II. Thách thức trong nghiên cứu chế phẩm từ vỏ măng cụt

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu chế phẩm từ vỏ măng cụt cũng gặp phải một số thách thức. Đầu tiên là việc tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Thứ hai, cần có các nghiên cứu lâm sàng để xác định tác dụng và độ an toàn của chế phẩm. Cuối cùng, việc phát triển sản phẩm thương mại từ vỏ măng cụt cũng cần phải xem xét đến các yếu tố về chi phí và thị trường.

2.1. Tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất

Tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất là một yếu tố quan trọng để đảm bảo chất lượng của chế phẩm. Cần xác định các điều kiện tối ưu như nhiệt độ, thời gian và loại dung môi để tối đa hóa hàm lượng hoạt chất trong vỏ măng cụt.

2.2. Nghiên cứu lâm sàng và độ an toàn

Các nghiên cứu lâm sàng là cần thiết để đánh giá tác dụng và độ an toàn của chế phẩm mangosteen. Việc này giúp xác định liều lượng phù hợp và phát hiện các tác dụng phụ có thể xảy ra khi sử dụng sản phẩm.

III. Phương pháp chiết xuất chế phẩm mangosteen từ vỏ măng cụt

Phương pháp chiết xuất chế phẩm mangosteen từ vỏ măng cụt thường sử dụng các kỹ thuật như sắc ký lớp mỏng và chiết xuất bằng dung môi. Những phương pháp này giúp tách biệt các hợp chất có lợi từ vỏ măng cụt, đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm cuối cùng. Việc áp dụng công nghệ hiện đại trong chiết xuất cũng giúp nâng cao hiệu suất và giảm thiểu thời gian thực hiện.

3.1. Sắc ký lớp mỏng trong chiết xuất

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp hiệu quả để phân tích và xác định các hợp chất trong vỏ măng cụt. Phương pháp này cho phép tách biệt các xanthones và các hợp chất khác, từ đó giúp đánh giá chất lượng của chế phẩm.

3.2. Chiết xuất bằng dung môi

Chiết xuất bằng dung môi là một trong những phương pháp phổ biến nhất để thu nhận các hợp chất từ vỏ măng cụt. Việc lựa chọn dung môi phù hợp có thể ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết xuất và chất lượng sản phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của chế phẩm mangosteen

Chế phẩm mangosteen từ vỏ măng cụt có nhiều ứng dụng trong y học và dinh dưỡng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chế phẩm này có thể giúp cải thiện sức khỏe tim mạch, tăng cường hệ miễn dịch và hỗ trợ điều trị một số bệnh lý. Ngoài ra, chế phẩm còn có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm nhờ vào các đặc tính chống oxy hóa của nó.

4.1. Tác dụng trong y học

Chế phẩm mangosteen có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý như viêm nhiễm, bệnh tim mạch và các vấn đề về tiêu hóa. Nghiên cứu cho thấy, các hợp chất trong vỏ măng cụt có khả năng chống viêm và kháng khuẩn hiệu quả.

4.2. Ứng dụng trong ngành thực phẩm

Chế phẩm mangosteen có thể được sử dụng như một thành phần bổ sung trong thực phẩm chức năng. Nhờ vào khả năng chống oxy hóa, chế phẩm này giúp bảo vệ sức khỏe và cải thiện chất lượng cuộc sống.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu chế phẩm mangosteen

Nghiên cứu chế phẩm mangosteen từ vỏ măng cụt đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học và dinh dưỡng. Với những lợi ích sức khỏe tiềm năng, chế phẩm này có thể trở thành một giải pháp hiệu quả cho nhiều vấn đề sức khỏe. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình sản xuất và đánh giá tác dụng lâm sàng của chế phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về chế phẩm mangosteen cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều ứng dụng mới. Việc phát triển các sản phẩm từ vỏ măng cụt có thể mang lại lợi ích lớn cho sức khỏe cộng đồng.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của chế phẩm mangosteen trong điều trị bệnh. Việc này không chỉ giúp khẳng định hiệu quả của sản phẩm mà còn tạo cơ sở cho việc phát triển các sản phẩm mới từ vỏ măng cụt.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong những thập niên gần đây, các nghiên cứu y sinh học đã chứng minh các gốc tự do sinh ra từ quá trình chuyển hóa oxy hóa trong cơ thể là nguyên nhân liên quan mật thiết đến hơn 60 loại bệnh lý mạn tính nguy hiểm, bao gồm bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch, ung thư, thoái hóa tế bào thần kinh, viêm gan và quá trình lão hóa sớm. Mặc dù các thuốc tân dược điều trị các bệnh này rất phong phú, việc sử dụng lâu dài thường đi kèm các phản ứng phụ đáng kể. Trước thực trạng đó, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo các quốc gia chú trọng phát triển y học cổ truyền và tận dụng các nguồn dược liệu tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe ban đầu. Tại Việt Nam, với hệ thực vật phong phú gồm hơn 3.500 loài cây thuốc, xu hướng chiết xuất các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao đang nhận được sự quan tâm lớn.

Vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L., thuộc họ Guttiferae / Clusiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian tại Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan, Philippines và Việt Nam để điều trị tiêu chảy, kiết lỵ, kháng khuẩn, kháng viêm và làm lành vết thương. Các nghiên cứu hóa thực vật hiện đại cho thấy vỏ măng cụt chứa hàm lượng cao các hợp chất polyphenol thuộc nhóm xanthones, đặc biệt là $\alpha$-mangostin, có tác dụng chống oxy hóa mạnh, dập tắt gốc tự do, kháng sinh, kháng viêm và ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư. Năm 2008, Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thành công dạng bào chế viên nang cứng mang tên MANGOSTEEN chứa cao khô chiết xuất từ vỏ quả măng cụt nhằm mục đích chống lão hóa, nâng cao sức đề kháng và hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa.

Để hoàn thiện hồ sơ khoa học phục vụ đăng ký, quản lý chất lượng và lưu hành sản phẩm theo các quy định của Bộ Y tế, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng là yêu cầu bắt buộc. Khóa luận tốt nghiệp "Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm MANGOSTEEN chiết xuất từ vỏ Măng cụt (Garcinia mangostana – Guttifereae)" được thực hiện nhằm giải quyết các nhiệm vụ cụ thể sau:

1. Xây dựng các yêu cầu kiểm nghiệm cơ bản đối với chế phẩm MANGOSTEEN dạng viên nang cứng.
2. Định tính hoạt chất $\alpha$-mangostin trong chế phẩm MANGOSTEEN.
3. Định lượng hoạt chất $\alpha$-mangostin trong chế phẩm MANGOSTEEN.
4. Thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa (antioxidant) in vitro của chế phẩm MANGOSTEEN.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: Khóa luận tập trung khảo sát chế phẩm viên nang cứng MANGOSTEEN (công thức chứa 160 mg cao khô vỏ măng cụt và tá dược vừa đủ 240 mg/viên), cao mềm vỏ măng cụt và chất chuẩn đối chiếu $\alpha$-mangostin. Toàn bộ thực nghiệm phân tích hóa học, kiểm nghiệm chỉ tiêu dược điển và thử hoạt tính sinh học được tiến hành tại Phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh phối hợp cùng Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh vào năm 2009.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thiết lập nền tảng lý thuyết trên cơ sở hóa thực vật học, hóa dược học và các phương pháp kiểm nghiệm thuốc theo quy định dược điển hiện hành:

• Khung lý thuyết về dược liệu và hoạt chất:
  • Măng cụt (Garcinia mangostana L.): Cây thân gỗ nhiệt đới thuộc họ Bứa (Guttiferae / Clusiaceae). Vỏ quả chứa tannin (7–13%), nhựa thực vật và nhóm hợp chất xanthones (chiếm khoảng 25% tổng số các xanthones tự nhiên được biết đến).
  • Hợp chất Xanthones: Khung cấu trúc căn bản là $9H\text{-xanthen-9-one}$ (công thức hóa học $C_{13}H_8O_2$, khối lượng phân tử 196,19 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 173–176°C, nhiệt độ sôi 349–350°C).
  • Hoạt chất $\alpha$-mangostin: Tên hóa học theo IUPAC là $1,3,6\text{-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis(3-methylbut-2-enyl)-9H-xanthen-9-one}$, công thức phân tử $C_{24}H_{26}O_6$, khối lượng phân tử 410,46 g/mol, dạng tinh thể màu vàng, là dẫn xuất polyphenol thuộc nhóm xanthone có cực đại hấp thụ quang học trong dung môi methanol tại bước sóng $\lambda_{max} = 316\text{ nm}$.
  • Đại cương về gốc tự do và stress oxy hóa: Các gốc oxy phản ứng ($O_2^{\bullet-}$, $H_2O_2$, $^{\bullet}OH$, $^1O_2$) hình thành từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể hoặc do tác nhân ngoại sinh, tấn công màng lipid, protein và DNA gây tổn thương tế bào và thúc đẩy quá trình lão hóa.
• Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
  • Kiểm nghiệm các chỉ tiêu cơ bản của viên nang cứng: Xác định hình thức cảm quan, độ ẩm bằng phương pháp sấy khô, độ đồng đều khối lượng theo quy định Dược điển Việt Nam, và đo thời gian tan rã của viên nang trên thiết bị chuyên dụng.
  • Phương pháp định tính hoạt chất: Sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng cho nhóm chức phenol (phản ứng tạo phức màu xanh rêu với dung dịch $FeCl_3\ 10%$, tăng màu vàng cam với dung dịch $NaOH\ 20%$, tạo kết tủa đục với dung dịch $Pb(CH_3COO)2\ 10%$) và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel $60\ F{254}$ (Merck), soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm.
  • Phương pháp định lượng quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis): Đo mật độ quang ($Abs$) của dịch chiết mẫu thử và mẫu chuẩn $\alpha$-mangostin tại bước sóng cực đại $\lambda_{max} = 316\text{ nm}$ trên máy quang phổ tử ngoại - khả kiến tuân theo định luật Lambert - Beer.
  • Thẩm định quy trình phân tích: Đánh giá tính chất tuyến tính (xác định hệ số tương quan $R$ và phương trình hồi quy $y = ax + b$ trên dãy nồng độ chuẩn), độ chính xác (đo lặp lại độc lập $n \ge 6$ lần, tính độ lệch chuẩn $SD$, độ lệch chuẩn tương đối $RSD%$ và khoảng tin cậy ở mức xác suất $P = 95%$), và độ đúng (thực hiện phương pháp thêm chuẩn ở các mức nồng độ, tính tỷ lệ phục hồi $%$).
  • Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl): Dựa trên nguyên lý gốc tự do DPPH ($MW = 394\text{ g/mol}$) có màu tím đậm đặc trưng trong methanol và hấp thu cực đại ở bước sóng $\lambda_{max} = 516\text{ nm}$. Khi phản ứng với hợp chất chống oxy hóa chứa hydro linh động ($AH$), DPPH bị khử thành dạng phân tử không màu, mật độ quang tại 516 nm giảm tương ứng với khả năng dập tắt gốc tự do của mẫu.
• Nguồn dữ liệu và trang thiết bị thực nghiệm:
  • Vật liệu: Bột khô vỏ măng cụt, cao mềm măng cụt, viên nang MANGOSTEEN và chất chuẩn $\alpha$-mangostin tinh khiết do Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
  • Hóa chất - Dung môi: Methanol (MeOH), triclorometan ($CHCl_3$), n-hexan, ethyl acetat, chì acetat, sắt(III) clorid, natri hydroxyd, gốc tự do DPPH.
  • Trang thiết bị: Máy quang phổ UV-Vis Unicam Solvne Thermo Spectronic, máy cô quay giảm áp Buchi, máy li tâm Ultrasonic, bình chiết Soxhlet, tủ sấy chân không VWR SIP, cân phân tích độ chính xác cao Sartorius.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương này tổng quan về gánh nặng của các bệnh lý liên quan đến gốc tự do và quá trình lão hóa trong xã hội hiện đại. Trình bày thực trạng điều trị bằng thuốc tân dược cùng các tác dụng không mong muốn, từ đó nhấn mạnh tầm quan trọng của định hướng khai thác nguồn dược liệu thiên nhiên bản địa theo khuyến nghị của WHO. Tác giả giới thiệu khái quát về tiềm năng dược lý của vỏ quả măng cụt, quá trình điều chế cao khô và công thức viên nang MANGOSTEEN của Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh năm 2008. Từ định hướng chính sách quốc gia về đảm bảo chất lượng thuốc của Bộ Y tế, đề tài xác định tính cấp thiết của việc xây dựng hồ sơ tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm và cụ thể hóa 4 mục tiêu nghiên cứu của khóa luận.

Chương 2: Tổng quan

Nội dung chương 2 gồm 6 phần tổng quan toàn diện:

1. Chế phẩm MANGOSTEEN: Công thức một viên nang gồm 160 mg cao khô vỏ măng cụt và tá dược vừa đủ 240 mg. Mô tả đặc tính cảm quan (nang cứng màu đỏ sẫm, mặt nhẵn bóng), công dụng (chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, điều trị tiêu chảy), liều dùng khuyến cáo cho người lớn và trẻ em, điều kiện bảo quản trong bao bì kín, nơi khô mát và tránh ánh sáng.
2. Dược liệu Măng cụt và hợp chất Xanthones: Hệ thống hóa phân loại thực vật, phân bố địa lý, hình thái học cây măng cụt (Garcinia mangostana). Phân tích chi tiết thành phần hóa thực vật của vỏ quả, lá, thân và hạt. Trình bày cấu trúc hóa học của khung xanthones và dẫn xuất chính $\alpha$-mangostin ($C_{24}H_{26}O_6, MW = 410,46\text{ g/mol}$). Tổng kết các công trình nghiên cứu dược lý quốc tế về $\alpha$-mangostin: ức chế thần kinh trung ương, tác dụng trên tim mạch, chống viêm qua ức chế enzym IKK và giảm biểu hiện COX-2, chống loét dạ dày, kháng vi khuẩn đường ruột (Shigella, E. coli), kháng Staphylococcus aureus (bao gồm chủng kháng penicillin với $MIC = 7,8\ \mu\text{g/ml}$), ức chế Mycobacterium tuberculosis ($MIC = 6,25\ \mu\text{g/ml}$), ức chế protease của HIV-1, kháng nấm và gây chết theo chương trình (apoptosis) trên các dòng tế bào ung thư gan, ung thư biểu mô tuyến vú SKBR3 và ung thư đại trực tràng.
3. Phương pháp Sắc ký lớp mỏng (TLC): Lịch sử phát triển, nguyên tắc phân bố/hấp phụ, đại lượng hệ số dịch chuyển $R_f$, tính chất các loại chất hấp phụ thông dụng (Silicagel G, GF254, H, 60 F254 và Nhôm oxyt Alumina) và quy trình thực hiện sắc ký lớp mỏng phân tích.
4. Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis): Cơ chế hấp thụ năng lượng kích thích electron hóa trị trong vùng bước sóng 200–800 nm, định luật Lambert - Beer và ứng dụng định lượng các phân tử chứa nối đôi liên hợp.
5. Thẩm định quy trình phân tích: Định nghĩa và các bước thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn phân tích dược phẩm, bao gồm xác định khoảng tuyến tính qua hệ số tương quan $R$, đánh giá độ chính xác qua độ lệch chuẩn ($SD$, $RSD%$, khoảng tin cậy) và độ đúng qua tỷ lệ phục hồi $(%)$.
6. Đại cương về gốc tự do và phương pháp thử nghiệm DPPH: Bản chất hóa học các gốc tự do nguy hiểm trong cơ thể ($O_2^{\bullet-}, H_2O_2, ^{\bullet}OH$), chuỗi phản ứng Haber-Weiss và phản ứng Fenton có ion kim loại chuyển tiếp xúc tác ($Fe^{2+}, Cu^+$). Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH với các hợp chất chống oxy hóa tự nhiên và nguyên tắc đo quang xác định hoạt tính ở bước sóng 516 nm.

Chương 3: Vật liệu & Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục nguyên liệu, dung môi, hóa chất và trang thiết bị thực nghiệm:

• Quy trình kiểm nghiệm các chỉ tiêu cơ bản của viên nang cứng: Phương pháp xác định độ ẩm bằng sấy đến khối lượng không đổi; phương pháp cân kiểm tra độ đồng đều khối lượng của 20 nang theo Dược điển; phương pháp đo thời gian rã của 6 viên nang trong môi trường nước ở 37°C.
• Quy trình định tính $\alpha$-mangostin: Tiến hành các phản ứng màu polyphenol với dung dịch $FeCl_3\ 10%$, $NaOH\ 20%$ và dung dịch $Pb(CH_3COO)2\ 10%$; quy trình triển khai sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng Silicagel $60\ F{254}$ với các hệ dung môi pha động khảo sát (hệ $n\text{-hexan} : \text{triclorometan} : \text{ethyl acetat}$ theo các tỷ lệ khác nhau), đối chiếu vết của dịch chiết viên nang với chất chuẩn $\alpha$-mangostin dưới đèn UV 254 nm và 366 nm.
• Quy trình định lượng $\alpha$-mangostin bằng phương pháp đo mật độ quang UV-Vis: Cách pha dung dịch chuẩn gốc $\alpha$-mangostin trong methanol, pha dãy 9 nồng độ chuẩn từ dung dịch gốc để khảo sát khoảng tuyến tính tại bước sóng hấp thu cực đại 316 nm.
• Thiết kế thực nghiệm thẩm định phương pháp: Sơ đồ xác định độ lặp lại (độ chính xác), sơ đồ xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (80%, 100%, 120%), và quy trình chiết xuất định lượng $\alpha$-mangostin từ viên nang để khảo sát hàm lượng trung bình cùng độ đồng đều hàm lượng giữa các viên.
• Quy trình thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng DPPH: Pha dung dịch DPPH trong methanol, khảo sát độ hấp thu cực đại tại 516 nm, quy trình ủ mẫu thử (chất chuẩn $\alpha$-mangostin, cao mềm măng cụt, dịch chiết viên nang) với dung dịch DPPH ở các nồng độ khác nhau trong thời gian xác định trước khi đo độ giảm mật độ quang.

Chương 4: Kết quả & Bàn luận

Chương này tập hợp toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

• Khảo sát độ tinh khiết và các chỉ tiêu vật lý của chế phẩm:
  • Xác định độ ẩm trung bình của bột cốm trong viên nang MANGOSTEEN đạt yêu cầu độ ẩm cho phép đối với dạng thuốc bột/cốm đóng nang.
  • Kết quả đo độ đồng đều khối lượng trên 20 viên nang cho thấy sự chênh lệch khối lượng của từng nang so với khối lượng trung bình đều nằm trong giới hạn cho phép ($\pm 10%$ hoặc $\pm 7,5%$ theo quy định Dược điển).
  • Thời gian tan rã của các viên nang thử nghiệm đạt tiêu chuẩn tan rã hoàn toàn trong môi trường thử nghiệm trước thời hạn quy định cho viên nang cứng (dưới 30 phút).
• Định tính $\alpha$-mangostin trong chế phẩm:
  • Kết quả phản ứng hóa học: Dịch chiết chế phẩm cho phản ứng tạo phức màu xanh rêu đậm với $FeCl_3\ 10%$, chuyển màu vàng cam đậm khi kiềm hóa bằng $NaOH\ 20%$, và xuất hiện kết tủa đục với $Pb(CH_3COO)_2\ 10%$, khẳng định sự hiện diện đặc trưng của các nhóm chức polyphenol.
  • Kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC): Trên các hệ dung môi khai triển khảo sát (đặc biệt là hệ $n\text{-hexan} : \text{triclorometan} : \text{ethyl acetat}$), dịch chiết viên nang MANGOSTEEN cho vết tách rõ nét, có giá trị $R_f$ và màu sắc huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm và 366 nm hoàn toàn trùng khớp với vết của chất chuẩn đối chiếu $\alpha$-mangostin.
• Định lượng $\alpha$-mangostin và thẩm định quy trình phân tích:
  • Phổ UV-Vis của chất chuẩn $\alpha$-mangostin trong methanol xác định đỉnh hấp thu cực đại rõ rệt tại bước sóng $\lambda_{max} = 316\text{ nm}$.
  • Khảo sát khoảng tuyến tính: Xây dựng đường chuẩn phụ thuộc giữa mật độ quang ($y$) và nồng độ $\alpha$-mangostin ($x$), đồ thị biểu diễn đường thẳng có hệ số tương quan $R$ đạt độ tương quan tuyến tính rất cao trong khoảng nồng độ khảo sát.
  • Độ chính xác: Thực nghiệm đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu phân tích cho giá trị độ lệch chuẩn tương đối $RSD%$ nhỏ, nằm trong giới hạn sai số ngẫu nhiên cho phép của phương pháp quang phổ.
  • Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi ($%$) khi thêm chuẩn $\alpha$-mangostin vào nền mẫu chế phẩm đạt tỷ lệ thu hồi cao (nằm trong khoảng quy chuẩn 95–105%), chứng minh quy trình ít bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống và các tá dược đi kèm.
  • Hàm lượng hoạt chất: Định lượng được hàm lượng $\alpha$-mangostin cụ thể trong cao mềm vỏ măng cụt nguyên liệu và trong từng viên nang chế phẩm MANGOSTEEN; kết quả kiểm tra độ đồng đều hàm lượng giữa các nang đạt yêu cầu kỹ thuật.
• Khảo sát tác dụng chống oxy hóa (Antioxidant) in vitro:
  • Dung dịch DPPH trong methanol có cực đại hấp thu tại bước sóng $\lambda_{max} = 516\text{ nm}$.
  • Đồ thị biểu diễn hoạt tính quét gốc tự do cho thấy cả chất chuẩn $\alpha$-mangostin, cao mềm vỏ măng cụt và chế phẩm viên nang MANGOSTEEN đều có khả năng dập tắt gốc tự do DPPH mạnh mẽ theo cơ chế phụ thuộc nồng độ (nồng độ mẫu càng tăng, độ hấp thu quang học của dung dịch DPPH tại 516 nm càng giảm mạnh).

Chương 5: Kết luận & Kiến nghị

• Kết luận: Tác giả đã hoàn thành việc xây dựng bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm hoàn chỉnh cho viên nang MANGOSTEEN chiết xuất từ vỏ măng cụt bao gồm: tiêu chuẩn cảm quan, độ ẩm, độ đồng đều khối lượng, thời gian tan rã; phương pháp định tính bằng phản ứng hóa học màu và sắc ký lớp mỏng; phương pháp định lượng hoạt chất $\alpha$-mangostin bằng phổ UV-Vis tại bước sóng 316 nm đạt độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng; chứng minh hoạt tính chống oxy hóa in vitro vượt trội của chế phẩm thông qua thử nghiệm dập tắt gốc tự do DPPH tại 516 nm.
• Kiến nghị: Đề xuất tiếp tục theo dõi độ ổn định của viên nang MANGOSTEEN theo thời gian thực để xác định hạn dùng chính xác; mở rộng nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo); ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong các nghiên cứu tiếp theo để nâng cao độ chọn lọc khi định lượng đồng thời nhiều xanthones khác trong chế phẩm.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xây dựng thành công bộ tiêu chuẩn cơ sở phục vụ công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng viên nang cứng MANGOSTEEN. Toàn bộ các tiêu chuẩn kiểm nghiệm và kết quả thẩm định phương pháp được tổng hợp trong bảng sau:

STT	Chỉ tiêu kiểm nghiệm	Phương pháp / Thiết bị sử dụng	Yêu cầu kỹ thuật & Kết quả đạt được
1	Hình thức cảm quan	Quan sát trực quan	Nang cứng màu đỏ sẫm, hai nửa lồng khít, mặt nhẵn bóng, đều, mịn
2	Độ ẩm	Sấy khô đến khối lượng không đổi (Tủ sấy VWR SIP)	Đạt độ ẩm tiêu chuẩn của viên nang dược phẩm
3	Độ đồng đều khối lượng	Cân phân tích Sartorius ($n = 20\text{ viên}$)	Độ lệch khối lượng từng viên nằm trong giới hạn cho phép của Dược điển
4	Thời gian tan rã	Thiết bị thử độ rã ở 37°C ($n = 6\text{ viên}$)	Tan rã hoàn toàn trong giới hạn thời gian cho phép của nang cứng (< 30 phút)
5	Định tính Polyphenol	Phản ứng với dung dịch $FeCl_3\ 10%$, $NaOH\ 20%$, $Pb(CH_3COO)_2\ 10%$	Cho màu xanh rêu với $FeCl_3$, tăng màu vàng cam với $NaOH$, tạo tủa đục với chì acetat
6	Định tính $\alpha$-mangostin	Sắc ký lớp mỏng (TLC Silicagel $60\ F_{254}$, soi đèn UV 254 nm và 366 nm)	Vết mẫu thử có cùng giá trị $R_f$ và màu sắc huỳnh quang với chất chuẩn đối chiếu $\alpha$-mangostin
7	Định lượng $\alpha$-mangostin	Đo mật độ quang phổ tử ngoại (UV-Vis tại bước sóng $\lambda_{max} = 316\text{ nm}$)	Xác định chính xác hàm lượng hoạt chất $\alpha$-mangostin trong cao mềm và trong viên nang
8	Thẩm định quy trình phân tích	Đánh giá tính tuyến tính, độ chính xác ($RSD%$), độ đúng (tỷ lệ phục hồi $%$)	Đường chuẩn có độ tương quan tuyến tính cao ($R \approx 1$); độ lặp lại tốt; tỷ lệ phục hồi đạt chuẩn
9	Độ đồng đều hàm lượng	Đo quang UV-Vis mẫu phân tích từng nang riêng lẻ	Hàm lượng $\alpha$-mangostin phân bố đồng đều giữa các viên nang trong chế phẩm
10	Tác dụng chống oxy hóa in vitro	Thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH, đo quang phổ tại bước sóng $\lambda_{max} = 516\text{ nm}$	Chế phẩm và cao măng cụt dập tắt gốc tự do DPPH mạnh, phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

Đóng góp của đề tài:

• Về mặt khoa học: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm chi tiết về đặc tính lý hóa, quang phổ và hoạt tính bắt gốc tự do của hợp chất $\alpha$-mangostin chiết xuất từ vỏ măng cụt Việt Nam; chứng minh bằng thực nghiệm hoạt tính chống oxy hóa in vitro của chế phẩm bào chế so với chất chuẩn tinh khiết.
• Về mặt thực tiễn: Thiết lập được quy trình kiểm nghiệm hoàn chỉnh, khả thi, dễ áp dụng với các thiết bị phân tích cơ bản tại các phòng kiểm nghiệm dược phẩm (UV-Vis, TLC); góp phần hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn hóa sản phẩm MANGOSTEEN của Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh, thúc đẩy việc tận dụng nguồn phụ phẩm vỏ trái cây làm dược phẩm chăm sóc sức khỏe.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Phương pháp định lượng bằng đo mật độ quang UV-Vis ở bước sóng 316 nm mặc dù đơn giản và kinh tế, nhưng độ chọn lọc có thể bị giới hạn nếu mẫu có chứa các dẫn xuất xanthone khác có phổ hấp thu tương tự $\alpha$-mangostin.
  • Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mô hình hóa học in vitro (phương pháp thử nghiệm DPPH), chưa tiến hành đánh giá tác dụng chống oxy hóa và cải thiện miễn dịch trên cơ thể sống (in vivo).
  • Nghiên cứu chưa theo dõi đầy đủ độ ổn định hóa học và vật lý của chế phẩm trong điều kiện bảo quản dài hạn (nghiên cứu tuổi thọ và độ lão hóa cấp tốc).
• Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:
  • Nâng cấp và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp đầu dò DAD để định lượng đồng thời $\alpha$-mangostin, $\beta$-mangostin và $\gamma$-mangostin.
  • Triển khai các thử nghiệm dược lý thực nghiệm in vivo trên động vật nhằm đánh giá toàn diện hoạt tính chống lão hóa, khả năng tăng cường miễn dịch và hiệu quả bảo vệ đường tiêu hóa.
  • Khảo sát độ ổn định của viên nang MANGOSTEEN theo các hướng dẫn của ASEAN/ICH để xác định chính xác tuổi thọ và hạn dùng của chế phẩm khi lưu hành trên thị trường.

Giá trị tham khảo

Đề tài là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành: Hóa học (Hóa hữu cơ, Hóa phân tích), Dược học (Kiểm nghiệm thuốc, Dược liệu học, Bào chế học), Công nghệ Hóa - Thực phẩm và Công nghệ Sinh học.
• Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên kiểm nghiệm: Những người đang thực hiện đề tài chiết xuất, tiêu chuẩn hóa cao dược liệu hoặc kiểm nghiệm các dạng thuốc viên từ thảo dược tự nhiên.
• Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:
  • Tổng quan lý thuyết về hóa thực vật nhóm xanthones và hoạt tính sinh học của vỏ quả măng cụt.
  • Quy trình chi tiết và phương pháp luận thẩm định một quy trình phân tích định lượng bằng quang phổ UV-Vis (đánh giá khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng qua tỷ lệ phục hồi).
  • Kỹ thuật thực hiện thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các hợp chất tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

1. Thành phần công thức của một viên nang cứng MANGOSTEEN trong nghiên cứu gồm những gì?
Mỗi viên nang cứng MANGOSTEEN được bào chế với thành phần công thức gồm 160 mg cao khô chiết xuất từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana) và 240 mg tá dược vừa đủ cho một viên nang.

2. Hoạt chất chính $\alpha$-mangostin có tên hóa học, công thức phân tử và cực đại hấp thu quang học là bao nhiêu?
$\alpha$-mangostin có tên hóa học là $1,3,6\text{-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis(3-methylbut-2-enyl)-9H-xanthen-9-one}$, công thức phân tử $C_{24}H_{26}O_6$ (khối lượng phân tử 410,46 g/mol). Khi hòa tan trong dung môi methanol, $\alpha$-mangostin cho cực đại hấp thu quang phổ tử ngoại tại bước sóng $\lambda_{max} = 316\text{ nm}$.

3. Hoạt chất polyphenol trong chế phẩm MANGOSTEEN được định tính bằng những phản ứng màu hóa học nào?
Nghiên cứu sử dụng 3 phản ứng hóa học đặc trưng cho polyphenol: tạo phức màu xanh rêu với dung dịch sắt(III) clorid ($FeCl_3\ 10%$), chuyển sang màu vàng cam đậm trong môi trường kiềm ($NaOH\ 20%$), và tạo kết tủa đục với dung dịch chì acetat ($Pb(CH_3COO)_2\ 10%$).

4. Quy trình định lượng $\alpha$-mangostin trong khóa luận được thẩm định qua những chỉ tiêu nào?
Quy trình định lượng bằng phổ UV-Vis tại bước sóng 316 nm được thẩm định qua 3 chỉ tiêu căn bản: tính chất tuyến tính (xác định phương trình hồi quy và hệ số tương quan $R$ trên dãy nồng độ chuẩn), độ chính xác (đo độ lặp lại, tính độ lệch chuẩn $SD$ và $RSD%$), và độ đúng (thực hiện phương pháp thêm chuẩn để tính tỷ lệ phục hồi $%$).

5. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của chế phẩm được đánh giá bằng phương pháp nào và ở bước sóng bao nhiêu?
Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Thử nghiệm dựa trên khả năng làm giảm mật độ quang của dung dịch DPPH trong methanol tại bước sóng hấp thu cực đại $\lambda_{max} = 516\text{ nm}$ khi có mặt các chất cho hydro trong chế phẩm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đoàn Thị Hồng Vân đã xây dựng thành công hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ bản cho chế phẩm viên nang cứng MANGOSTEEN chiết xuất từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana). Đề tài đã thiết lập đầy đủ các quy trình kiểm tra chỉ tiêu lý - hóa của viên nang, định tính polyphenol bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, đồng thời thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất chính $\alpha$-mangostin bằng quang phổ UV-Vis ở bước sóng 316 nm. Kết quả thử nghiệm DPPH ở bước sóng 516 nm đã chứng minh hoạt tính chống oxy hóa in vitro rõ rệt của chế phẩm, tạo cơ sở thực nghiệm vững chắc cho công tác kiểm soát chất lượng và phát triển các sản phẩm dược liệu từ nguồn phụ phẩm nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: DAT VAN DE CHUONG 2: TONG QUAN I. CHE PELADA:MIANGOSTIBEN Go SSesieriese=vdd 3 I 21; 0N N1 v2 Son Se EA CEN OPE aN ORT ROR 3 1. Tổng quan về được liệu có trong cao khô chế phẩm MANGOSTEEN .3 E0) NEW G2524 40(0 2600000066060 GGI 002v s 3 E2:2:: Hợp CHhẢt xaH1OBGSG5022G5C<G003022264LA10GGã14ã00108. Hình thức cảm quan của chế phẩm MANGOSTEEN.

Công dụng của chế phẩm MANGOSTEEN. Liễu dùng của chế phẩm MANGOSTEEN. Bao quan chế phim MANGOSTEEN. PHƯƠNG PHAP SAC KY LỚP MÒNG.

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lớp mỏng.5- 19 MRS oe) EE 21 Soi sith. EET osenmnans :enapenmerensecienpeuneasnpsnseemeereennnassiarenenenrnata eeasammenss +3 21 P. an äaaiijẦ8äẰẦẢ. 22 ST NA (0226116 C662stgicssuuscadaoi 23 3.

PHO TU NGOẠI - KHẢ KIÊN (PHO UV — VIS).-5-556: 24 CF RESDÀNH 15002200020 CEE NNO SAREE USS ARONA UDOT RC OTN 24 2 | ROL OCT ORL NO OTF Oe RAMONE RR ROO RTE DOT 25 3. Hoạt động của phổ tử ngoại — khả kiến. 22 sz222zZCccze re 25 4. THÁM ĐỊNH QUY TRÌNH PHAN TÍCH .-5c 552162 25 rel eatĐịnh nghe 02cC 2004862006: xaueeaaia 25 4.

Các bước thám định quy trình phân tích .:T1E5 GA tên (Övekncauokiiceeiioadoonddaoesssod 26 F222. ENB: CHUNG 526cc c6: y46scvczsa5675966864666484/631456628886cxxes4556 27 SVTH: Doan Thị Hong Van GVHD: ThS. DS Dương Thị Mộng Ngọc Khóa luận tốt nghiệp PELE NG SORE ORES Ce UT OPER ADOT NOPE Ry ROR 28 Š. ĐẠI CUONG VE DOC CHAT OXY HÓA GÓC TỰ DO.

29 5:1: Rebel niệm: gốp tự hice atic De aie cela 29 5. Ban chất hóa học của gốc tự dO.sscvesssecssseenveesssseverssressnsessesonssnnenseveees 29 5:5: Gắc gốc tự WO gW Wah sissies (2G Gui000200066110G16-06GG4001216A210/5 30 %4. Sie Níoh thánh gỗo (Ự WO e«ccu ¿coi G000 0cEcCEE200026G16A sai. Sự hình thành gốc tự do trong trao doi bình thường.

Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên. Sự hình thành góc tự do các ion kim loại trực tiếp `" 32 5. Các yếu tố ngoại sinh ảnh hưởng đến sự hình thành góc tự do. Các tác động của gốc tự do và sự liên quan của gốc tự do tới một số CO 1S ST ———Ặ--—-.

Các tình hudng gây tăng gốc độ tự đo. PHƯƠNG PHAP ĐÁNH BAT GOC TỰ DO BANG THU NGHIEM DPPH (TEEN Roe Soe RET ECE 35 6:1; Die thal DPPH bcs cassettes ie ies 35 6. Phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH. 35 CHƯƠNG 3: VAT LIEU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 HỘI TORING Go c2 cc pee 37 Us is: St ác600022ả2áii(10001(00022616GGGGGb¿oi 37 1.

Dung môi — Hóa chất — Trang thiết bị. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Khảo sát độ tỉnh khiết của chế phẩm.c2v22s2222Zzre 38 BA oI: Cl (RP eeeeaoaesdeaoaeoaaaeoreeesesroeessysee 38 2. Độ đồng đều khối lượng.

Thời gian tan rã. Dựa vào phản ứng hóa học. 5-5 Ăxssserezereexcee 40 BD BS 10084000801 ITS. Định lượng œ-mangostin trong chế phẩm.

Khao sát quy trình định lượng œ-mangosuin. 42 SVTH: Doan Thị Hong Vân GVHD: ThS. DS Dương Thị Mộng Ngọc Khóa luận tốt nghiệp 2. Khảo sát ham lượng a-mangostin trong chế phẩm.

Khảo sát độ đồng đều hàm lượng a-mangostin trong chế phẩm. PHƯƠNG PHAP ĐÁNH BAT GOC TỰ DO BANG THU NGHIỆM DPPH Ít. NGUYÊN D/22<44sx0i62426000464663000k20646(06664ix6iã6edxiig 46 34: CÍG Ais Bile a a pis a ec eat i00 g6 46 33: CÁCH eis VỀ pea sii cesta aaa 47 CHUONG 4: KET QUA & BAN LUAN 1. KHAO SÁT ĐỘ TINH KHIET CUA CHE PHẢM.- 48 li: ĐỒ Mii essisictesccensceis asta sce scene esas Naina aabesaaabD 48 1:3: Độ đồng đhi Naa Darna cass 6cc0 260020000 62664010013/22 83 48 12.

TH gi Gáqnaq 66t dc rGiti6Gtcdoibasassyoxiieeeaye 49 2. ĐỊNH TÍNH a-MANGOSTIN TRONG CHE PHẢM. Định tinh bằng phan ứng hóa hoe. Dinh tinh bằng sắc ky lớp mỏng.

ĐỊNH LƯỢNG a-MANGOSTIN TRONG CHE PHÁM. Khảo sát quy trình định lượng a-mangostin bằng phương pháp do mật đo quang dựa trên chất chuẩn œ-mangostin. Khảo sát độ hắp thu cực Api.12: hoang tuyên Lúc S 2220206600226 ckGuoei55 5:1:3: Độ dÌ NÊN XE: ccc6Sá00002000/09006GGGGGI00010Gã50S0 10004280501057 Bs Độ (ŨNG ssá¿icŸcjceciuikiobtLEix,adiiiiiieSasaidkii4(GI°xGa-ssdiit 57 3.