Tổng quan luận án

Công trình luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Lê Thị Hoa, dưới sự hướng dẫn của GS. Nguyễn Hữu Đĩnh và TS. Trịnh Thị Huấn, được thực hiện tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và Khoa Khoa học Tự nhiên – Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa, hoàn thành vào tháng 6 năm 2020. Luận án mang tiêu đề "Nghiên cứu tổng hợp, cấu trúc và chuyển hóa một số dãy hợp chất furoxan, quinoline và quinazoline nhiều nhóm thế từ eugenol trong tinh dầu hương nhu".

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Hóa học dị vòng giữ vị trí trung tâm trong hóa học hữu cơ hiện đại, chiếm tỉ trọng lớn trong các cấu trúc hóa dược mới được phát triển. Phần lớn các hợp chất dị vòng như furoxan, quinoline và quinazoline thương mại hoặc trong nghiên cứu trước đây đều được tổng hợp từ nguồn nguyên liệu của công nghiệp hóa dầu. Việc khai thác các hợp chất đồng vòng tự nhiên sẵn có trong tinh dầu thực vật (như eugenol từ tinh dầu hương nhu) để chuyển hóa thành các khung dị vòng nhiều nhóm thế là một hướng tiếp cận phù hợp với định hướng hóa học xanh, tận dụng nguồn nguyên liệu tái tạo dồi dào tại Việt Nam.

Mỗi hệ dị vòng mục tiêu trong luận án đều sở hữu những đặc tính sinh học và ứng dụng đặc thù:

  • Dị vòng furoxan (1,2,5-oxadiazole-2-oxide): Có khả năng giải phóng nitric oxide (NO) trong điều kiện sinh lý, tác động lên hệ thống thần kinh điều khiển co giãn mạch máu, điều trị bệnh tim mạch và hỗ trợ kháng khuẩn, kháng ung thư. Một số tiền chất giải phóng NO kết hợp khung đồng vòng hoặc dị vòng với furoxan đang ở giai đoạn thử nghiệm lâm sàng (như NO-aspirin, NO-steroid, NO-ursodeoxycholic acid).
  • Dị vòng quinoline: Xuất hiện phổ biến trong các loại thuốc kháng sinh, kháng khuẩn, thuốc trị sốt rét (quinine, chloroquine, mefloquine), thuốc chống lao phổi, thuốc ức chế thụ thể tăng trưởng biểu bì EGFR/HER-2 trong điều trị ung thư (như Pelitinib, Neratinib), đồng thời được sử dụng trong hóa phân tích để tạo phức trắc quang và huỳnh quang với ion kim loại.
  • Dị vòng quinazoline và quinazolinone: Có hoạt tính hạ huyết áp (doxazosin mesylate, terazosin, prazosin), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và kháng ung thư thông qua cơ chế ức chế thymidylate synthase, poly-(ADP-ribose) polymerase (PARP) và tyrosine kinase (như Gefitinib, Erlotinib).

Khoảng trống nghiên cứu luận án tập trung giải quyết là: các công trình tổng hợp dị vòng từ nguồn tinh dầu thực vật còn tương đối ít; đặc biệt, việc tổng hợp và chuyển hóa các hệ phân tử lai chứa đồng thời cả hai dị vòng furoxan và quinoline, hoặc các dẫn xuất quinoline và quinazoline đa nhóm thế từ eugenol chưa từng được nghiên cứu toàn diện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Luận án xác định mục đích tổng quát là: Nghiên cứu tổng hợp, xác định cấu trúc và chuyển hóa một số hợp chất mới chứa dị vòng furoxan, quinoline và quinazoline nhiều nhóm thế từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao hoặc có ứng dụng khác.

Nhiệm vụ nghiên cứu được phân định thành 4 nội dung cụ thể:

  1. Xuất phát từ eugenol trong tinh dầu hương nhu để tổng hợp một số chất chìa khóa ($A_0$, $B_1$, $D_1$, $E_0$, $G_0$).
  2. Chuyển hóa các chất chìa khóa tổng hợp được thành các dãy hợp chất mới (dãy A, dãy B, dãy D, dãy E, dãy G).
  3. Nghiên cứu tính chất lý hóa và xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất tổng hợp được bằng các phương pháp phổ hiện đại.
  4. Thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (kháng khuẩn, kháng nấm), hoạt tính độc tế bào ung thư và hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các hợp chất mới chứa dị vòng furoxan, quinoline và quinazoline nhiều nhóm thế được tổng hợp từ nguồn olefin tự nhiên (eugenol trong tinh dầu hương nhu Việt Nam).
  • Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu quy trình tổng hợp hữu cơ, cơ chế phản ứng, tính chất vật lý (nhiệt độ nóng chảy), đặc trưng phổ (IR, 1D/2D NMR, MS, nhiễu xạ tia X đơn tinh thể), cùng với việc đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh học in vitro (kháng vi sinh vật kiểm định, độc tế bào ung thư trên 4 dòng, chống oxy hóa DPPH).

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

  • Mở ra hướng tổng hợp các dãy hợp chất dị vòng phức tạp theo nguyên tắc hóa học xanh xuất phát từ eugenol.
  • Cung cấp bộ dữ liệu chuẩn xác về phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$ NMR, $^{13}\text{C}$ NMR, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối lượng (ESI-MS) và nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (XRD) của các hợp chất dị vòng đa chức, phục vụ nghiên cứu và giảng dạy chuyên ngành hóa hữu cơ.
  • Phát hiện một số dẫn xuất quinazoline có độc tính tế bào cao, tạo cơ sở định hướng cấu trúc cho việc nghiên cứu và phát triển các hoạt chất sinh học tiềm năng.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu về dị vòng furoxan

Tổng quan tài liệu quốc tế chỉ ra các phương pháp kinh điển để tổng hợp vòng furoxan:

  • Từ alkene: Sheremetev và cộng sự cộng $\text{N}_2\text{O}_3$ vào alkene tạo nitro oxime rồi tách nước tạo furoxan, hoặc chuyển hóa ester không no thành furoxan chứa 2 nhóm ester. Fernandes và cộng sự (2016) tổng hợp furoxan từ methacrylic acid và styrene. Dutra và cộng sự tổng hợp furoxan từ alkene chứa vòng thơm.
  • Từ aldehyde và acid không no: Mu và cộng sự, Cotelle, Serafim và cộng sự tổng hợp các dẫn xuất furoxan đa chức.
  • Từ quá trình oxy hóa 1,2-dioxime: Godovikova và cộng sự cho glyoxime tác dụng với $\text{N}_2\text{O}_4$ trong $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ ở 35–38 °C; Konstantinova và cộng sự cho dichloro-glyoxime tác dụng với $\text{Na}_2\text{S}/\text{H}_2\text{SO}_4$ tạo tetrone tetraoxime rồi oxy hóa bằng $\text{HNO}_3$ thu được bis[1,2,5]oxadiazole di-N-oxide.
  • Từ $\alpha$-nitro ketoxime và nitrile oxide: Crosby và cộng sự dùng xúc tác $\text{SO}_3/\text{DMF}$; Zhao và cộng sự (2015) đề xuất phương pháp sulfonyl hóa chọn lọc tổng hợp 3-alkyl-4-arylfuroxan.
  • Nghiên cứu tại Việt Nam: Nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Hữu Đĩnh đã tổng hợp thành công furoxan từ eugenol (hương nhu), anethole (tinh dầu hồi) và safrole (tinh dầu xá xị), chuyển hóa thành các hợp chất nitro, amino, azo, azomethine, amide, hydrazine và hydrazone.
  • Ứng dụng y dược của furoxan: Ferioli và cộng sự chứng minh khả năng giải phóng NO làm giãn động mạch vành thỏ gấp 3–10 lần nitroglycerine; Fernandes và cộng sự xác định hoạt tính kháng chủng lao đa kháng thuốc MDR-TB ($\text{MIC}{90}$ từ 1,03–11,82 $\mu\text{M}$); Dutra và cộng sự chứng minh hoạt tính ức chế ký sinh trùng Leishmania amazonensis ($\text{IC}{50} = 2,97\ \mu\text{M}$); Cena và cộng sự gắn furoxan với aspirin; Li và cộng sự gắn furoxan với oridonin ($\text{IC}{50}$ trên Bel-7402 đạt 0,86 $\mu\text{M}$) và dẫn xuất steroid-furoxan; Fang và cộng sự (2017) tổng hợp dẫn xuất furoxan triterpenoid saponin ức chế 4 dòng tế bào khối u ($\text{IC}{50} = 1,6\text{--}6,5\ \mu\text{M}$).

Các hướng nghiên cứu về dị vòng quinazoline

  • Phương pháp tổng hợp trên thế giới: Được phân loại theo số lượng cấu tử đầu:
    • Từ một chất đầu: Lin và cộng sự tổng hợp từ amidine với xúc tác $\text{I}_2$ hoặc $\text{K}_2\text{S}_2\text{O}_8$; Ezaki và cộng sự khép vòng từ 2-(1-azidoalkyl)phenylisocyanide; Cakici tổng hợp từ amide xúc tác NaOH.
    • Từ hai hoặc ba chất đầu: Omar và cộng sự kết hợp benzylamine và amidine; Zhang và cộng sự kết hợp amine với dẫn xuất carbonyl; Derabli và cộng sự tổng hợp 1,2-dihydroquinazoline từ 2-aminobenzophenone, aldehyde và ammonium acetate với xúc tác DMAP; Baghbanian và cộng sự sử dụng xúc tác nano $\text{CuFe}_2\text{O}_4$; Bhat tổng hợp xanh không dung môi từ orthoester; Bhuyan và cộng sự (2014) tổng hợp 2,4-diaryltetrahydro-quinazolinone từ aldehyde, $\text{NH}_3$ và $\beta$-naphthylamine dưới điều kiện vi sóng.
  • Nghiên cứu tại Việt Nam: Nhóm Trương Ngọc Tuyền nghiên cứu dẫn chất 2-methyl-6-bromo-4(3H)-quinazolinone; nhóm GS.TS Nguyễn Văn Tuyến tổng hợp dẫn xuất của erlotinib và các dẫn xuất lai 4-anilinoquinazoline gắn triazole kháng 3 dòng ung thư (KB, Hep-G2, Lu).
  • Ứng dụng của quinazoline: Bedi và cộng sự phát hiện hoạt tính kháng khuẩn S. aeruginosa mạnh hơn ciprofloxacin; Xu và cộng sự ghi nhận hoạt tính kháng nấm; Ye và cộng sự chứng minh khả năng chống E. tenella trên gà; Ghorab và cộng sự đánh giá hoạt tính kháng S. marcescens, P. mirabilis, B. cereus; El-Azab và cộng sự thử nghiệm kháng ung thư vú MCF-7 ($\text{IC}_{50} = 3,35\text{--}6,81\ \mu\text{g/ml}$); Al-Obaid và Al-Omary chứng minh khả năng ức chế enzyme DHFR; Alafeefy và cộng sự phát hiện hoạt tính kháng viêm mạnh hơn indomethacin; Al-Salahi và cộng sự khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên 40 dẫn xuất triazoloquinazoline.

Các hướng nghiên cứu về dị vòng quinoline

  • Phương pháp tổng hợp kinh điển và cải tiến: Skraup, Döebner–Miller, Friedländer, Pfitzinger, Conrad–Limpach, Combes. Các cải tiến xúc tác và chất oxy hóa: Billah và cộng sự dùng xúc tác $\text{I}_2$; Reynolds và cộng sự phát triển hệ dị pha $\text{HCl}$–toluene giảm thiểu sự trùng hợp aldehyde; Min dùng xúc tác $\text{BF}_3\cdot\text{Et}_2\text{O}$; McNaughton và Miller cải tiến phản ứng Friedländer một nồi với $\text{SnCl}_2/\text{ZnCl}_2/\text{EtOH}$; Wang và cộng sự tổng hợp hơn 40 hợp chất 2-aminoquinoline-3-carboxamide; Abdelwahid và cộng sự tổng hợp từ isatin; Jentsch và cộng sự tổng hợp từ anthranilic acid; Gen Fu và cộng sự (2019) chuyển hóa 5-chloro-8-hydroxyquinoline qua phản ứng Mannich; George và cộng sự (2019) chuyển hóa 2-chloro-6-methoxyquinoline-3-carbaldehyde.
  • Nghiên cứu tại Việt Nam: GS. Nguyễn Hữu Đĩnh và cộng sự lần đầu tiên cô lập được chất trung gian dạng aci-quinone ($A_0$) từ eugenoxyacetic acid ở dạng rắn màu vàng, sau đó khử bằng $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_4$ để tạo thành (6-hydroxy-3-sulfoquinolin-7-yloxy)acetic acid (hợp chất 144) – một phương pháp đóng vòng quinoline hoàn toàn mới. Nhóm cũng phát hiện phản ứng thế nucleophile chọn lọc trên dẫn xuất N-methyl quinoline.
  • Ứng dụng của quinoline: Làm thuốc chống sốt rét (quinine, chloroquine); kháng khuẩn (Egu và cộng sự, 2017; Gen Fu và cộng sự); ức chế thụ thể EGFR/HER-2 điều trị ung thư như Pelitinib (Wissner và cộng sự), Neratinib (Cherian và cộng sự), các dẫn xuất của George và cộng sự ($\text{IC}_{50}$ cấp độ nanomole trên dòng ung thư đại trực tràng DLD-1); ứng dụng trong hóa phân tích làm chất chỉ thị tạo phức và phát quang/huỳnh quang (Snazoxs, Ferron, 8-hydroxyquinoline).

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Luận án kế thừa các kết quả nghiên cứu về eugenol của nhóm GS. Nguyễn Hữu Đĩnh, tập trung giải quyết khoảng trống:

  1. Tối ưu hóa quy trình tổng hợp chất chìa khóa amino-furoxan $A_0$ và carbaldehyde-quinoline $E_0$.
  2. Phát triển phương pháp tổng hợp chất chìa khóa mới $B_1$ mang đồng thời cả dị vòng furoxan và dị vòng quinoline.
  3. Khám phá phản ứng chuyển hóa dị vòng furoxan gắn nhóm acetamido thành dị vòng quinazoline đa nhóm thế $D_1$ qua tác nhân Vilsmeier–Haack.
  4. Xây dựng thư viện các hợp chất lai đa vòng thế, xác định cấu trúc toàn diện và thử nghiệm hoạt tính sinh học định hướng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các chuyển hóa hóa học

Luận án áp dụng các phản ứng hóa học hữu cơ đặc trưng:

  • Phản ứng ghép đôi azo (diazotization - coupling): Chuyển nhóm amino thơm của $A_0$ thành muối diazonium bằng $\text{NaNO}_2/\text{HCl}$ ở 0–5 °C, sau đó ghép đôi với các phenol hoặc dẫn xuất amine thơm để tạo liên kết azo ($-\text{N}=\text{N}-$).
  • Phản ứng ngưng tụ tạo azomethine (Base Schiff): Phản ứng giữa amin $A_0$ và các aldehyde thơm.
  • Phản ứng đóng vòng Döebner–Miller cải tiến: Đóng vòng nhân pyridine trên nhân benzen của furoxan $A_0$ bằng paraldehyde trong môi trường dị pha $\text{HCl}$/toluene ở 80 °C để tạo dị vòng quinoline gắn furoxan ($B_1$).
  • Phản ứng Vilsmeier–Haack và sự chuyển hóa dị vòng: Tác dụng của hệ $\text{POCl}_3/\text{DMF}$ lên 3-methyl-4-(2-acetamido-4,5-dimethoxyphenyl)furoxan (Am) dẫn đến sự mở vòng/tái sắp xếp tạo khung quinazoline $D_1$.
  • Phản ứng Reimer–Tiemann: Formyl hóa hợp chất quinoline $Q_0$ bằng $\text{CHCl}_3/\text{NaOH}$ tạo aldehyde $E_0$.
  • Phản ứng ngưng tụ Claisen–Schmidt: Tạo các $\alpha,\beta$-ketone không no từ các aldehyde và ketone tương ứng.

Phương pháp và thiết bị thực nghiệm

Phân nhóm nội dung Phương pháp / Thiết bị sử dụng Thông số / Đơn vị thực hiện
Nhiệt độ nóng chảy Máy đo Gallemkamp và máy đo TQ (2015) Đo trực tiếp bằng mao quản
Phổ hồng ngoại (IR) Máy FTIR IMPACT 410 Đo dạng viên ép KBr, dải quét 400–4000 $\text{cm}^{-1}$ (Viện Hóa học, VAST)
Phổ cộng hưởng từ (NMR) Máy Bruker XL-500 $^1\text{H}$ NMR (500 MHz), $^{13}\text{C}$ NMR (125 MHz), HSQC, HMBC, NOESY trong dung môi DMSO-$d_6$ (Viện Hóa học, VAST)
Phổ khối lượng (MS) Waters-API-ESI, Varian-MS, 6310 Ion Trap LC/MS Ghi phổ ESI-MS chế độ ion dương (+MS) và ion âm (-MS) (Viện Hóa học & Viện Hóa học các HCTN, VAST)
Nhiễu xạ tia X (XRD) Máy Bruker SMART6000 Đo đơn tinh thể ở nhiệt độ 100 K (Đại học Leuven, Vương quốc Bỉ) cho các chất $D_1$, $G_8$
Kháng vi sinh vật kiểm định Phương pháp pha loãng nồng độ trên môi trường lỏng Xác định MIC, $\text{IC}_{50}$ trên 7 chủng: B. subtilis, S. aureus, L. fermentum, E. coli, P. aeruginosa, S. enterica, C. albicans
Độc tế bào in vitro Phương pháp Skehan (1990) & Likhiwitayawuid (1993) Thử trên 4 dòng tế bào: Hep-G2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), KB (ung thư biểu mô)
Chống oxy hóa Thử nghiệm hệ gốc tự do DPPH Đo độ quét gốc tự do (SC%); mẫu có $\text{SC} \ge 50%$ được coi là có hoạt tính

Nguồn nguyên liệu và hóa chất

  • Nguyên liệu tự nhiên: Tinh dầu hương nhu Việt Nam chứa 70% eugenol.
  • Hóa chất tổng hợp: Monochloroacetic acid, dimethyl sulfate, $\text{NaNO}_2$, $\text{HNO}_3$, $\text{H}_2\text{SO}_4$, $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_4$, $\text{POCl}_3$, DMF, paraldehyde, thiosemicarbazide, semicarbazide, các hợp chất aldehyde, phenol, amine thơm và dung môi tinh khiết đạt chuẩn phân tích.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Chương 1 (từ trang 3 đến trang 28) trình bày tổng quan hệ thống lý thuyết và tình hình nghiên cứu về 3 lớp dị vòng:

  1. Dị vòng Furoxan: Tổng quan các con đường tổng hợp (từ alkene, aldehyde/acid không no, glyoxime, $\alpha$-nitro ketoxime) trên thế giới và ở Việt Nam (khai thác eugenol, anethole, safrole). Phân tích khả năng giải phóng NO và các ứng dụng sinh học (giãn mạch vành, kháng lao đa kháng thuốc MDR-TB, kháng ký sinh trùng Leishmania, ức chế ung thư).
  2. Dị vòng Quinazoline: Tổng quan các phương pháp tổng hợp từ 1, 2 hoặc 3 cấu tử đầu; các công trình nghiên cứu tại Việt Nam. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Gram (+)/Gram (-), kháng virus (CMV, HSV), kháng nấm, kháng ung thư (cơ chế ức chế EGFR, thymidylate synthase, tubulin polymerase, DHFR), chống viêm và hạ huyết áp.
  3. Dị vòng Quinoline: Hệ thống các phương pháp đóng vòng kinh điển (Skraup, Döebner–Miller, Friedländer, Pfitzinger, Conrad–Limpach, Combes) và các cải tiến hệ dị pha/xúc tác mới. Điểm lại các công trình đóng vòng quinoline từ eugenol ở Việt Nam qua trung gian aci-quinone $A_0$ và phản ứng thế nucleophile trên muối quinolinium. Tổng kết ứng dụng y dược (kháng sốt rét, kháng khuẩn, ức chế EGFR điều trị ung thư) và ứng dụng hóa phân tích (thuốc thử trắc quang, cảm biến huỳnh quang).

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Chương 2 (từ trang 29 đến trang 46) mô tả chi tiết hóa chất, thiết bị, quy trình tổng hợp 5 chất chìa khóa và các dãy hợp chất dẫn xuất:

  • Tổng hợp các chất chìa khóa:
    • Chất chìa khóa $A_0$ (3-methyl-4-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)furoxan): Chuyển hóa eugenol $\rightarrow$ methyleugenol (Meug, $t_s = 255\ ^\circ\text{C}$) $\rightarrow$ isomethyleugenol (Isomeug, đun hồi lưu với $\text{KOH/EtOH}$ trong 18 h) $\rightarrow$ FuroMeug ($t_{nc} = 120\text{--}121\ ^\circ\text{C}$, nitro hóa bằng $\text{NaNO}_2/\text{CH}_3\text{COOH}$) $\rightarrow$ FuroMeug-$\text{NO}2$ ($t{nc} = 195\text{--}196\ ^\circ\text{C}$, $\text{HNO}_3/\text{H}_2\text{SO}_4/\text{CH}_3\text{COOH}$ ở 60 °C) $\rightarrow$ Khử chọn lọc bằng $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}4/\text{NaOH}$ thu được $A_0$ dạng tinh thể hình kim màu vàng ($t{nc} = 175\text{--}176\ ^\circ\text{C}$).
    • Chất chìa khóa $B_1$ (5,6-dimethoxy-8-(3-methylfuroxan-4-yl)-2-methylquinoline): Cho $A_0$ phản ứng với paraldehyde trong dung dịch $\text{HCl}$ 1:1 và toluene ở 80 °C trong 4 h, trung hòa bằng NaOH 5 M thu được tinh thể màu trắng ($t_{nc} = 179\text{--}180\ ^\circ\text{C}$).
    • Chất chìa khóa $D_1$ (4-(1-chloro-1-nitroethyl)-6,7-dimethoxy-2-methylquinazoline): Acetyl hóa $A_0$ bằng anhydride acetic dưới bức xạ vi sóng (10 phút) thu được Am ($t_{nc} = 171\ ^\circ\text{C}$). Cho Am tác dụng với hệ Vilsmeier–Haack ($\text{POCl}3/\text{DMF}$) ở 60 °C trong 4 h thu được $D_1$ dạng tinh thể vàng nâu ($t{nc} = 167\text{--}168\ ^\circ\text{C}$).
    • Chất chìa khóa $E_0$ (7-(carboxymethoxy)-6-hydroxy-3-sulfoquinoline-5-carbaldehyde): Eugenol $\rightarrow$ eugenoxyacetic acid ($t_{nc} = 72\ ^\circ\text{C}$) $\rightarrow$ aci-quinone (phân hủy >155 °C) $\rightarrow$ $Q_0$ (phân hủy ở 255 °C) $\rightarrow$ Formyl hóa $Q_0$ bằng $\text{CHCl}_3/\text{NaOH}$ ở 62 °C trong 2 h thu được $E_0$ hình kim màu vàng cánh gián.
    • Chất chìa khóa $G_0$ (7-(carboxymethoxy)-6-hydroxy-3-sulfoquinoline-5,6-dione): Oxy hóa dẫn xuất quinoline bằng $\text{HNO}_3/\text{H}_2\text{SO}_4/\text{CH}_3\text{COOH}$ ở 50 °C trong 4 h thu được $G_0$ màu vàng (phân hủy ở 125 °C).
  • Quy trình tổng hợp 5 dãy hợp chất dẫn xuất:
    • Dãy A (chứa vòng furoxan): Điều chế hợp chất azo $A_1\text{--}A_{11}$ qua 2 giai đoạn (diazoni hóa $A_0$ và ghép đôi với phenol/amine); hợp chất azomethine $A_{12}\text{--}A_{14}$; hợp chất amide $A_{15}, A_{16}$, imide $A_{17}$ và benzylamino $A_{18}$.
    • Dãy B (chứa đồng thời vòng furoxan và quinoline): Oxy hóa nhóm methyl ở vị trí C-2 của $B_1$ tạo aldehyde, acid, ester $B_2\text{--}B_7$; ngưng tụ aldehyde tạo alkene $B_8\text{--}B_{11}$; tổng hợp các $\alpha,\beta$-ketone không no $B_{12}\text{--}B_{18}$.
    • Dãy D (chứa dị vòng quinazoline): Tổng hợp các dẫn chất quinazoline $D_2\text{--}D_5$ và các hợp chất ngưng tụ $D_6\text{--}D_{12}$.
    • Dãy E (chứa vòng quinoline nhiều nhóm thế): Tổng hợp các $\alpha,\beta$-ketone không no $E_1\text{--}E_5$ và 1,5-diketone $E_6\text{--}E_8$ từ $E_0$.
    • Dãy G (dẫn chất của quinolin-5,6-dione): Phản ứng ngưng tụ của $G_0$ với thiosemicarbazide ($G_3$), với các diamine tạo khung phenazine/quinoxaline ($G_4, G_5, G_6, G_7$) và tạo hợp chất diazo $G_8$ (QN2).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

Chương 3 (từ trang 47 đến trang 145) tập trung biện giải cấu trúc, cơ chế phản ứng và thảo luận hoạt tính sinh học:

  • Biện giải cấu trúc dãy A: Phân tích phổ IR ($-\text{N}=\text{N}-$, $\text{C}=\text{O}$, $\text{N}\rightarrow\text{O}$ của furoxan), phổ $^1\text{H}$ NMR, $^{13}\text{C}$ NMR và tương tác không gian qua HMBC của các hợp chất azo $A_1\text{--}A_{11}$, azomethine $A_{12}\text{--}A_{14}$ và amide/imide $A_{15}\text{--}A_{18}$.
  • Biện giải cấu trúc dãy B: Khảo sát điều kiện tối ưu tổng hợp $B_1$ (xúc tác $\text{HCl}$, dung môi dị pha toluene, 80 °C). Chứng minh sự hình thành khung quinoline gắn furoxan qua phổ 2D NMR (HMBC) và phổ (+)ESI-MS. Biện giải cấu trúc các dẫn xuất carbonyl $B_2\text{--}B_7$, các dẫn xuất alkene $B_8\text{--}B_{11}$ (xác định cấu hình trans qua hằng số tương tác $J$ trên phổ $^1\text{H}$ NMR) và các $\alpha,\beta$-ketone không no $B_{12}\text{--}B_{18}$.
  • Biện giải cấu trúc và cơ chế dãy D:
    • Khẳng định cấu trúc tinh thể học của chất chìa khóa quinazoline $D_1$ bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (XRD) đo ở 100 K kết hợp NOESY và phổ +MS.
    • Đề xuất và chứng minh cơ chế chuyển hóa đặc biệt từ Am thành $D_1$ dưới tác dụng của tác nhân Vilsmeier–Haack, bao gồm sự tấn công của nhóm imine trung gian, khép vòng pyrimidine và mở dị vòng furoxan mang nhóm 1-chloro-1-nitroethyl ở vị trí C-4.
    • Phân tích cấu trúc các dẫn xuất $D_2\text{--}D_5$ và các ketone $D_6\text{--}D_{12}$ qua phổ IR, $^1\text{H}$ NMR, $^{13}\text{C}$ NMR, HMBC và sơ đồ phân mảnh khối phổ.
  • Biện giải cấu trúc dãy E: Phân tích điều kiện phản ứng tổng hợp chất chìa khóa carbaldehyde $E_0$. Biện giải cấu trúc các ketone không no $E_1\text{--}E_5$ và các 1,5-diketone $E_6\text{--}E_8$ bằng phổ HSQC, HMBC và phổ khối +MS.
  • Biện giải cấu trúc dãy G: Chứng minh phản ứng ngưng tụ chọn lọc nhóm carbonyl của $G_0$ với thiosemicarbazide ($G_3$), ngưng tụ với diamine tạo hệ đa vòng ngưng kết pyrido[3,2-f]quinoxaline ($G_4, G_5$) và pyrido[3,2-a]phenazine ($G_6, G_7$). Xác định cấu trúc lập thể của hợp chất diazo $G_8$ (QN2) bằng kết quả nhiễu xạ tia X đơn tinh thể, công bố chi tiết độ dài liên kết ($\text{Å}$) và góc liên kết.
  • Kết quả thăm dò hoạt tính sinh học:
    • Kháng vi sinh vật kiểm định: Đánh giá giá trị MIC trên 7 chủng chuẩn. Xác định một số hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế chọn lọc trên các chủng vi khuẩn Gram (+) (B. subtilis, S. aureus) và nấm men (C. albicans).
    • Hoạt tính độc tế bào: Sàng lọc trên 4 dòng tế bào ung thư người (Hep-G2, Lu-1, MCF-7, KB). Kết quả cho thấy một số dẫn chất quinazoline thuộc dãy D thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh (đạt ngưỡng $\text{IC}_{50} \le 4\ \mu\text{g/ml}$).
    • Hoạt tính chống oxy hóa: Đánh giá khả năng dập tắt gốc tự do DPPH, ghi nhận giá trị % quét gốc tự do (SC) của các dẫn xuất quinoline chứa nhóm polyphenol/hydroxy.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

  1. Phát triển phương pháp tiếp cận hóa học xanh: Xây dựng thành công quy trình chuyển hóa eugenol – một hợp chất đồng vòng thiên nhiên có sẵn trong tinh dầu hương nhu Việt Nam – thành các chất chìa khóa mang dị vòng furoxan ($A_0$), dị vòng lai furoxan-quinoline ($B_1$), dị vòng quinazoline ($D_1$), dị vòng quinoline đa nhóm thế ($E_0$) và quinolin-5,6-dione ($G_0$).
  2. Khám phá phản ứng chuyển hóa dị vòng mới: Phát hiện và làm sáng tỏ cơ chế phản ứng chuyển hóa từ 3-methyl-4-(2-acetamido-4,5-dimethoxyphenyl)furoxan (Am) thành 4-(1-chloro-1-nitroethyl)-6,7-dimethoxy-2-methylquinazoline ($D_1$) dưới tác dụng của hệ tác nhân Vilsmeier–Haack ($\text{POCl}_3/\text{DMF}$). Cấu trúc của $D_1$ được chứng minh tường minh bằng nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (XRD).
  3. Tổng hợp hệ dị vòng lai mới: Lần đầu tiên tổng hợp thành công hệ hợp chất mang đồng thời cả hai dị vòng có hoạt tính cao là furoxan và quinoline ($B_1$) bằng phản ứng đóng vòng Döebner–Miller cải tiến trong hệ dị pha, cùng các dãy dẫn xuất aldehyde, acid, ester, alkene và $\alpha,\beta$-ketone không no liên kết với hệ lai này.
  4. Cung cấp dữ liệu phổ cấu trúc chuẩn xác: Thiết lập hệ thống dữ liệu phổ đầy đủ và có độ tin cậy cao bao gồm IR, $^1\text{H}$ NMR, $^{13}\text{C}$ NMR, 2D NMR (HSQC, HMBC, NOESY), MS và XRD đơn tinh thể (cho $D_1$ và $G_8$), phục vụ quy gán cấu trúc hóa học dị vòng.

Những đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Mở rộng thư viện hợp chất hữu cơ: Đã tổng hợp được 5 dãy hợp chất mới với số lượng lớn các dẫn xuất đa dạng:
    • Dãy A: Các dẫn xuất azo ($A_1\text{--}A_{11}$), azomethine ($A_{12}\text{--}A_{14}$), amide, imide và benzylamino ($A_{15}\text{--}A_{18}$).
    • Dãy B: Các dẫn xuất aldehyde, acid, ester ($B_2\text{--}B_7$), alkene ($B_8\text{--}B_{11}$), $\alpha,\beta$-ketone không no ($B_{12}\text{--}B_{18}$).
    • Dãy D: Các dẫn xuất quinazoline ($D_2\text{--}D_{12}$).
    • Dãy E: Các $\alpha,\beta$-ketone không no ($E_1\text{--}E_5$) và 1,5-diketone ($E_6\text{--}E_8$).
    • Dãy G: Các dẫn xuất ngưng tụ quinolin-5,6-dione với thiosemicarbazide, diamine ($G_3\text{--}G_7$) và dẫn xuất diazo $G_8$.
  2. Định hướng hoạt tính sinh học: Kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã phát hiện một số hợp chất quinazoline dãy D có độc tính tế bào cao đối với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, cung cấp các cấu trúc dẫn đường (lead compounds) cho các nghiên cứu phát triển hóa dược tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

Dựa trên phạm vi và nội dung thực nghiệm được công bố trong luận án:

  • Một số phản ứng chuyển hóa trung gian ở các nhánh tổng hợp quinoline đa nhóm thế có hiệu suất chưa đồng đều, đòi hỏi điều kiện kiểm soát nhiệt độ và thời gian phản ứng nghiêm ngặt.
  • Việc đánh giá hoạt tính sinh học mới dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro sơ bộ (xác định MIC kháng vi sinh vật kiểm định, $\text{IC}_{50}$ độc tế bào và % quét gốc tự do DPPH), chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình in vivo trên động vật.
  • Chưa đi sâu khảo sát chi tiết cơ chế tác động phân tử (như mức độ ức chế cụ thể trên các enzyme đích kinase, EGFR, PARP, DHFR hoặc định lượng lượng NO giải phóng thực tế trong môi trường sinh lý đối với các dẫn xuất furoxan mới tổng hợp).

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tối ưu hóa điều kiện phản ứng và xúc tác nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp các chất chìa khóa và các dẫn xuất lai furoxan-quinoline.
  • Mở rộng khảo sát hoạt tính sinh học chuyên sâu đối với các dẫn xuất quinazoline dãy D có độc tính tế bào cao, nghiên cứu cơ chế ức chế enzyme và đánh giá độc tính tế bào lành.
  • Định lượng khả năng giải phóng nitric oxide (NO) của các dẫn xuất chứa dị vòng furoxan tổng hợp được trong điều kiện mô phỏng sinh lý có mặt L-cysteine.
  • Thử nghiệm khả năng tạo phức và khảo sát tính chất quang phổ huỳnh quang của các dẫn xuất quinoline đa nhóm thế dãy E và dãy G ứng dụng trong hóa phân tích.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược: Cung cấp tài liệu mẫu mực về phương pháp tổng hợp hữu cơ hiện đại, kỹ thuật xử lý phản ứng trong hệ dị pha, phản ứng vi sóng và phương pháp biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối ESI-MS và nhiễu xạ tia X.
  • Các nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp quy trình công nghệ chi tiết để chuyển hóa nguyên liệu tinh dầu hương nhu (eugenol) thành các hoạt chất có giá trị gia tăng cao, phù hợp với định hướng hóa học xanh.
  • Phần nội dung đáng tham khảo nhất trong luận án:
    • Quy trình thực nghiệm tổng hợp các chất chìa khóa $A_0$, $B_1$, $D_1$, $E_0$, $G_0$ ở Chương 2.
    • Bảng dữ liệu quy gán đầy đủ độ chuyển dịch hóa học ($^1\text{H}$ NMR, $^{13}\text{C}$ NMR) và hằng số tương tác spin-spin ($J$) của các dãy chất ở Chương 3.
    • Các sơ đồ phân tích cơ chế khép vòng và chuyển hóa dị vòng dưới tác dụng của tác nhân Vilsmeier–Haack và Döebner–Miller cải tiến.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguyên liệu ban đầu của luận án là gì và được chuyển hóa thành những chất chìa khóa nào?

Luận án sử dụng nguyên liệu khởi đầu là tinh dầu hương nhu Việt Nam chứa 70% eugenol. Từ eugenol, tác giả đã tổng hợp được 5 chất chìa khóa chính đại diện cho các hệ dị vòng:

  • $A_0$: 3-methyl-4-(2-amino-4,5-dimethoxyphenyl)furoxan ($t_{nc} = 175\text{--}176\ ^\circ\text{C}$).
  • $B_1$: 5,6-dimethoxy-8-(3-methylfuroxan-4-yl)-2-methylquinoline ($t_{nc} = 179\text{--}180\ ^\circ\text{C}$, chứa đồng thời vòng furoxan và quinoline).
  • $D_1$: 4-(1-chloro-1-nitroethyl)-6,7-dimethoxy-2-methylquinazoline ($t_{nc} = 167\text{--}168\ ^\circ\text{C}$).
  • $E_0$: 7-(carboxymethoxy)-6-hydroxy-3-sulfoquinoline-5-carbaldehyde.
  • $G_0$: 7-(carboxymethoxy)-6-hydroxy-3-sulfoquinoline-5,6-dione (phân hủy ở 125 °C).

2. Dị vòng lai chứa đồng thời cả nhân furoxan và quinoline ($B_1$) được tổng hợp bằng phương pháp nào?

Hợp chất $B_1$ được tổng hợp bằng phản ứng đóng vòng Döebner–Miller cải tiến giữa amine chứa vòng furoxan $A_0$ (0,502 g, 2 mmol) và paraldehyde (2 ml) trong môi trường dị pha gồm dung dịch $\text{HCl}$ 1:1 (12 ml) và toluene (6 ml) ở nhiệt độ 80 °C trong thời gian 4 giờ. Sau khi tách pha dung dịch và trung hòa bằng dung dịch NaOH 5 M, sản phẩm được kết tinh trong ethanol thu được tinh thể hình kim màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 179–180 °C.

3. Cơ chế tạo thành chất chìa khóa quinazoline $D_1$ từ dẫn xuất furoxan Am có đặc điểm gì nổi bật?

Khi cho 3-methyl-4-(2-acetamido-4,5-dimethoxyphenyl)furoxan (Am) tác dụng với tác nhân Vilsmeier–Haack ($\text{POCl}_3/\text{DMF}$) ở 60 °C trong 4 giờ, phản ứng xảy ra sự khép vòng pyrimidine tạo khung quinazoline đồng thời với sự mở/biến đổi dị vòng furoxan thành nhóm thế 4-(1-chloro-1-nitroethyl) tại vị trí C-4 của nhân quinazoline. Cấu trúc tinh thể học và sự sắp xếp phân tử trong ô mạng cơ sở của $D_1$ đã được xác định và khẳng định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (XRD).

4. Cấu trúc của các hợp chất trong luận án được xác định bằng những phương pháp vật lý và phổ nào?

Các hợp chất tổng hợp được xác định cấu trúc toàn diện bằng các phương pháp:

  • Nhiệt độ nóng chảy (máy Gallemkamp và thiết bị đo 2015).
  • Phổ hồng ngoại (FTIR IMPACT 410 dạng viên ép KBr).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều ($^1\text{H}$ NMR 500 MHz, $^{13}\text{C}$ NMR 125 MHz, HSQC, HMBC, NOESY trên máy Bruker XL-500 trong dung môi DMSO-$d_6$).
  • Phổ khối lượng ESI-MS (Waters-API-ESI, Varian-MS, 6310 Ion Trap LC/MS).
  • Nhiễu xạ tia X đơn tinh thể (Bruker SMART6000 ở 100 K) cho các cấu trúc tinh thể $D_1$ và $G_8$.

5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được thử nghiệm trên những đối tượng nào và đạt tiêu chuẩn đánh giá ra sao?

Luận án đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro trên 3 hệ thống:

  1. Kháng vi sinh vật kiểm định: Thử nghiệm phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng với 7 chủng: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Candida albicans. Mẫu tinh có $\text{MIC} \le 50\ \mu\text{g/ml}$ được đánh giá là có hoạt tính.
  2. Độc tế bào ung thư: Thử nghiệm theo phương pháp Skehan và Likhiwitayawuid trên 4 dòng tế bào người: Hep-G2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), KB (ung thư biểu mô). Tiêu chuẩn chất sạch có hoạt tính khi $\text{IC}_{50} \le 4\ \mu\text{g/ml}$.
  3. Chống oxy hóa: Thử nghiệm trên hệ gốc tự do DPPH, mẫu có độ quét gốc tự do $\text{SC} \ge 50%$ được đánh giá là có hoạt tính.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Hoa đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu chuyển hóa eugenol từ nguồn tinh dầu hương nhu tự nhiên thành 5 dãy hợp chất dị vòng mới thuộc các hệ furoxan, quinoline và quinazoline nhiều nhóm thế. Công trình đã thiết lập các phương pháp tổng hợp hiệu quả, làm sáng tỏ cơ chế khép vòng và chuyển hóa dị vòng phức tạp, đồng thời xác định chính xác cấu trúc hóa học bằng hệ thống phổ 1D/2D NMR, ESI-MS và nhiễu xạ tia X đơn tinh thể. Kết quả sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro đã phát hiện một số dẫn xuất quinazoline thể hiện độc tính tế bào cao trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn của các hợp chất dị vòng tổng hợp theo định hướng hóa học xanh.