MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, các chất làm ngọt nhân tạo nhƣ saccharin, aspartame, sucralose và acesulfame-K đƣợc con ngƣời sử dụng phổ biến nhƣ những chất làm ngọt ít năng lƣợng, nhằm giảm nguy cơ mắc các bệnh mạn tính liên quan đến đƣờng nhƣ béo phì, đái tháo đƣờng. Tuy nhiên, một số hợp chất này có thể gây ung thƣ (Kant 2005). Trong tự nhiên, có rất nhiều loại protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt đã đƣợc phát hiện bao gồm thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin, brazzein, neoculin (curculin) và miraculin.
Các protein này có thể đƣợc sử dụng để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo bởi vì chúng tạo vị ngọt cho ngƣời sử dụng, an toàn do có nguồn gốc tự nhiên và ít sinh năng lƣợng. Tuy nhiên, sản lƣợng tự nhiên của các protein này bị hạn chế do hầu hết các protein này thu đƣợc từ cây sống ở vùng nhiệt đới, nơi có điều kiện khí hậu khắc nghiệt (Kant 2005). Gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu biểu hiện thành công một số protein ngọt và tạo vị ngọt nhƣ thaumatin, monellin, brazzein và miraculin ở quy mô phòng thí nghiệm trong một số hệ thống biểu hiện nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm, tế bào BY2, hệ thống nuôi cấy rễ tơ và cây trồng chuyển gen (Masuda, Kitabatake 2006, Pham Bich Ngoc 2009). Tuy nhiên, mức độ tích lũy của các protein tái tổ hợp này khá thấp, dẫn đến các nghiên cứu về protein ngọt và protein tạo vị ngọt đều chƣa thể sản xuất thƣơng mại các sản phẩm tái tổ hợp.
Miraculin là một trong số các protein tạo vị ngọt, có trong quả của cây thần kỳ (Richadella dulcifica), có đặc tính tạo ra cảm giác ngọt để thay đổi từ vị chua thành cảm giác ngọt mà bản chất của miraculin là không ngọt. Tính chất độc đáo này của miraculin rất có ích cho con ngƣời nhằm ngăn ngừa các căn bệnh hiện đại do các chất làm ngọt nhân tạo gây ra. Miraculin cũng là chất ít sinh năng lƣợng. Do 2 vậy, có thể sử dụng miraculin để thay thế đƣờng, giúp ngƣời sử dụng tránh đƣợc các nguy cơ mắc bệnh béo phì.
Với tính chất độc đáo nhƣ vậy, xong sản lƣợng của miraculin trong tự nhiên bị hạn chế do cây thần kỳ sinh trƣởng chậm ở nơi khí hậu khắc nghiệt của Tây Phi. Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm sản xuất miraculin tái tổ hợp trên một số đối tƣợng khác nhau. Tuy nhiên, mức độ tích lũy của miraculin tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện vẫn chƣa đƣợc nhƣ kỳ vọng. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen”.
Mục tiêu nghiên cứu Thay đổi mã di truyền gen miraculin của cây thần kỳ, thiết kế vector chuyển gen cùng với các promoter đặc hiệu và promoter cảm ứng để chuyển vào dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua nhằm thu đƣợc các dòng chuyển gen có khả năng biểu hiện miraculin tái tổ hợp. Nội dung nghiên cứu 1) Thay đổi mã di truyền của gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà. Phân lập, nhân dòng promoter E8 từ cà chua, promoter HSP 18.2 và terminator HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana. 2) Thiết kế vector biểu hiện miraculin trong dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua.
3) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá. 4) Biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong cây cà chua. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn 4. Ý nghĩa lý luận Đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tăng cƣờng mức độ biểu hiện của gen chuyển ở thực vật bằng cách thay đổi mã di truyền, promoter, terminator và hệ thống biểu hiện thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn 1) Sản xuất protein tái tổ hợp miraculin quy mô phòng thí nghiệm bằng dòng tế bào BY2 và rễ tơ chuyển gen. 2) Sản xuất protein tái tổ miraculin ngoài tự nhiên bằng cây cà chua chuyển gen. Đóng góp mới của luận án 1) Protein tái tổ hợp miraculin đã đƣợc biểu hiện thành công trong dòng tế bào BY2 với hàm lƣợng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng số; biểu hiện trong hệ thống rễ tơ thuốc lá, hàm lƣợng tự 13,7-19,97 ng/µg protein tan tổng số. 2) Miraculin tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện thành công trong cà chua, trong đó gồm 5 dòng mang bản đơn copy của gen chuyển, hàm lƣợng cao ở các dòng cà chua đƣợc chuyển cấu trúc biểu hiện đặc hiệu ở quả, đạt 118,0 ng/µg protein tan tổng số, cao gấp hơn 4 lần so với các dòng đƣợc chuyển cấu trúc mang promoter 35S.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN 1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới đã xác định đƣợc 7 loại protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt từ tự nhiên. Theo đặc tính có thể chia thành 3 nhóm: (i) các protein ngọt (thaumatin, monellin, mabinlin, pentadin và brazzein), (ii) protein cảm ứng độ ngọt (miraculin) và (iii) protein có đủ đặc tính của hai nhóm trên (neoculin).
Các thuộc tính và tính chất chất của các protein này đƣợc trình bày ở bảng 1. Một số đặc tính của protein ngọt và tạo cảm giác ngọt (Kant 2005) Đặc Thaumatin Monellin Mabilin Pentadin Brazzein Curculin Miraculin tính Nguồn T. dulcifica gốc Benth Diels latifolia Phân bố Tây Phi Tây Phi Trung Quốc Tây Phi Tây Phi Malaysia Tây Phi Biến thể I, II, a, b, c - I, II-a, III, - - - - IV Độ ngọt 3000 3000 100 500 2000 550 - (*) KLPT 22,2 10,7 12,4 12,0 6,5 24,9 24,6 (kDa) Acid 207 45 (chuỗi A) 33 (chuỗi - 54 114 191 amin 50 (Chuỗi B) A) 72 (Chuỗi B) Dạng Monomer (A+B) (A+B)(1) - Monomer (A+A)(2) (A+A), hoạt (A+A+A+A)(3) tính (*) độ ngọt được tính dựa theo khối lượng phân tử, (1) : heterodimer, (2): homodimer, (3): tetramer. Trong số các protein kể trên, monellin có độ ngọt là 100.000 lần, sau đó là brazzein và thaumatin lần lƣợt là khoảng 500 lần và 3000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít).
Tất cả các protein này đều đƣợc phân lập từ cây sống trong rừng mƣa nhiệt đới. Các protein này có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp để 5 thay thế chất làm ngọt nhân tạo mà ít sinh năng lƣợng và an toàn cho ngƣời sử dụng. Brazzein Brazzein là protein nhỏ nhất thuộc nhóm protein tạo vị ngọt, protein này chứa 54 acid amin. Brazzein rất bền với nhiệt độ và độ pH, có độ ngọt vào khoảng 500-2000 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử) và rất có tiềm năng sử dụng nhƣ chất làm ngọt với năng lƣợng thấp.
Brazzein đƣợc phân lập từ quả Pentadiplandra brazzeana Baillon, một loại cây sống ở Châu Phi. Với đặc tính bền nhiệt và bền với pH của brazzein giúp các nhà khoa học có thể sử dụng brazzein để nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ và độ pH đến hoạt tính tạo cảm giác ngọt của các protein ngọt nói chung (Izawa et al. Thaumatim Thaumatin thuộc nhóm protein tạo vị ngọt đƣợc phân lập từ cây vùng nhiệt đới Thaumatococcus danielli. Thaumatin có 207 acid amin với 8 cầu liên kết disulfide và không chứa cystein tự do.
Khi nhiệt độ trên 70oC và pH 7,0 thì thaumatin có xu hƣớng kết dính lại và mất hoạt tính tạo vị ngọt (Kaneko, Kitabatake 1999). Thaumatin có độ ngọt khoảng 10.000 lần so với sucrose (dựa theo nồng độ mol/lít), protein này đƣợc sử dụng ở nhiều quốc gia theo hƣớng tạo cảm giác ngọt hoặc tăng cƣờng độ ngọt (Zemanek, Wasserman 1995). Monellin Monellin là một protein ngọt chứa 2 chuỗi peptide, chuỗi A có 44 acid amin và chuỗi B chứa 50 acid amin (Ota et al. Protein này đƣợc tinh sạch từ quả cây Dioscoreophyllum cumminsii sống ở Tây Phi.
Độ ngọt của monellin là khoảng 100.000 lần so với đƣờng sucrose và khoảng vài trăm lần dựa theo nồng độ mol/lít và khối lƣợng. Chuỗi đơn của monellin có 94 acid amin đã đƣợc chứng minh là có độ ngọt tƣơng tự nhƣ hai chuỗi monellin trong tự nhiên, dạng chuỗi đơn cũng bền với nhiệt độ và độ acid so với monellin tự nhiên (Lee et al. Các nghiên cứu gần đây cũng xác định các vị trí liên kết của monellin với thụ thể vị giác của ngƣời, 6 các vị trí đó gồm AsnA16, AsnA22, GlnA25 và AsnA26 có hoạt tính tạo cảm giác ngọt lần lƣợt là 7500, 750, 2500 và 5500 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử) (Kohmura et al. Curculin Curculin đƣợc thu nhận từ cây Curculigo latifolia, curculin có hoạt tính nhƣ chất làm ngọt ít sinh năng lƣợng.
Độ ngọt tối đa của curculin tƣơng đƣơng với dung dịch sucrose 0,35 M. Nó có khả năng tạo ra vị ngọt đối với nƣớc và các chất chua sau khi sử dụng curculin. Hoạt tính tạo vị ngọt của curculin không thay đổi sau khi đƣợc xử lý ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ với pH từ 3-9. Mabinlin Mabinlin là một protein ngọt rất bền với nhiệt độ, đƣợc bắt nguồn từ cây Capparis masaikai, có độ ngọt khoảng 400 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử).
Protein này có chứa hai chuỗi, chuỗi A có 33 acid amin và chuỗi B có 72 acid amin, trong chuỗi B có chứa hai liên kết disulfide và chuỗi B liên kết với chuỗi A thông qua ba liên kết disulfide (Kohmura et al. Độ ngọt của mabinlin-2 không thay đổi sau xử lý 48 giờ ở điểm sôi, đối với mabinlin-3 và mabinlin-4 vẫn giữ đƣợc hoạt tính sau khi xử lý ở 80oC trong 1 giờ (Nirasawa et al. Pentadin Pentadin là một loại protein ngọt đƣợc tách chiết từ cây Pentadiplandra brazzeana, đây là một loại cây bụi đƣợc phát hiện ở rừng nhiệt đới của một số quốc gia Châu Phi. Độ ngọt của nó bằng khoảng 500 lần so với sucrose (dựa theo khối lƣợng phân tử), trong phân tử cũng chứa hai tiểu phần liên kết với nhau qua cầu disulfide.
Đến nay cũng chƣa có nhiều thông tin về protein này (van der Wel et al. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin 1. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ 7 Cây thần kỳ (Richadella dulcifica) thuộc họ Hồng xiêm (Sapotaceae) (Matsuyama et al. Đây là loại cây bụi sống ở vùng nhiệt đới Tây Phi.
Trong điều kiện tự nhiên, cây cao khoảng 6 m còn trong điều kiện nhân tạo thì chiều cao khoảng 3 m. Loại cây này sinh trƣởng tốt ở đất có pH từ 4,5-5,8, trong điều kiện lạnh, chịu bóng và ở nơi có độ ẩm tƣơng đối cao. Cây thần kỳ có quả màu đỏ, kích thƣớc quả nhỏ (hình 1.