Luận án tiến sĩ sinh học: Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen

• Tác giả: La Việt Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Đại học Sư phạm Hà Nội 2
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn
• 1.5. Đóng góp mới của luận án
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. PROTEIN NGỌT, PROTEIN TẠO CẢM GIÁC NGỌT VÀ MIRACULIN
• 2.1.1. Protein ngọt và protein tạo cảm giác ngọt
• 2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ và miraculin
• 2.2. TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT
• 2.2.1. Lựa chọn hệ thống biểu hiện
• 2.2.2. Lựa chọn promoter (trình tự khởi đầu phiên mã)
• 2.2.3. Ảnh hưởng terminator đến sự biểu hiện của gen chuyển
• 2.2.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện
• 2.3. NGHIÊN CỨU VỀ CHUYỂN GEN TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ VÀ CÂY CÀ CHUA
• 2.3.1. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)
• 2.3.2. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật
• 2.3.3. Cây cà chua chuyển gen
• 2.4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Vật liệu thực vật
• 2.4.2. Vector và chủng vi khuẩn
• 2.4.3. Hóa chất và thiết bị máy móc
• 2.4.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.5.1. Thay đổi mã di truyền gen miraculin cho phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà
• 2.5.2. Thiết kế mồi
• 2.5.3. Phân lập promoter và terminator
• 2.5.4. Thiết kế vector chuyển gen mang gen miraculin
• 2.5.5. Phương pháp tạo dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây cà chua chuyển gen
• 2.5.6. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen
• 2.5.7. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 2.5.8. Phân tích sự biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen
• 2.5.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. THAY ĐỔI MÃ DI TRUYỀN CỦA GEN MIRACULIN PHÙ HỢP VỚI HỆ BIỂU HIỆN Ở CÂY HỌ CÀ. PHÂN LẬP PROMOTER E8, PROMOTER VÀ TERMINATOR HSP 18
• 3.1.1. Thay đổi mã di truyền của gen miraculin phù hợp với hệ biểu hiện ở cây họ cà
• 3.1.2. Phân lập và tách dòng promoter E8 từ cà chua, promoter và terminator HSP 18
• 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MIRACULIN VÀO DÒNG TẾ BÀO BY2, RỄ TƠ THUỐC LÁ VÀ CÂY CÀ CHUA
• 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/NOS-ter
• 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/35S-pro/Mir/HSP-ter
• 3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/E8-pro/Mir/HSP-ter
• 3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pBI121/HSP-pro/Mir/HSP-ter
• 3.2.5. Biến nạp vector chuyển gen mang gen miraculin vào Agrobacterium
• 3.3. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG TẾ BÀO BY2 VÀ HỆ THỐNG RỄ TƠ THUỐC LÁ
• 3.3.1. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2
• 3.3.2. Biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong rễ tơ thuốc lá
• 3.4. BIỂU HIỆN PROTEIN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY CÀ CHUA
• 3.4.1. Tạo dòng cà chua chuyển gen miraculin
• 3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong các dòng cà chua bằng kỹ thuật PCR
• 3.4.3. Phân tích sự biểu hiện ở mức mRNA của gen miraculin trong một số dòng cà chua chuyển gen
• 3.4.4. Xác định số bản copy trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ thuật Southern
• 3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng của một số dòng cà chua chuyển gen
• 3.4.6. Tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong thực vật
• 3.4.6.1. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ thuốc lá
• 3.4.6.2. Biểu hiện miraculin tái tổ hợp trong cây cà chua chuyển gen
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về protein miraculin và tái tổ hợp

Protein miraculin là một loại protein tạo cảm giác ngọt, được tìm thấy trong quả của cây thần kỳ (Richadella dulcifica). Tái tổ hợp là quá trình tạo ra protein này trong các hệ thống biểu hiện khác nhau như tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen. Nghiên cứu này tập trung vào việc tăng cường sự biểu hiện của protein tái tổ hợp này trong các hệ thống thực vật, nhằm mục đích sản xuất quy mô lớn và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

1.1. Đặc điểm của protein miraculin

Protein miraculin có khả năng biến đổi vị chua thành vị ngọt, mặc dù bản thân nó không có vị ngọt. Điều này làm cho nó trở thành một chất thay thế tiềm năng cho các chất làm ngọt nhân tạo. Protein tái tổ hợp được tạo ra trong các hệ thống biểu hiện như tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen có thể giúp tăng sản lượng và giảm chi phí sản xuất.

1.2. Ứng dụng của protein miraculin

Protein miraculin có tiềm năng lớn trong việc thay thế các chất làm ngọt nhân tạo, giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến đường như béo phì và tiểu đường. Công nghệ sinh học đã mở ra cơ hội để sản xuất protein tái tổ hợp này trong các hệ thống thực vật, đặc biệt là cây cà chua chuyển gen, nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường.

II. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật tái tổ hợp

Nghiên cứu này sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại để tái tổ hợp protein miraculin trong tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen. Các phương pháp bao gồm thay đổi mã di truyền, thiết kế vector chuyển gen, và sử dụng các promoter đặc hiệu để tăng cường sự biểu hiện của protein.

2.1. Thay đổi mã di truyền

Mã di truyền của gen miraculin được thay đổi để phù hợp với hệ thống biểu hiện ở cây họ cà. Điều này giúp tăng hiệu quả biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật.

2.2. Thiết kế vector chuyển gen

Các vector chuyển gen được thiết kế để mang gen miraculin vào tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen. Các promoter đặc hiệu như E8 và HSP được sử dụng để điều khiển sự biểu hiện của gen.

III. Kết quả và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen. Kết quả cho thấy hàm lượng protein tái tổ hợp đạt được cao hơn so với các nghiên cứu trước đây, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

3.1. Biểu hiện trong tế bào BY2

Protein miraculin tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong tế bào BY2 với hàm lượng từ 1,13-3,10 ng/µg protein tan tổng số. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc sản xuất quy mô phòng thí nghiệm.

3.2. Biểu hiện trong cây cà chua chuyển gen

Cây cà chua chuyển gen đã biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp với hàm lượng cao, đạt 118,0 ng/µg protein tan tổng số. Kết quả này cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất thương mại.

IV. Ý nghĩa và đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp cơ sở khoa học cho việc tăng cường sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật mà còn mở ra hướng ứng dụng thực tiễn trong việc sản xuất protein tái tổ hợp quy mô lớn. Công nghệ sinh học đã chứng minh hiệu quả trong việc tạo ra các sản phẩm an toàn và bền vững.

4.1. Ý nghĩa lý luận

Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc tối ưu hóa sự biểu hiện của gen chuyển trong thực vật thông qua việc thay đổi mã di truyền và sử dụng các promoter đặc hiệu.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đã chứng minh khả năng sản xuất protein miraculin tái tổ hợp trong tế bào BY2 và cây cà chua chuyển gen, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và y học.