Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Liệu pháp điều trị nhắm trúng đích phân tử, đặc biệt là các chất ức chế enzym tyrosin-kinase (TKI), đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự hình thành mạch máu mới nuôi dưỡng tế bào ung thư. Pazopanib hydroclorid (tên thương mại: Votrient) là thuốc ức chế đa thụ thể tyrosin-kinase thế hệ mới qua cơ chế ức chế cạnh tranh với adenosin triphosphat (ATP) gắn vào vùng nội bào của thụ thể. Thuốc đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt năm 2009, sau đó được Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA), Cơ quan Quản lý Thuốc và Sản phẩm Y tế Anh (MHRA) và Cơ quan Quản lý Dược phẩm Úc (TGA) cấp phép vào năm 2010 cho các chỉ định: ung thư biểu mô tế bào thận tiến triển (RCC) và sarcoma mô mềm tiến triển (STS) ở bệnh nhân đã qua hóa trị.

Về mặt hóa học, pazopanib được cấu thành từ ba hợp phần vòng thơm chính (indazol, pyrimidin, benzensulfonamid) cùng một nhóm methyl liên kết, trong đó pyrimidin giữ vai trò hợp phần cầu nối. Bất kể theo hướng tiếp cận gắn hợp phần indazol hay gắn hợp phần sulfonamid trước vào dị vòng pyrimidin, trung gian 5-amino-2-methylbenzensulfonamid luôn là mắt xích then chốt trong cấu trúc phân tử pazopanib.

Các quy trình tổng hợp 5-amino-2-methylbenzensulfonamid đã công bố trước đây bộc lộ một số nhược điểm kỹ thuật khi mở rộng quy mô:

  • Quá trình khử và acyl hóa diễn ra qua hai giai đoạn riêng biệt, trong đó amin thơm trung gian rất dễ bị oxy hóa bởi ánh sáng và không khí tạo tạp chất có màu làm giảm hiệu suất;
  • Phản ứng sử dụng dung môi methanol đắt tiền và độc hại;
  • Ở giai đoạn sulfonamid hóa, thao tác nạp liệu phức tạp và phải dùng một lượng lớn aceton để trợ tan chất trung gian clorosulfonyl, gây tốn kém dung môi và làm tan một phần sản phẩm.

Nhằm giải quyết các hạn chế kỹ thuật trên và chủ động nguồn nguyên liệu hoạt chất (API) phục vụ công nghiệp hóa dược trong nước sau khi bằng độc quyền sáng chế hết hạn, đề tài "Nghiên cứu nâng cấp quy mô tổng hợp trung gian sulfonamid trong quy trình điều chế pazopanib" được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu: Tổng hợp được hợp chất trung gian 5-amino-2-methylbenzensulfonamid ở quy mô 100 g/mẻ với hiệu suất ổn định và quy trình thao tác an toàn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Quy trình tổng hợp 3 giai đoạn từ $p$-nitrotoluen qua các chất trung gian $N$-($p$-tolyl)acetamid (chất 3), $N$-(4-methyl-3-sulfamoylphenyl)acetamid (chất 4) và sản phẩm đích 5-amino-2-methylbenzensulfonamid (chất 2).
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội; phối hợp đo phổ tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội).
  • Phạm vi thời gian: Khóa luận hoàn thành và bảo vệ vào tháng 06 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và phản ứng hóa học

Nghiên cứu dựa trên nền tảng hóa dược học và các phản ứng hữu cơ kinh điển:

  1. Phản ứng khử – acyl hóa nitroaren (One-pot): Khử nhóm nitro của $p$-nitrotoluen thành amin thơm, sau đó acyl hóa nucleophil ($A_N$) trực tiếp bằng anhydrid acetic ($\text{Ac}_2\text{O}$) trong cùng một bình phản ứng để tạo $N$-($p$-tolyl)acetamid.
  2. Phản ứng clorosulfo hóa aren: Thế electrophil nhân thơm ($S_E$) bằng tác nhân acid clorosulfonic ($\text{ClSO}_3\text{H}$) tạo dẫn xuất sulfonyl clorid.
  3. Phản ứng sulfonamid hóa: Thế nucleophil ($S_N$) giữa dẫn xuất sulfonyl clorid với dung dịch amoniac ($\text{NH}_3$ 25%) tạo nhóm chức sulfonamid.
  4. Phản ứng thủy phân amid: Thủy phân liên kết amid xúc tác acid vô cơ ($\text{HCl}$ 20%) theo cơ chế cộng nucleophil ($A_N$) để giải phóng nhóm amin tự do.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Tổng hợp hóa học: Khảo sát các thông số kỹ thuật (tác nhân khử, tỷ lệ mol, dung môi, pH trung hòa, phương pháp xử lý nước cái) ở quy mô phòng thí nghiệm 2 g/mẻ, sau đó nâng cấp tuần tự lên quy mô 20 g/mẻ và 100 g/mẻ.
  • Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết:
    • Sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng silicagel $60\text{ F}_{254}$, soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm. Hai hệ dung môi khai triển: Hệ A ($n$-hexan : ethyl acetat = 3:7, tt/tt) và Hệ B ($\text{DCM}$ : methanol = 9:1, tt/tt).
    • Đo khoảng nhiệt độ nóng chảy ($t^\circ_{nc}$) trên thiết bị đo tự động EZ-Melt.
  • Xác định cấu trúc hóa học:
    • Phổ khối lượng (MS): Ghi trên máy LTQ Orbitrap XL theo kỹ thuật ion hóa phun mù điện tử (ESI).
    • Phổ hồng ngoại (IR): Ghi trên máy Shimadzu theo kỹ thuật viên nén $\text{KBr}$ trong vùng 4000–400 $\text{cm}^{-1}$.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ 600 MHz và $^{13}\text{C-NMR}$ 125 MHz): Ghi trên máy Bruker 600 MHz Ascend, dung môi $\text{DMSO-}d_6$, chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về thuốc pazopanib hydroclorid và hợp phần sulfonamid:

  • Cung cấp cấu trúc, tính chất hóa lý, dược lý, chỉ định điều trị RCC, STS, liều dùng tiêu chuẩn (800 mg/ngày) và dược động học của pazopanib.
  • Trình bày đặc điểm hóa lý của hợp phần 5-amino-2-methylbenzensulfonamid ($\text{C}7\text{H}{10}\text{N}_2\text{O}_2\text{S}$, khối lượng phân tử 183,26 đvC/186,23 đvC).
  • Phân tích ưu, nhược điểm của các phương pháp tổng hợp amid từ nitroaren (sử dụng các chất xúc tác/chất khử như $\text{Na}_2\text{SO}_3$, $\text{Pt/Sn}$, $\text{P/I}_2$, $\text{Mn/TMSCl}$, $\text{Ni/Zn}$, $\text{CrCl}_3\text{/Mg}$, $\text{In/AcOH}$, $\text{Pd/silan}$, $\text{Zn/AcOH}$).
  • Tổng quan các cơ chế phản ứng clorosulfo hóa, sulfonamid hóa và các điều kiện thủy phân amid bằng xúc tác acid/kiềm.

Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết điều kiện thực nghiệm:

  • Liệt kê xuất xứ các hóa chất, dung môi (acid clorosulfonic, anhydrid acetic, bột kẽm, $p$-nitrotoluen, isopropanol...) và thiết bị (máy cất quay Buchi R210/R220 Pro, máy khuấy từ gia nhiệt IKA, máy đo EZ-Melt, tủ sấy chân không WiseVen).
  • Thiết lập sơ đồ quy trình tổng hợp 3 giai đoạn từ $p$-nitrotoluen đến 5-amino-2-methylbenzensulfonamid.
  • Trình bày chi tiết các thông số kỹ thuật của các phương pháp phân tích quang phổ (MS, IR, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$) và phương pháp SKLM dùng trong nghiên cứu.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, biện giải cơ chế và thảo luận quá trình phóng đại quy mô:

  • Khảo sát phản ứng tổng hợp chất 3:
    • So sánh phản ứng 2 giai đoạn (hiệu suất 74,0%) với phản ứng one-pot dùng $\text{Na}_2\text{SO}_3$ (hiệu suất 39,6–59,0%, thời gian dài 32–36 giờ) và phản ứng one-pot dùng $\text{Zn/AcOH/Ac}_2\text{O}$ trong isopropanol (IPA) (hiệu suất 93,3%).
    • Khảo sát ảnh hưởng của kim loại khử (Zn: 74,0%; Mg: 55,0%; Sn: 52,3%; Fe: không phản ứng).
    • Khảo sát dung môi (Methanol: 94,22%; IPA: 93,30%; Ethanol 96: 85,13%) và lựa chọn IPA làm dung môi tối ưu do ít độc, giá rẻ.
    • Khảo sát pH trung hòa (pH 4–5: 83,1%; pH 6–7: 93,3%; pH 8–9: 78,4%).
  • Thực nghiệm ở các quy mô: Thực hiện tổng hợp từng giai đoạn ở quy mô 2 g/mẻ, 20 g/mẻ và 100 g/mẻ.
  • Xác định cấu trúc: Phân tích chi tiết các đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ IR, pic ion phân tử trên phổ MS ESI, độ dịch chuyển hóa học ($\delta$), độ bội và hằng số tương tác spin-spin ($J$) trên phổ $^1\text{H-NMR}$ và phổ $^{13}\text{C-NMR}$ của cả 3 chất tổng hợp được.
  • Bàn luận kỹ thuật nâng cấp quy mô: Phân tích hiện tượng tỏa nhiệt, sự tạo phức kim loại kẽm, cơ chế thoát khí độc, kỹ thuật nạp liệu ngược và phương pháp thu hồi sản phẩm từ nước cái.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng theo từng quy mô

Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình tổng hợp 3 bước và ghi nhận các thông số thực nghiệm nhất quán:

Hợp chất Quy mô nguyên liệu Khối lượng thu được (g) Hiệu suất giai đoạn (%) Nhiệt độ nóng chảy ($^\circ\text{C}$) Giá trị $R_f$ (Hệ A / Hệ B)
$N$-($p$-tolyl)acetamid (3) 2,00 g 2,03 93,3 148,0–149,0 0,55 / 0,64
20,00 g 21,00 96,5 147,9–149,1 0,55 / 0,64
100,00 g 105,68 97,2 148,0–149,0 0,55 / 0,64
$N$-(4-methyl-3-sulfamoylphenyl)acetamid (4) 2,00 g 1,92 62,7 243,0–244,5 0,28 / 0,38
20,00 g 21,03 68,7 243,3–244,5 0,28 / 0,38
100,00 g 107,62 70,3 243,2–244,6 0,28 / 0,38
5-amino-2-methylbenzensulfonamid (2) 2,00 g 1,17 71,7 166,0–168,0 0,45 / 0,47
20,00 g 14,10 86,4 166,0–168,0 0,45 / 0,47
100,00 g 70,21 86,1 166,0–168,0 0,45 / 0,47
  • Hiệu suất toàn quy trình ở quy mô 100 g/mẻ: Đạt 58,8% (tính trên 3 giai đoạn từ $p$-nitrotoluen).
  • Khẳng định cấu trúc:
    • Chất 3: MS $m/z = 171,8\ [\text{M+Na}]^+$; IR $\nu_{\max} = 3290\ (\text{N-H}), 1664\ (\text{C=O})\ \text{cm}^{-1}$; $^1\text{H-NMR}$ ($\delta$ 9,81 ppm: H-amid; 7,45 và 7,08 ppm: proton vòng thơm; 2,23 và 2,01 ppm: 2 nhóm $-\text{CH}_3$).
    • Chất 4: MS $m/z = 250,7\ [\text{M+Na}]^+$; IR $\nu_{\max} = 3358, 3169\ (\text{N-H}), 1681\ (\text{C=O}), 1323, 1163\ (\text{SO}_2)\ \text{cm}^{-1}$.
    • Chất 2: MS $m/z = 186,8\ [\text{M+H}]^+$; IR $\nu_{\max} = 3402, 3363, 3294\ (\text{N-H}), 1308, 1147\ (\text{SO}_2)\ \text{cm}^{-1}$; $^1\text{H-NMR}$ ($\delta$ 7,12; 6,96; 6,62 ppm: 3 proton vòng thơm; 7,11 ppm: $-\text{SO}_2\text{NH}_2$; 5,25 ppm: $-\text{NH}_2$ thơm; 2,38 ppm: $-\text{CH}_3$).

Đóng góp cải tiến quy trình so với các nghiên cứu trước

  1. Giai đoạn 1 (Khử – Acyl hóa):
    • Chuyển từ quy trình 2 bước tách rời sang quy trình one-pot, giúp amin tạo ra lập tức được acyl hóa, tránh bị oxy hóa tạo tạp màu bởi ánh sáng và không khí.
    • Thay thế kim loại indium đắt tiền (trong công bố của Kim và cộng sự, 2003) bằng bột kẽm kinh tế; giảm tỷ lệ $\text{Ac}_2\text{O}$ từ 2,5 eq xuống 1,6 eq.
    • Thay thế dung môi độc hại methanol (trong nghiên cứu của Nguyễn Gia Anh Tuấn, 2017) bằng isopropanol (IPA) an toàn và thân thiện hơn với môi trường.
  2. Giai đoạn 2 (Sulfonamid hóa):
    • Loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng lượng lớn dung môi aceton để trợ tan phức sulfonyl clorid trước khi cho vào amoniac, giúp tiết kiệm chi phí dung môi và tránh làm tan hao hụt sản phẩm.
    • Thay đổi thứ tự nạp liệu (cho $\text{ClSO}_3\text{H}$ và $\text{NH}_3$ vào bình trước, làm lạnh sâu rồi mới nạp cơ chất từ từ) kết hợp dùng máy khuấy cơ tốc độ cao (200–300 vòng/phút), kiểm soát phản ứng tỏa nhiệt và tránh thoát khí $\text{SO}_2$ ồ ạt.
  3. Giai đoạn 3 (Thủy phân và thu hồi):
    • Phát hiện và tận dụng lượng sản phẩm kết tinh chậm trong nước cái bằng cách để lạnh qua đêm. Ở quy mô 100 g chất 4, tủa lọc ngay đạt 61,5 g (87,6%) và tủa thu thêm từ nước cái đạt 8,71 g (12,4%), có độ tinh khiết sắc ký đồng nhất với tủa chính.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận trong văn bản

  • Phản ứng clorosulfo hóa vẫn phải sử dụng lượng dư lớn acid clorosulfonic (5,83 eq) và sinh ra hỗn hợp khí acid mạnh, $\text{SO}_2$, gây nguy cơ mất an toàn nếu hệ thống hút khí không đảm bảo.
  • Khi loại bỏ aceton ở giai đoạn sulfonamid hóa, cơ chất và sản phẩm ít tan trong môi trường nước amoniac làm cho hạt sản phẩm bao bọc tiểu phân nguyên liệu, khiến thời gian phản ứng ở quy mô 100 g kéo dài hơn so với quy mô 2 g (kéo dài 3 giờ).
  • Tỷ lệ dung môi IPA ở bước 1 chỉ giảm được tối đa 25% so với quy mô nhỏ; nếu giảm sâu hơn sẽ gây khó khăn cho hệ khuấy do cặn phức kẽm bết dính.

Hướng phát triển tiếp theo

  • Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng, giảm tỷ lệ tác nhân acid clorosulfonic và rút ngắn thời gian ở giai đoạn sulfonamid hóa.
  • Nghiên cứu áp dụng quy trình tổng hợp hợp phần 5-amino-2-methylbenzensulfonamid đã được tối ưu để thực hiện nâng cấp các giai đoạn ghép nối tiếp theo (với indazol và pyrimidin) nhằm điều chế hoàn chỉnh pazopanib hydroclorid ở quy mô lớn.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Hóa dược, Công nghệ Dược phẩm, Hóa hữu cơ; kỹ sư nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các viện nghiên cứu và nhà máy sản xuất nguyên liệu hóa dược.
  • Nội dung giá trị:
    • Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết và các thông số công nghệ (thứ tự nạp liệu, kiểm soát nhiệt độ giải nhiệt, tốc độ cánh khuấy cơ) phục vụ công tác nâng cấp quy mô tổng hợp hữu cơ từ vài gam lên hàng trăm gam.
    • Bộ dữ liệu quang phổ hoàn chỉnh ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, MS, IR) cùng các phân tích độ dịch chuyển hóa học chi tiết của các dẫn xuất tolylacetamid và benzensulfonamid làm chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm và nghiên cứu cấu trúc.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao quy trình one-pot điều chế $N$-($p$-tolyl)acetamid lại chọn dung môi isopropanol (IPA) thay vì methanol hay ethanol?
Khảo sát thực nghiệm cho thấy methanol cho hiệu suất 94,22%, IPA đạt 93,30% và ethanol 96 đạt 85,13%. Mặc dù methanol cho hiệu suất cao hơn không đáng kể (chênh lệch dưới 1%), tác giả chọn IPA vì IPA có giá thành rẻ hơn, độ an toàn cao hơn và ít độc tính hơn đối với người thao tác và môi trường khi nâng cấp lên quy mô lớn.

2. Thứ tự nạp liệu ở giai đoạn clorosulfo hóa quy mô 100 g được điều chỉnh như thế nào để đảm bảo an toàn?
Thay vì cho acid vào cơ chất, quy trình cải tiến nạp acid clorosulfonic vào bình trước, làm lạnh sâu về 10 $^\circ\text{C}$, sau đó mới cho từ từ chất rắn $N$-($p$-tolyl)acetamid vào và khuấy tan. Cách làm này tránh hiện tượng acid bốc khói mất kiểm soát, kiểm soát được quá trình tỏa nhiệt mãnh liệt và hạn chế hao hụt tác nhân.

3. Vì sao nghiên cứu quyết định loại bỏ dung môi aceton trong giai đoạn tạo nhóm sulfonamid ở quy mô 100 g?
Ở quy mô nhỏ, aceton được dùng để hòa tan hoàn toàn chất trung gian sulfonyl clorid. Tuy nhiên, ở quy mô 100 g, việc loại bỏ aceton giúp tiết kiệm chi phí dung môi công nghiệp và tránh hiện tượng aceton hòa tan một phần sản phẩm làm giảm hiệu suất thu hồi. Bù lại, hệ thống sử dụng máy khuấy cơ tốc độ 200 vòng/phút để phân tán trực tiếp tủa vào dung dịch $\text{NH}_3$ 25%.

4. Việc xử lý nước cái sau phản ứng thủy phân giai đoạn cuối đóng góp bao nhiêu vào tổng lượng sản phẩm thu được?
Sau khi trung hòa bằng $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 10% đến pH 8 và lọc tủa ngay, dịch lọc (nước cái) được để lạnh qua đêm để kết tinh chậm. Tại quy mô 100 g chất 4, tủa lọc ngay thu được 61,5 g (chiếm 87,6%), trong khi tủa kết tinh chậm từ nước cái thu thêm được 8,71 g (chiếm 12,4%), nâng tổng khối lượng sản phẩm chất 2 lên 70,21 g (hiệu suất đạt 86,1%).

5. Hiệu suất tổng cộng của toàn bộ quy trình 3 bước ở quy mô 100 g/mẻ là bao nhiêu?
Quy trình đạt hiệu suất 97,2% ở bước 1 (tổng hợp chất 3), 70,3% ở bước 2 (tổng hợp chất 4) và 86,1% ở bước 3 (tổng hợp chất 2). Hiệu suất tổng cộng toàn quá trình 3 giai đoạn xuất phát từ nguyên liệu $p$-nitrotoluen đạt 58,8%.

Kết luận

Khóa luận đã nghiên cứu và nâng cấp thành công quy trình tổng hợp hợp phần trung gian 5-amino-2-methylbenzensulfonamid từ $p$-nitrotoluen ở quy mô 100 g/mẻ qua 3 giai đoạn với hiệu suất toàn bộ đạt 58,8%. Tác giả đã đưa ra các cải tiến công nghệ quan trọng như áp dụng phản ứng one-pot khử – acyl hóa dùng kẽm trong dung môi isopropanol, loại bỏ dung môi aceton ở bước sulfonamid hóa và tối ưu hóa việc thu hồi sản phẩm từ nước cái. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của các chất trung gian cùng sản phẩm đích đều được xác minh rõ ràng thông qua các phương pháp phân tích quang phổ IR, MS, $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$. Quy trình thực nghiệm có tính ổn định cao, tạo cơ sở thực tiễn thuận lợi cho việc nghiên cứu tổng hợp hoàn chỉnh hoạt chất pazopanib hydroclorid ở quy mô công nghiệp.