MỞ ĐẦU Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nƣớc nhập khẩu thuốc nhiều nhất thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần tiêu thụ cao. Dự kiến đến năm 2020, cả nƣớc sẽ cần mỗi năm hơn 1,5 tỷ USD tiền thuốc, trong đó kháng sinh chiếm 30%. Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 của Thủ tƣớng Chính phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020” thì mục tiêu của chƣơng trình là: “Nghiên cứu tạo ra những công nghệ có chất lƣợng cao phù hợp với điều kiện sản xuất ở trong nƣớc, làm chủ và ứng dụng công nghệ hiện đại của nƣớc ngoài, tiến tới chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh trong nƣớc”. Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết.
Vancomyxin là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo ra các loại kháng sinh bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao và chọn lọc. Chất kháng sinh này đƣợc sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Việc nâng cao khả năng sinh kháng sinh vancomyxin của chủng và hạ giá thành sản phẩm là rất cần thiết. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với các nội dung chính nhƣ sau: 1.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S. Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S. Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng và điều kiện lên men chủng S. 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mục tiêu: Nâng cao hoạt tính kháng sinh vancomyxin của xạ khuẩn S. orientalis 4912 hƣớng tới sản xuất kháng sinh này phù hợp với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và điều kiện môi trƣờng khí hậu của Việt Nam. 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN 1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, đƣợc Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S.
orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45]. Ban đầu CKS này đƣợc gọi là hợp chất 05865, nhƣng sau đó đã đƣợc đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ “Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này đƣợc đƣa vào điều trị thử nghiệm trên ngƣời. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đƣa vancomyxin vào sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện.
Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là metixilin đƣợc đƣa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm xuống trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S. auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh glycopeptit đƣợc lựa chọn trong phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra. Lúc đó vancomyxin đƣợc ví nhƣ một loại thần dƣợc hay phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên.
Vancomyxin đã mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này đƣợc dẫn chứng bằng những số liệu cụ thể thì liệu pháp này đƣợc điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22], [28], [36], [56]. Vancomyxin đƣợc sử dụng trong vòng hơn 30 năm mà không có những dẫn chứng đáng kể nào về sự kháng thuốc. Nhƣng sự lạm dụng trong việc dùng vancomyxin đã làm con ngƣời phải đối mặt trƣớc một thực tế là sự xuất hiện và gia tăng ngày càng nhiều của các chủng vi khuẩn kháng lại CKS từng đƣợc xem nhƣ hy vọng cuối cùng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo.
Chủng vi sinh vật kháng vancomyxin đầu tiên đƣợc công bố vào cuối những năm 1980 và sau đó số lƣợng này tăng lên không ngừng. Do sự xuất hiện của những chủng vi sinh 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vật kháng vancomyxin, nhu cầu tìm kiếm các CKS thay thế với mục đích ngăn chặn mối hiểm họa cho sức khỏe cộng đồng luôn luôn đƣợc thúc đẩy. Tuy nhiên, kể từ khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomyxin đã luôn lôi cuốn sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ƣu việt [37], [52], [58].
Dạng vancomyxin HCl đầu tiên đã đƣợc Eli Lilly đƣa ra thị trƣờng dƣới tên thƣơng mại là Vancoxyn. Giấy chứng nhận quyền sử dụng sản phẩm này hết hạn vào đầu những năm 1980. Ngày nay, các dạng thuốc mang đặc tính chung của vancomyxin đƣợc đƣa ra dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau. Năm 2004, Eli Lilly đã đăng ký bản quyền cho Vancoxyn với ViroPharma tại Mỹ, Flynn Pharma tại Anh và Aspen Pharmacare tại Úc [58].
Vancomyxin không những là một loại thuốc kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng rất có hiệu quả, mà còn là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo các loại kháng sinh bán tổng hợp đang rất đƣợc quan tâm. Ngày nay, tầm quan trọng của vancomyxin vẫn đƣợc khẳng định, chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện khi kết hợp với các CKS nhóm - lactam [10], [69]. Cho đến nay, trên thị trƣờng ít nhất đã có 10 biệt dƣợc chứa vancomyxin do nhiều hãng thuốc nổi tiếng trên thế giới sản xuất nhƣ: Diatraxin (Dista, Tây Ban Nha), Hanomyxin (Samjin, Hàn Quốc), Lyphoxyn (Fujisawa, Mỹ), Vancoxyn (Lilly, Mỹ), Vancoxyna (Lilly, Mỹ), Vancoled (Lederle, Mỹ), Vancor (Andria, Mỹ), Vancolin, Vancomyxin (Dakota Pharm, Pháp), Voncon (Lilly, Mỹ) [72]. Đặc tính của vancomyxin Vancomyxin có công thức tổng quát C66H75Cl2N9O24.
Trong phân tử có chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học đƣợc thể hiện ở hình 1. Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên lõi glycol và các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại nhƣ chloro-β- 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64].
Cấu trúc hóa học của vancomyxin [58], [71] Trọng lƣợng phân tử của vancomyxin là 1449,3 Da. Các phân tử vancomyxin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomyxin là một chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính [40]. Vancomyxin ở dạng clohydrat hòa tan rất tốt trong nƣớc, hòa tan vừa phải trong methanol, hòa tan ít trong rƣợu bậc cao, clorofoc, etylaxetat, butylaxetat, axeton và este. Giá trị pKa của vancomyxin là 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7.
Theo những phân tích cơ bản đã chỉ ra rằng phân tử vancomyxin chứa khoảng 1,17% nitơ và 4,26% clo. Vancomyxin bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37oC trong 6 ngày, sau 6 ngày khả năng ức chế vi khuẩn còn 10%. Ở nhiệt độ phòng (khoảng 22oC) độ bền sẽ bị giảm sau 2- 6 ngày. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự phân hủy có thể quan sát đƣợc [4], [40].
CKS này có thể hòa tan trong nƣớc tại pH 7 (khoảng 1 mg/ml) và hòa tan tốt hơn ở pH kiềm (khoảng pH 8,5 – 9,0). Vancomyxin bền ở dạng rắn và trong dịch lỏng tại nhiệt độ lớn hơn 70oC trong khoảng pH từ 2,5-9,0. Nhờ đặc điểm lƣỡng tính, vancomyxin phản ứng với axit vô cơ nhƣ: HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác… [36], [40]. Vancomyxin có 3 hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7,2.
Vancomyxin khác 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com với các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit khác bởi cấu trúc phức tạp. Sự khác biệt này thể hiện trong cấu trúc của vancomyxin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai (nhƣ đƣờng glucoza …) để tạo nên các vancomyxin bán tổng hợp có hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng. Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ KS mới có hoạt tính cao và chọn lọc [34], [58]. Theo “Sổ tay Kháng sinh” của Navashin, S., 1974, 1 mg vancomyxin dạng sunphat chuẩn cần đạt 1007 đơn vị hay một đơn vị vancomyxin dạng sunphat tƣơng đƣơng 0,993 mcg.
Khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng theo chuẩn dƣợc, độ nhạy độc của vancomyxin HCl biểu hiện ở LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) đƣợc tìm thấy trong khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg. Ngƣời ta thƣờng sử dụng vancomyxin khi biết hoặc nghi ngờ về khả năng nhiễm trùng máu, hoặc sử dụng cho các bệnh nhân bị viêm xƣơng, viêm khớp, nhiễm trùng da và mô mềm [4], [10], [56]. Tác dụng của vancomyxin cao hơn khi kết hợp với các CKS khác (ví dụ KS nhóm β-lactam) trong điều trị một số loại vi sinh vật có thể thay đổi cấu trúc thành tế bào để kháng lại vancomyxin [28], [58]. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh vật thông qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào.
Vị trí mà các tác nhân tấn công vào thành tế bào là lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]: - Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các bƣớc sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất.
Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.