ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 9 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Chất oxy hoá còn gọi là gốc tự do, là những phân tử hay hợp tử chất có chứa điện tử độc thân không ghép đôi. Chính do chứa điện tử độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh. Phản ứng oxy hoá thường thấy hàng ngày là phản ứng đốt cháy, còn trong cơ thể phản ứng của chất oxy hoá của gốc tự do êm ái hơn nhưng lại gây huỷ hoại tế bào (đặc biệt ở màng tế bào hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào) phá huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá [28].
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là nhà khoa học đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào [29]. Gốc tự do phá rách màng tế bào khiến cho chất dinh dưỡng bị mất, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết. Gốc tự do còn tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da tạo ra những vết đồi mồi trên cơ thể, và tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzym trong tế bào. Ngoài ra, còn gây đột biến ở gen, ở nhiễm sắc thể, ở DNA, RNA, và làm chất collagen, elastin mất đàn tính khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [29].
Hiện nay, vấn đề tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá và sự cần thiết sử dụng các chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khoẻ cho con người được quan tâm nhiều trong lĩnh vực y khoa. Một số thực phẩm và thực phẩm chức năng có khả năng chống oxy hóa đã được sử dụng. Trong đó có thể kể đến như vitamin E, vitamin C…[29] Với mục đích thiết kế ra những chất chống oxy hóa mới có cấu trúc gần với các cấu trúc tự nhiên flavonoid, đề tài “Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học các dẫn chất flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa” được tiến hành thực hiện. Nhiêm vụ chính của đề tài là: - Phân tích và tập hợp các cấu trúc hóa học của dẫn chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa từ các nguồn tài liệu khoa học đã được công bố trên các tạp chí uy tín trong và ngoài nước.
SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 10 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ - Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ định lượng QSAR giữa cấu trúc hóa học các dẫn chất flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa bằng các phần mềm hóa tin học thích hợp. - Dự đoán hoạt tính chống oxy hóa của các cấu trúc flavonoid hiện có ở thư viện chất Bộ môn Hóa Dược bằng mô hình QSAR xây dựng được. SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 11 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS.
Đỗ Tường Hạ CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 12 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Tổng quan về chất chống oxy hoá 1. Khái niệm Các chất chống oxy hóa là những chất khử mạnh và có hoạt tính với oxy cao hơn dược chất mà nó bảo vệ [4]. Các chất chống oxy hóa là những chất mà khi hiện diện ở nồng độ thấp hơn so với dược chất mà nó bảo vệ có khả năng làm trì hoãn hay làm giảm quá trình oxy hóa của dược chất đó[4].
Trong cơ thể có nhiều hệ thống chống oxy hóa nội sinh có khả năng bảo vệ những chất hóa học từ những phản ứng oxy hóa có hại bằng cách phản ứng với các gốc tự do hay những dạng oxy hoạt động khác, vì vậy ngăn cản tiến trình oxy hóa. Tuy nhiên sự cung cấp các chất chống oxy hóa nội sinh này có giới hạn vì thế cần có nguồn bổ sung chất chống oxy hóa từ bên ngoài vào. Cơ chế tác động của các chất chống oxy hóa[20],[21] Các chất chống oxy hóa đóng vai trò là chất cho hydro đến các gốc tự do để tạo thành các gốc tự do mới bền vững hơn. Cơ chế phản ứng được thu gọn như sau: K1 Chất khởi đầu R° K2 R° + O2 RO°2 K3 RO°2 + RH ROOH + R° K4 RO°2 + RO°2 sản phẩm bền K5 RO°2 + R° sản phẩm bền K6 R° + R° sản phẩm bền Dạng ROOH là dạng bền vững và tạo ra các sản phẩm, phản ứng ngắt mạch là ổn định.
SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 13 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Ngoài cơ chế như trên các chất chống oxy hóa còn có thể tạo phức chelat với ion kim loại (như Fe3+, Cu2+, Ni2+, Mn2+), các ion này thường khơi mào cho phản ứng oxy hóa. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa Phương pháp đánh bắt gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và mô hình β-caroten - acid linoleic được sử dụng để khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid, do các flavonoid khảo sát không hấp thu trong vùng hấp thu của DPPH và beta-caroten. Hai phương pháp này thuận lợi trong nghiên cứu đánh giá mang tính sàng lọc cho lượng mẫu thử lớn.
Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH [18],[3] Phương pháp này dựa vào khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của chất có tác dụng chống oxy hóa. Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm. Mô tả: Dùng 1 ml dung dịch flavonoid (nồng độ 10-4M pha trong methanol) cho vào 2 ml dung dịch DPPH ( nồng độ 10 mg/L pha trong methanol).
Hỗn hợp được lắc đều và để ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu sau 5 phút và 30 phút ở bước sóng 517 nm, mỗi lần đo 3 lần lấy giá trị trung bình. Mẫu đối chiếu được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng flavonoid. Khả năng đánh bắt gốc tự do (S%) được tính như sau: Ast : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 5 phút, 30 phút.
Act : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 5 phút, 30 phút. SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 14 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Phương pháp mô hình beta-caroten - acid linoleic [3] Nguyên tắc: Dựa vào khả năng làm thay đổi màu của hệ nhũ tương beta- caroten và acid linoleic của các chất thử nghiệm. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa càng cao thì khả năng bảo vệ màu beta-caroten càng lớn.
Đo độ hấp thu ở bước sóng 470 nm. Mô tả: Dùng 1 ml beta-caroten (0,2 mg/ml) hòa tan trong cloroform cho vào erlen có chứa 0,02 ml acid linoleic và 0,2 ml tween 20. Bay hơi hết cloroform dưới áp suất giảm. Cho vào hỗn hợp 0,2 ml dung dịch flavonoid thử trong methanol ở nồng độ 10-3M.
Cho vào tiếp 50 ml nước cất (đã bão hòa với oxygen trong vòng 15 phút). Hỗn hợp được lắc đều và để ở 50 oC trong vòng 120 phút. Đo độ hấp thu UV của mẫu thử ở bước sóng 470 nm tại thời điểm 0 phút, 60 phút và 120 phút. Mẫu đối chiếu được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng flavonoid.
Hoạt tính chống oxy hóa (T%) được tính như sau: As0 : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm 0 phút. Ast : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 60 phút, 120 phút Ac0 : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm 0 phút Act : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 60 phút, 120 phút 2 .Tồng quan về flavonoid và hoạt tính chống oxy hoá 2.Flavonoid Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng và được chia làm nhiều nhóm khác nhau. Hầu hết flavonoid có cấu trúc polyphenolic. Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật.
Cho đến nay có khoảng 4000 chất đã được phân lập và xác định cấu trúc. Chỉ riêng hai nhóm hợp SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 15 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ chất flavon và flavonol mang nhóm thế là -OH và/hoặc -OCH3 thì theo lý thuyết số chất tổng hợp được có thể lên tới 38. Các flavonoid là những chất có cấu tạo khung theo kiểu diphenyl propan [C6- C3-C6] [1] hay nói cách khác chúng có cấu tạo khung cơ bản gồm hai vòng benzen A và B nối với nhau qua mạch 3 carbon (Hình 2.
Trong đa số các trường hợp mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C có oxy (Hình 2. Khung cơ bản diphenyl propan (C6-C3-C6) Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C gồm các nhóm chính như sau: ∗ Eu-flavonoid là những chất có gốc aryl ở vị trí 2, gồm có: flavon, flavonol, flavanon, antocyanidin, chalcon… ∗ Isoflavonoid là những hợp chất có gốc aryl ở vị trí 3, gồm có: isoflavon, isoflavonol, isoflavanon. ∗ Neoflavonoid là những hợp chất có gốc aryl ở vị trí 4, gồm có: 4-arylchroman, 4-arylcoumarin, daldergion. Ngoài ra, người ta còn phân biệt biflavonoid, triflavonoid cấu tạo tương ứng bởi 2, 3 monomer flavonoid, và flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan.
Flavonoid có thể tồn tại ở dạng aglycon (chỉ gồm khung cơ bản), hoặc dạng glycosid (gồm khung cơ bản gắn với chất đường ở các vị trí khác nhau). SVTH: Lê Quang Hiển – 071933H 16 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ O O O OH O O O Flavon Flavonol Flavanon O OH O O O O O Isoflavon Isoflavonol Isoflavanon OH O OH O O Antocyanidin Chalcon Dihydrochalcon Hình 2. Cấu trúc khung cơ bản của các flavonoid 2.
Ứng dụng của flavonoid Hiện tại trên thị trường đã có rất nhiều sản phẩm từ flavonoid như các thuốc Daflon, Ginkor Fort, Legalon, các loại thuốc này là các phân đoạn chiết flavonoid từ dược liệu đã cho kết quả tốt trong điều trị các bệnh lý về mạch máu, thần kinh, chống oxy hoá, bảo vệ tế bào gan… Các thực phẩm chức năng như Orthomo flavon – F hay FFLAVIN – 7, Lipo – flavonoid plus, Flavonoid 1000mg (Davinci Laboratories) được dùng hỗ trợ cho các bệnh nhân xơ vữa động mạch, tiểu đường.