Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)

Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu Phyllanthus urinaria l mang lại tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

• Tác giả: Phạm Thị Hồng Loan
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Tâm
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di Truyền Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tái Sinh Đa Chồi In Vitro Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus Urinaria L.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu
• 1.2. Nguồn gốc, phân loại
• 1.3. Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ châu
• 1.4. Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu
• 1.5. Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu
• 1.6. Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu
• 1.7. Quy trình nhân giống in vitro
• 1.8. Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật
• 1.9. Một số nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro
• 1.10. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu trên thế giới
• 1.11. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hoá chất
• 2.2. Vật liệu thực vật. Hóa chất, thiết bị
• 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Pha môi trường nuôi cấy. Khử trùng hạt
• 2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên
• 2.7. Nghiên cứu môi trường tạo rễ
• 2.8. Nghiên cứu giá thể đưa cây ra tự nhiên
• 2.9. Xử lí và tính toán số liệu
• 2.10. Điều kiện thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả khử trùng hạt
• 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên
• 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên
• 3.4. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên
• 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA, BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên
• 3.6. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên
• 3.7. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ mắt chồi bên
• 3.8. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu trong ống nghiệm
• 3.9. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu
• 3.10. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu
• 3.11. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu

Cây diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) là một loại cây dược liệu quý, được biết đến với nhiều tác dụng chữa bệnh. Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro là một phương pháp hiện đại giúp nhân giống cây một cách nhanh chóng và hiệu quả. Việc áp dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu này không chỉ giúp bảo tồn giống cây mà còn nâng cao năng suất và chất lượng dược liệu.

1.1. Giới thiệu về cây diệp hạ châu và giá trị dược liệu

Cây diệp hạ châu có nguồn gốc từ nhiều quốc gia, bao gồm Việt Nam. Nó chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, như phyllathin và hypophyllanthin, có tác dụng bảo vệ gan và điều trị viêm gan B. Việc nghiên cứu cây này giúp phát triển nguồn dược liệu tự nhiên cho y học.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu tái sinh in vitro

Nghiên cứu tái sinh in vitro giúp tạo ra các giống cây mới với đặc tính vượt trội. Phương pháp này cho phép nhân giống nhanh chóng, tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời đảm bảo chất lượng giống cây. Điều này rất quan trọng trong bối cảnh nhu cầu dược liệu ngày càng tăng.

II. Thách thức trong nghiên cứu tái sinh đa chồi cây diệp hạ châu

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu tái sinh đa chồi cây diệp hạ châu cũng gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, chất lượng hạt giống và kỹ thuật nuôi cấy đều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.

2.1. Điều kiện nuôi cấy và ảnh hưởng đến sự phát triển

Điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp tăng tỷ lệ sống sót và phát triển của cây con.

2.2. Chất lượng hạt giống và ảnh hưởng đến kết quả

Chất lượng hạt giống là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá trình tái sinh. Hạt giống kém chất lượng có thể dẫn đến tỷ lệ nảy mầm thấp và cây con yếu, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng dược liệu.

III. Phương pháp nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp nuôi cấy mô hiện đại để tạo ra cây diệp hạ châu. Các chất điều hòa sinh trưởng như cytokinin và auxin được áp dụng để kích thích sự phát sinh chồi.

3.1. Quy trình khử trùng hạt giống

Khử trùng hạt giống là bước đầu tiên quan trọng trong quy trình nuôi cấy. Việc này giúp loại bỏ vi khuẩn và nấm mốc, đảm bảo môi trường sạch cho sự phát triển của cây.

3.2. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng

Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng cytokinin như BAP và auxin như NAA có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh chồi. Sự kết hợp giữa các chất này giúp tối ưu hóa quá trình tái sinh.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi cao và cây con phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy in vitro. Những cây con này có thể được đưa ra ngoài tự nhiên với tỷ lệ sống sót cao.

4.1. Tỷ lệ tái sinh và sự phát triển của cây con

Kết quả cho thấy tỷ lệ tái sinh đạt trên 80%, với cây con phát triển khỏe mạnh. Điều này chứng tỏ rằng phương pháp nuôi cấy in vitro là hiệu quả cho cây diệp hạ châu.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất dược liệu

Cây diệp hạ châu sau khi được tái sinh có thể được sử dụng để sản xuất dược liệu. Việc này không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn có thể xuất khẩu ra thị trường quốc tế.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây diệp hạ châu mở ra nhiều cơ hội cho việc phát triển nguồn dược liệu tự nhiên. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu cây diệp hạ châu

Nghiên cứu cần tiếp tục để phát triển các giống cây mới có năng suất và chất lượng cao hơn. Việc này sẽ giúp đáp ứng nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong y học.

5.2. Định hướng phát triển công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển cây dược liệu. Việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo tồn giống cây.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu 1. Nguồn gốc, phân loại Tên gọi: Tên Việt Nam: Diệp hạ châu Tên khoa học: Phyllanthus urinaria L. Tên khác: Chó đẻ răng cưa, cây Cau trời, Diệp hậu châu, nhật khai dạ bế, Diệp hòe thái, Lão nha châu.

Phân loại: Diệp hạ châu thuộc giới thực vật (Plantae). Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta). Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida). Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ Châu Cây Diệp hạ châu là một loại cỏ mọc hằng năm, cao chừng 30cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành. Lá mọc so le, phiến lá thuôn, dài từ 5 đến 15 mm, rộng từ 2-5 mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới lá trắng xanh, không cuống hay có cuống rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa đực ở đầu cành hoa, cái ở dưới. Hoa có cuống rất ngắn.

Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, có khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh. Đường kính quả có thể đạt tới 2 mm, treo dưới lá (Diệp hạ châu nghĩa là hạt dưới mặt lá). Hạt ba cạnh, hình trứng, màu nâu nhạt, có vân ngang. Mùa hoa: tháng 4 – 6.

Mùa quả: tháng 7 – 9 [32]. Diệp hạ châu phân bố trên các cánh đồng khô, ven đường, vùng đất bỏ hoang, bìa rừng; dưới độ cao 100 – 600m tại Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Nhật Bản, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc (các tỉnh An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hải Nam, Hà Bắc, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Giang Tây, 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Thiểm Tây, Sơn Đông, Sơn Tây, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân Nam, Chiết Giang), Việt Nam và Nam Mỹ [2], [3]. Cây Diệp hạ châu 1. Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu Cách làm đất trồng cây: Cây có thể phát triển trên mọi loại đất, trừ đất trũng, nơi úng ngập.

Tốt nhất là đất pha cát và đặc biệt đất phải đủ ẩm. Có thể trồng riêng rẽ hoặc xen canh trong vườn cây ăn quả chưa khép tán. Diệp hạ châu trồng trên đất pha cát hay đất cát pha và đất bạc màu,được cày bừa kỹ, trừ hết cỏ dại. Nếu đất có pH dưới 5, cần bón lót tới 1 tấn vôi bột/ha.

Để thuận lợi cho việc chăm sóc, đất trồng diệp hạ châu cần lên luống rộng 1-1,5m, cao 20-25cm và rãnh rộng 30cm. Cách chọn hạt giống: 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đảm bảo việc chọn lựa hạt giống chất lượng. Việc lựa chọn hạt giống rất quan trọng vì nó sẽ giúp cây phát triển tốt, chọn giống tốt, thuần chủng thì dược liệu sẽ có năng suất và hiệu quả chữa bệnh cao. Sau 2 tuần gieo hạt: Đất vườn ươm được cày bừa kỹ, vơ hết cỏ, bón lót phân quy ra 1 ha: phân chuồng 30 tấn, phân vi sinh 10 tấn; vôi bột 500kg.

Đất vườn ươm lên luống rộng 1m, cao 20 - 25cm. Lượng hạt giống gieo trong vườn ươm 3g/m2 đất (Nếu gieo thẳng vào luống thì lượng hạt giống là 1g hạt giống/10m2 đất). Trước khi gieo cần xử lý bằng Atonik với tỷ lệ 1 gói Atonik 10g pha với 40 lít nước cho 8 kg hạt giống. Hạt ngâm trong dung dịch này 4 giờ, sau vớt ra để ráo nước, trộn với cát ẩm ủ 3-4 ngày cho đến khi thấy nứt nanh thì đem gieo.

Đề phòng kiến ăn hạt, sau khi gieo cần phun thuốc basudin (theo liều lượng được nhà sản xuất ghi trên bao bì). Gieo vãi đều trên mặt luống, xoa nhẹ mặt luống cho lấp hạt, dùng rơm rạ che phủ rồi tưới nước cho ướt rơm rạ để giữ ẩm cho đất. Sau 10 ngày có thể bỏ vật che phủ. Hạt Diệp hạ châu sẽ mọc sau 5-7 ngày.

Khi câu con có 3-4 lá thật cần tỉa bỏ những cây yếu, chỉ để lại mật độ 2x2 cm/cây. Quá trình chăm sóc cây con ở vườn ươm đơn giản, luôn tưới nước cho đất ẩm, sau 20-25 ngày nhổ đi trồng. Lúc này cây giống cao 10cm, thân mập, có bộ rễ phát triển thì chúng ta tiến hành đánh cây đi trồng ra hốc. - Chăm sóc cây trồng: Để thuận lợi cho việc chăm sóc, đất trồng Diệp hạ châu cần lên luống rộng 1-1,5m, cao 20-25cm và rãnh rộng 30cm.

Khi cây cao 10-15cm thì chúng ta có thể tiến hành trồng ra hốc. Với khoảng cách cây cách cây 20×20cm. Cây trồng xong, tưới nước ngay, sau 3 ngày dùng dung dịch Atonik 0,1% (1 gói 10g pha với 10 lít nước) phun vào luống cho cây mau bén rễ, 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] sau 7 ngày xới đất phá váng lần 1, sau 10 ngày phun dung dịch Atonik lần 2, cây trồng cần làm cỏ và xới đất 1 lần nữa trước khi tán lá giao nhau. Lưu ý: do trồng vào mùa khô nên thường xuyên phải tưới nước.

Thời gian tưới nước tốt nhất là lúc chiều tối hoặc trước 9h sán - Thu hoạch quả: Chọn cành có nhiều quả già. Diệp hạ châu thu hoạch lứa đầu tiên khi 3/4 số cây có hoa quả.Thu hoạch cây: Cắt cây, chừa khoảng 20cm gốc (để các cành ngủ mau tái sinh). - Bảo quản phơi khô: Khi phơi phải trải mỏng, dưới lót tấm vải nhựa để tránh rơi mất hạt, sau 3 ngày phơi nắng trực tiếp hoặc hong gió, quả già sẽ tách vỏ hết. Để kiểm tra độ khô thì ta tiến hành bẻ thân, thấy cây khô giòn là được.

Thu lấy hạt và cành lá rụng để bảo quản. Hạt để làm giống (thu lấy hạt, loại bỏ tạp chất, phơi lại 1-2 nắng cho khô), lá và cành khô làm thuốc. Để hạt khô trong chai, lọ sạch khô kín. Cành và lá diệp hạ châu- cây chó đẻ sau khi thu hạt cho vào túi khô, sạch kín và đây là dược liệu chính phẩm [33].

Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu Các hợp chất có hoạt tính trong Diệp hạ châu là ligan (phyllanthin, hypophyllanthin, nirurin niranthin, phytetralin, niranthine…), flavonoids, amariinn, furosin, amariinn acid, amarulone, triterpenes, sterol, alkaloids… Nirtetralin, niranthin và phyltetralin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trình viêm và sự lan tràn bạch cầu trung tính. Trong vai trò kháng virus viêm gan, niranthin cũng thể hiện hoạt tính chống HBsAg còn henokinin thể hiện hoạt tính chống HBeAg. Ellagitanins garaniin và corilagin được chứng minh là chất trung gian có tiềm năng kháng lại sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào Hela CD4+. Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của Diệp hạ châu có hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất là phyllanthin, amriin, repandusinic acid và phyllanthin D.

Hoạt tính chống ung thư được thử nghiệm trên chuột với hỗn hợp phyllanthin và hypophyllathin (1:1). Phyllanthin được chứng minh vai trò bảo vệ tế bào gan chuột gây đọc với ethanol hoặc CCl4 [21], [30]. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan của chất chiết Diệp hạ châu hoặc những hoạt chất từ Diệp hạ châu. Chirdchupunseree và Pramyothin (2010) chứng minh vai trò của phyllanthin trong việc bảo vệ tế bào gan do đối kháng với những ảnh hưởng gây độc gan của cồn ethanol.

Chất này cũng phục hồi lại khả năng chống oxy hóa của tế bào gan chuột, bao gồm glutathione tổng số, hoạt tính của glutathione tổng số và hoạt tính của glutathione reductase [20], [21]. Theo nghiên cứu của Raphael và Khutan (2003), dịch chiết thân và rễ Diệp hạ châu trong methanol với liều 50, 200 và 1000 mg/kg thể trọng dùng theo đường uống đã ức chế loét dạ dày của chuột Wistar gây bệnh thực nghiệm bằng ethanol tuyệt đối. Các thông số gồm hệ số loét, chảy máu giảm đáng kể khi dùng Diệp hạ châu đắng. Một nghiên cứu khác của Odetola và Akojenu (2000), dịch chiết diệp hạ châu đắng thử nghiệm có khả năng trì hoãn thời gian bắt đầu tiêu chảy, giảm tần số đi phân dẫn đến ức chế nhu động ruột 79,9% so với 86,9% do tác động của morphine được dùng như đối chứng [30].

Theo bài tổng hợp năm 2011, Patel và cộng sự đã tóm lược nhiều kết quả nghiên cứu chứng minh quan trọng cả về cơ bản và ứng dụng của chất chiết Diệp hạ châu hoặc các hoạt chất với nhiều tác dụng khác như chống ung thư, chống sốt rét, lợi tiểu, hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hòa miễn dịch bảo vệ thận. Ngoài ra, bài báo này cũng cho biết rằng sau nhiều năm nghiên cứu, người ta chưa phát hiện ra tác dụng phụ hay độc tính của Diệp hạ châu [30]. Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của Diệp hạ châu đã được tiến hành. Nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y) đã thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus.

Nhóm nghiên cứu của Trần Danh Việt, Nguyễn Thượng Dong (Viện Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001) [31]. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của Diệp hạ châu. Song các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào chiết xuất các chất có dược tính và ứng dụng trong điều trị bệnh. Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu Tác dụng chữa viêm gan siêu vi B, cách làm: 30g cây Diệp hạ châu,12g nhân trần,12g sài hồ,8g chi từ,12g hạ khô tảo.Tất cả sấy khô dùng để sắc lấy nước uống ngày 1 tháng.

Chữa viêm gan do virus: Diệp hạ châu sao khô 20 g, sắc nước 3 lần. Trộn chung các nước sắc, thêm 50g đường đun sôi cho tan, chia làm 4 lần uống trong ngày. Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc. Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Cây Diệp hạ châu sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g.

Sắc nước uống hằng ngày. Chữa nhọt độc sưng đau: Dùng một nắm cây Diệp hạ châu với một ít muối giã nhỏ, chế nước chín vào, vắt lấy nước cốt uống, dùng bã đắp chỗ đau. Chữa bị thương ứ máu: Dùng lá, cành Diệp hạ châu và Mần tưới, mỗi thứ một nắm, giã nhỏ chế nước đồng tiện vào, vắt lấy nước uống, bã thì đắp hoặc hòa thêm bột Ðại hoàng 8-12g càng tốt (Hoạt nhân toát yếu). Chữa xơ gan cổ trướng: Cây Diệp hạ châu sao khô 100g sắc nước 3 lần.

Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30 – 40 ngày. Khẩu phần hằng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ). Chữa ăn không ngon miệng, đau bụng, sốt, nước tiểu màu sẫm: Dùng cây Diệp hạ châu 1g, nhọ nồi 2g, xuyên tâm liên 1g.