Luận văn nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn trâu tại tỉnh tuyên quang

Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và phát triển kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở trâu tại Tuyên Quang, hỗ trợ phòng ngừa hiệu quả.

• Tác giả: Phạm Thị Trang
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Kim Lan
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật
• 1.1.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
• 1.1.3. Phương thức truyền lây tiên mao trùng
• 1.1.4. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 1.1.5. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh
• 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả
• 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt
• 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ
• 3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.3. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1
• 3.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T.
• 3.5. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến ở nhiều loài gia súc, đặc biệt là trâu. Tại tỉnh Tuyên Quang, bệnh này gây ra thiệt hại lớn cho người chăn nuôi do tỷ lệ nhiễm trùng cao và khó phát hiện. Theo nghiên cứu, Trypanosoma evansi là tác nhân chính gây bệnh, lây truyền qua các loài ruồi hút máu. Việc phát hiện và điều trị kịp thời là rất cần thiết để giảm thiểu thiệt hại. Do đó, nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán là một yêu cầu cấp thiết nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của đề tài là xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang và chế tạo kit chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng quy trình chẩn đoán và điều trị bệnh, từ đó nâng cao sức khỏe cho đàn gia súc và cải thiện đời sống cho người chăn nuôi.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin về tỷ lệ nhiễm và các biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng. Việc chế tạo kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp sẽ giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác, từ đó giảm thiểu thiệt hại cho người chăn nuôi. Hơn nữa, nghiên cứu này còn khẳng định khả năng làm chủ công nghệ trong sản xuất kit chẩn đoán, góp phần vào sự phát triển của ngành thú y tại Việt Nam.

IV. Tình hình nhiễm tiên mao trùng

Tình hình nhiễm tiên mao trùng ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang cho thấy tỷ lệ nhiễm cao, đặc biệt trong mùa mưa khi côn trùng phát triển mạnh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm có sự khác biệt theo lứa tuổi và mùa vụ. Các triệu chứng lâm sàng như sốt cao, gầy yếu, và viêm kết mạc thường gặp ở những con bị nhiễm. Việc xác định tỷ lệ nhiễm và các yếu tố ảnh hưởng là rất quan trọng để xây dựng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

V. Chế tạo kit chẩn đoán

Quá trình chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng được thực hiện dựa trên công nghệ sinh học hiện đại. Kit CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) được phát triển từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2, cho phép phát hiện kháng thể kháng Trypanosoma evansi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả thử nghiệm cho thấy kit này có thể áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh, giúp người chăn nuôi phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) do đơn bào ký sinh trong máu Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra là một trong những rào cản dịch tễ học và kinh tế nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi đại gia súc tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực trung du miền núi phía Bắc như tỉnh Tuyên Quang, phương thức chăn thả quảng canh xen kẽ đồi rừng cùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa tạo điều kiện tối ưu cho các loài côn trùng môi giới hút máu thuộc bộ Hai cánh (Diptera) bùng phát. Gia súc mắc bệnh thường chuyển sang thể mạn tính với triệu chứng lâm sàng tiềm ẩn, gây suy giảm miễn dịch, thiếu máu, suy nhược, sảy thai và đột tử hàng loạt trong vụ Đông - Xuân khi gặp điều kiện rét đậm rét hại kết hợp thiếu hụt dinh dưỡng.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cấp bách trong kiểm soát dịch bệnh bắt nguồn từ sự thiếu hụt các công cụ chẩn đoán nhanh tại thực địa sở hữu độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Các phương pháp soi tươi trực tiếp hoặc nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô có độ nhạy rất thấp (chỉ đạt dưới 25-30% khi mật độ ký sinh trùng huyết thấp), phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng tốn nhiều thời gian (thường mất 5-14 ngày), trong khi kỹ thuật ELISA hay PCR đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm chuyên sâu, chi phí đắt đỏ và không thể áp dụng trực tiếp tại các nông hộ miền núi (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2015; Desquesnes et al., 2013). Hơn nữa, tính đa dạng kháng nguyên bề mặt biến đổi (Variant Surface Glycoproteins - VSG) của T. evansi khiến việc tạo kháng nguyên chẩn đoán chuẩn hóa gặp vô vàn thách thức. Nghiên cứu của NCS. Phạm Thị Trang (2017) đã giải quyết triệt để khoảng trống này bằng giải pháp công nghệ sinh học phân tử tiên phong: tái tổ hợp kháng nguyên bề mặt ổn định RoTAT 1.2 để chế tạo bộ sinh phẩm ngưng kết nhanh trên bản nhựa (Kit CATT - Card Agglutination Test for Trypanosomiasis).

Câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu của luận án được xác định rõ ràng:

1. RQ1: Tỷ lệ nhiễm, đặc điểm dịch tễ phân bố theo địa bàn, lứa tuổi, tính biệt, mùa vụ và danh tính phân tử của loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu tại 4 huyện trọng điểm của tỉnh Tuyên Quang là gì?
   • H1: Tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu có sự khác biệt có ý nghĩa dịch tễ học theo mùa (cao điểm mùa mưa gắn với mật độ côn trùng) và lứa tuổi cày kéo; loài gây bệnh đặc hiệu là Trypanosoma evansi thuộc phân chi Trypanozoon.
2. RQ2: Quy trình tách dòng, biểu hiện và tinh sạch protein kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 trong hệ thống Escherichia coli có đạt độ tinh sạch và hoạt tính miễn dịch chuẩn để chế tạo Kit CATT chẩn đoán nhanh hay không?
   • H2: Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 biểu hiện trong vector pET22b/tế bào chủ E. coli BL21 có khả năng nhận diện đặc hiệu kháng thể kháng T. evansi với độ nhạy và độ đặc hiệu trên 95%, tương đương kỹ thuật ELISA và tiêm truyền chuột.
3. RQ3: Phác đồ điều trị kết hợp giữa hóa dược đặc hiệu và liệu pháp nâng đỡ thể trạng nào mang lại hiệu quả tuyệt đối trên đàn trâu mắc bệnh tại thực địa?
   • H3: Phác đồ phối hợp Isometamidium chloride hydrochloride (Trypamidium samorin) liều 1,0 mg/kg thể trọng (TT) cùng trợ tim, trợ sức giải quyết triệt để mầm bệnh với tỷ lệ khỏi đạt 100%.

Khung lý thuyết của công trình dựa trên Thuyết Biến đổi kháng nguyên bề mặt (Antigenic Variation Theory của Pays et al., 2011; Vickerman, 1985) và Mô hình Chọn lọc Epitope tái tổ hợp chẩn đoán miễn dịch (Recombinant Immuno-diagnostic Model của Urakawa et al., 2001). Quy mô nghiên cứu bao quát 4 huyện (Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa) với hàng ngàn mẫu máu và huyết thanh trâu, thực hiện liên tục trong giai đoạn 2013 - 2017, mang lại ý nghĩa đột phá trong việc nội địa hóa công nghệ sản xuất kit chẩn đoán thú y giá thành thấp tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế và trong nước về dịch tễ và chẩn đoán Trypanosoma evansi phản ánh bức tranh phức tạp giữa cơ chế trốn thoát miễn dịch của ký sinh trùng và sự phát triển của công nghệ sinh học chẩn đoán:

[Tiến trình chẩn đoán T. evansi]
1. Phương pháp Cổ điển (Soi tươi / Giemsa / Tiêm chuột)
2. Kỹ thuật Miễn dịch / Phân tử (ELISA / PCR 18S rRNA)
3. Luận án Phạm Thị Trang (2017): Kháng nguyên Tái tổ hợp RoTAT 1.2 & Kit CATT

Về mặt dịch tễ học và vật môi giới truyền lây, Phan Văn Chinh (2006) và Bùi Quý Huy (2006) chỉ ra rằng ruồi hút máu Stomoxys calcitrans (chiếm 45,25%) và các loài mòng Tabanus rubidus (32,59%), Tabanus kiangsuensis (22,15%) là vector truyền lây cơ học nguy hiểm nhất. Dịch bệnh bùng phát mạnh từ tháng 4 đến tháng 9, trùng với chu kỳ sinh trưởng của côn trùng cánh màng (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2014).

Trong y văn tồn tại cuộc tranh luận lớn giữa hai trường phái:

• Trường phái kháng nguyên toàn phần (Whole Cell Lysate - WCL): Nhóm tác giả như Lê Ngọc Mỹ (1994, 2002) hay Laha et al. (2008) chủ trương dùng kháng nguyên ly giải toàn phần phân lập từ máu động vật thí nghiệm. Tuy nhiên, nhược điểm là kháng nguyên WCL chứa hơn 30 phân đoạn protein (25 - 85 kDa), dễ gây phản ứng chéo nghiêm trọng với các loài đơn bào khác (Babesia, Theileria, Anaplasma) và quy trình nuôi cấy trên chuột gây tốn kém, phụ thuộc mẫu sống.
• Trường phái kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu (Recombinant Antigens): Urakawa et al. (2001), Verloo et al. (2001) và Phạm Thị Tâm và cs. (2013) khẳng định rằng hầu hết các VSG của T. evansi liên tục chuyển đổi biểu hiện gen (expression sites switching), né tránh kháng thể vật chủ. Duy nhất epitope RoTAT 1.2 (Rode Trypanozoon Antigen Type 1.2) là kháng nguyên bề mặt không đổi, hiện diện phổ biến ở hầu hết các chủng T. evansi trên toàn cầu.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế:

• Tại Kenya, Ngaira et al. (2004) khi đánh giá kit CATT tự nhiên trên đàn lạc đà chỉ đạt độ nhạy 68,6% và Suratex đạt 58,8%. Tương tự, Njiru et al. (2004) tại miền đông châu Phi ghi nhận CATT phát hiện 45,9% ca nhiễm so với 26,6% của PCR và 5,3% của phương pháp ly tâm Microhematocrit (MHCT).
• Tại Ấn Độ, Singh et al. (2004) và Pathak et al. (2013) so sánh các kỹ thuật trên trâu bò cho thấy ELISA kháng nguyên và PCR đạt độ nhạy cao nhưng chi phí vượt quá khả năng ứng dụng đại trà tại các trại chăn nuôi nhỏ lẻ.
• Tại Đông Nam Á, Rogé et al. (2014) và Tehseen et al. (2015) chứng minh việc biểu hiện RoTAT 1.2 tái tổ hợp (rRoTAT 1.2) giúp nâng độ đặc hiệu lên 98,3% và loại bỏ hoàn toàn hiện tượng dương tính giả.

Luận án của NCS. Phạm Thị Trang đã định vị chính xác khoảng trống khoa học này: không chỉ dừng lại ở khảo sát dịch tễ học thuần túy bằng PCR giải trình tự gen 18S rRNA mà đã tự chủ hoàn toàn quy trình công nghệ chế tạo Kit CATT từ rRoTAT 1.2 gắn hạt latex màu, tối ưu hóa điều kiện phản ứng trực tiếp cho đàn trâu Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng sâu sắc Thuyết Biến đổi Kháng nguyên (Antigenic Variation Theory) của Vickerman (1985) và Pays et al. (2011) trong phân họ Kinetoplastida. Bằng chứng thực nghiệm khẳng định dù T. evansi có kho gen VSG khổng lồ trải qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination) để thay thế điểm biểu hiện nhằm lẩn tránh miễn dịch vật chủ, gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 vẫn duy trì tính bảo tồn tuyệt đối ở cấp độ phân tử tại các chủng thực địa tỉnh Tuyên Quang.

Mô hình lý thuyết tương tác ký sinh trùng - vật chủ được xác lập qua chuỗi luận điểm:

1. Mệnh đề P1: Trâu nhiễm T. evansi kích hoạt đáp ứng miễn dịch dịch thể sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng RoTAT 1.2 ngay từ giai đoạn đầu (ngày 10-14) và duy trì hiệu giá kháng thể cao kéo dài trong huyết thanh.
2. Mệnh đề P2: Phức hợp kháng nguyên tái tổ hợp rRoTAT 1.2 cố định hóa trên bề mặt vi hạt polystyrene (latex) sở hữu ái lực liên kết chéo đa hóa trị cực mạnh với kháng thể tự nhiên trong huyết thanh trâu nhiễm bệnh, tạo mạng lưới ngưng kết đại phân tử nhìn thấy bằng mắt thường mà không bị nhiễu bởi các kháng thể ký sinh trùng đường máu khác.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành 3 trục lý thuyết: Lý thuyết Dịch tễ học Thú y (Veterinary Epidemiology), Sinh học phân tử Tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA Technology), và Miễn dịch học Chẩn đoán Hạt keo (Colloid Immuno-diagnostic Assay). Cách tiếp cận này vượt qua giới hạn của các phương pháp phân lập truyền thống nhờ các điều kiện biên (boundary conditions) được kiểm soát nghiêm ngặt:

• Phân đoạn gen mã hóa RoTAT 1.2 được tối ưu hóa biểu hiện không chứa vùng kỵ nước xuyên màng nhằm tránh tạo thể vùi (inclusion bodies) khó tái cuộn gập.
• Nồng độ kháng nguyên phủ hạt latex và tỷ lệ chất hoạt động bề mặt được chuẩn hóa để loại trừ hiện tượng kết tụ tự phát (auto-agglutination).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái thực chứng nghiêm ngặt (Positivism Paradigm), kết hợp đa phương pháp (Mixed-methods Design) đan xen giữa dịch tễ học thực địa cắt ngang (cross-sectional epidemiological study), sinh học phân tử phòng thí nghiệm (in vitro/in silico), mô hình động vật thí nghiệm (in vivo trên chuột nhắt trắng 18-20g và thỏ 2-2,5kg) và thử nghiệm lâm sàng can thiệp có đối chứng (controlled clinical trials).

Cỡ mẫu và địa bàn nghiên cứu:

• Thu thập mẫu máu và huyết thanh trâu tại 4 huyện trọng điểm: Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên và Chiêm Hóa. Tổng số hàng ngàn mẫu đại diện được phân tầng theo 3 nhóm tuổi (<2 năm tuổi, 2-3 năm tuổi, >3 năm tuổi), theo tính biệt (đực, cái) và theo 4 mùa trong năm (Xuân, Hạ, Thu, Đông).
• Tiêu chí lựa chọn: Trâu nuôi tại các hộ nông dân vùng đồi núi, có hoặc không có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ (sốt ngắt quãng, gầy yếu, phù nề vùng thấp, niêm mạc nhợt nhạt, chảy nước mắt). Tiêu chí loại trừ: Trâu đã được điều trị bằng các hóa dược trị tiên mao trùng trong vòng 6 tháng trước thời điểm lấy mẫu.

Quy trình nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình nghiên cứu trải qua các bước chuẩn hóa với độ tin cậy và giá trị nội tại (internal validity) cao:

1. Phân tích phân tử xác định loài: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen 18S rRNA của Trypanosoma spp. từ các mẫu phân lập (ký hiệu: Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN). Sản phẩm PCR được tinh sạch, tạo dòng vào vector pJET1.2/blunt, chuyển nạp vào E. coli DH5α-T, kiểm tra cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và giải trình tự nucleotide tự động.
2. Kỹ thuật tách dòng và biểu hiện kháng nguyên rRoTAT 1.2: Khuếch đại đoạn gen đích RoTAT 1.2, xử lý bằng enzyme Klenow cắt đầu bằng, ghép nối định hướng vào vector biểu hiện pET22b bằng hai enzyme giới hạn EcoRI và SalI. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT 1.2 vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3).
3. Tối ưu hóa sinh tổng hợp và tinh sạch: Khảo sát các thông số nuôi cấy biểu hiện protein: nồng độ chất cảm ứng IPTG (0,2 - 1,0 mM), mật độ quang tế bào cảm ứng ($OD_{600}$ từ 0,6 đến 1,0), nhiệt độ nuôi cấy (25°C, 30°C, 37°C), thời gian cảm ứng (2h, 4h, 6h, 8h) và pH môi trường LB. Kiểm tra phân đoạn protein tái tổ hợp bằng điện di gel polyacrylamide Tricine-SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch Western blot với huyết thanh kháng chuẩn mang kháng thể đa dòng và đơn dòng.
4. Quy trình chế tạo Kit CATT: Tối ưu hóa nồng độ protein rRoTAT 1.2, mật độ hạt vi cầu latex polystyrene, nhiệt độ và thời gian gắn kết phức hợp kháng nguyên - hạt latex. Bổ sung chất nhuộm màu Coomassie Brilliant Blue (CBB), chất ức chế protease Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), chất ổn định protein và chất bảo quản diệt khuẩn sodium azide ($NaN_3$). Đánh giá thời gian bảo quản, độ bền nhiệt độ ở 4°C và nhiệt độ phòng.

Dữ liệu và phân tích thống kê

Dữ liệu dịch tễ học và thử nghiệm chẩn đoán được quản lý và xử lý bằng phần mềm thống kê chuyên dụng (SPSS / Minitab / Excel). Sử dụng kiểm định Chi-bình phương ($\chi^2$) và Fisher's Exact Test để so sánh tỷ lệ nhiễm giữa các nhóm lứa tuổi, giới tính, vùng địa lý và mùa vụ (với mức ý nghĩa $p < 0,05$ và $p < 0,01$). Sử dụng phần mềm BioEdit, ClustalW và MEGA để căn chỉnh chuỗi (sequence alignment), xây dựng cây phả hệ phát sinh loài (phylogenetic tree) bằng phương pháp Neighbor-Joining với 1.000 lần lặp bootstrap. Độ nhạy (Sensitivity - Se), độ đặc hiệu (Specificity - Sp), giá trị dự báo dương tính (PPV), giá trị dự báo âm tính (NPV) và chỉ số đồng thuận Kappa ($\kappa$) của Kit CATT được đối chiếu song song với tiêu chuẩn vàng là phản ứng ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Luận án đã công bố những phát hiện định lượng và thực nghiệm mang tính bước ngoặt:

Thứ nhất, bức tranh dịch tễ học toàn diện về bệnh tiên mao trùng tại Tuyên Quang: Tỷ lệ nhiễm T. evansi trung bình trên đàn trâu tại 4 huyện khảo sát dao động từ 15% đến trên 28% tùy thuộc vào phương pháp xét nghiệm. Tỷ lệ nhiễm ghi nhận biến động rõ rệt theo mùa: cao nhất vào vụ Hè - Thu (tháng 5 đến tháng 9, đạt đỉnh điểm trên 25-30% do mật độ ruồi Stomoxys và mòng Tabanus tăng vọt) và giảm trong vụ Đông - Xuân. Về lứa tuổi, trâu trưởng thành trong độ tuổi cày kéo (>3 năm tuổi) có tỷ lệ nhiễm cao nhất ($p < 0,01$) do tần suất làm việc ngoài đồng bãi và tiếp xúc với côn trùng hút máu cao hơn hẳn nhóm nghé non dưới 2 năm tuổi. Sự khác biệt theo tính biệt không có ý nghĩa thống kê ($p > 0,05$).

Thứ hai, xác thực phân tử các chủng phân lập: Trình tự gen 18S rRNA của 4 mẫu phân lập đại diện cho 4 huyện (Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN) có độ tương đồng 99,8 - 100% với các chuỗi Trypanosoma evansi công bố trên Ngân hàng Gen thế giới (NCBI GenBank) từ Philippines, Thái Lan, Ai Cập và Nam Mỹ, khẳng định tính đồng nhất di truyền cao của loài gây bệnh tại miền Bắc Việt Nam.

Thứ ba, làm chủ quy trình công nghệ sinh học biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2: Tách dòng thành công đoạn gen RoTAT 1.2 kích thước chuẩn (~205 bp) vào vector pET22b và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp hòa tan trong E. coli BL21 với hiệu suất cao ở điều kiện tối ưu: cảm ứng bằng 0,6-0,8 mM IPTG tại $OD_{600} \approx 0,8$, nhiệt độ 30°C trong 6 giờ. Điện di Tricine-SDS-PAGE và Western blot khẳng định protein tái tổ hợp phản ứng đặc hiệu tuyệt đối với kháng thể kháng T. evansi, không bắt chéo với các mẫu huyết thanh trâu khỏe hoặc nhiễm ký sinh trùng khác.

Thứ tư, hiệu quả vượt trội của Kit CATT chế tạo: Thử nghiệm so sánh chẩn đoán trên hàng trăm mẫu huyết thanh trâu thực địa cho thấy Kit CATT rRoTAT 1.2 đạt độ tương đồng đồng dương tính lên tới 98,24% so với phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng và tương đương 100% so với kỹ thuật ELISA tiêu chuẩn. Phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, xuất hiện các hạt ngưng kết màu xanh lam đậm rõ rệt trong vòng 3-5 phút ở nhiệt độ phòng, không cần thiết bị đo quang học.

Thứ năm, phác đồ điều trị đặc hiệu đạt hiệu lực 100%: Thử nghiệm diện hẹp và diện rộng khẳng định việc sử dụng thuốc Isometamidium chloride hydrochloride (Trypamidium samorin) liều 1,0 mg/kg TT (tiêm sâu bắp thịt kết hợp chia nhiều vị trí tiêm), phối hợp với tiêm Cafein natri benzoat 20% trợ tim trước 30-45 phút và truyền tĩnh mạch nước muối sinh lý 0,9%, Vitamin C 5%, Vitamin B1 2,5% giúp trâu sạch hoàn toàn tiên mao trùng trong máu sau 24-48 giờ, phục hồi thể trạng nhanh chóng và đạt tỷ lệ khỏi bệnh 100% tuyệt đối an toàn, không có hiện tượng tái nhiễm sau 60 ngày theo dõi.

Implications đa chiều

• Lý thuyết: Bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền học phân tử của phân chi Trypanozoon tại khu vực Đông Nam Á vào hệ thống dữ liệu NCBI toàn cầu.
• Phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình biểu hiện protein màng tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch cao trên hệ thống prokaryote chi phí thấp, mở ra hướng ứng dụng cho chẩn đoán các bệnh ký sinh trùng đường máu khác như Babesia bovis hay Anaplasma marginale.
• Thực tiễn chăn nuôi: Giúp thú y cơ sở phát hiện sớm trâu mang mầm bệnh thể ẩn ngay tại chuồng nuôi, ngăn ngừa hiện tượng trâu ngã chết đột ngột trong vụ Đông - Xuân.
• Chính sách: Cung cấp luận cứ khoa học để Cục Thú y và Chi cục Chăn nuôi & Thú y các tỉnh miền núi xây dựng Thông tư, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về kiểm soát và thanh toán bệnh tiên mao trùng đại gia súc.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những thành tựu mang tính đột phá, luận án thẳng thắn chỉ ra các giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn về phạm vi địa lý và vật chủ: Nghiên cứu mới tập trung chủ yếu trên đàn trâu tại 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang. Mặc dù T. evansi có phổ ký chủ rất rộng (bò, ngựa, dê, chó, lạc đà), các đánh giá chuyên sâu trên các loài gia súc khác tại các vùng sinh thái Tây Bắc, Tây Nguyên và Tây Nam Bộ chưa được thực hiện đầy đủ.
2. Hiện tượng chủng không mang gen RoTAT 1.2 (RoTAT 1.2-negative strains): Y văn quốc tế ghi nhận một số ít phân lập T. evansi tại châu Phi (Kenya, Sudan, Ethiopia) bị đột biến mất đoạn gen RoTAT 1.2 (Abou El Naga et al., 2012). Dù chưa phát hiện biến thể này tại Việt Nam, Kit CATT RoTAT 1.2 có thể có nguy cơ âm tính giả nếu các chủng ngoại lai xâm nhập.
3. Đặc tính miễn dịch học sau điều trị: Kháng thể kháng T. evansi có thể tồn tại dai dẳng trong máu trâu từ 3 đến 6 tháng sau khi con vật đã được điều trị khỏi hoàn toàn bằng Trypamidium (hiện tượng huyết thanh dương tính giả do kháng thể tồn dư, không phải do nhiễm trùng hoạt tính).

Chương trình nghiên cứu 5 - 10 năm tiếp theo được đề xuất:

• Mở rộng ứng dụng công nghệ Dual-Antigen kết hợp RoTAT 1.2 với các kháng nguyên ổn định khác như ISG 75 hoặc TeGM6-4r nhằm chế tạo bộ kit multiplex ngăn ngừa bỏ sót các biến chủng đột biến.
• Phát triển que thử sắc ký miễn dịch nhanh dạng dòng chảy bên (Lateral Flow Immunochromatographic Strip - Rapid Test) từ kháng nguyên tái tổ hợp rRoTAT 1.2 để người chăn nuôi có thể tự kiểm tra bằng một giọt máu mao mạch tai mà không cần thao tác ly tâm tách huyết thanh.
• Nghiên cứu cơ chế kháng thuốc của T. evansi đối với Diminazene aceturate và Isometamidium chloride ở cấp độ giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing).

Tác động và ảnh hưởng

Công trình của NCS. Phạm Thị Trang tạo ra chuỗi giá trị tác động sâu rộng:

• Học thuật: Dự kiến thu hút hàng chục lượt trích dẫn trong các tạp chí chuyên ngành ký sinh trùng học thú y (Veterinary Parasitology, Acta Tropica, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y). Thiết lập cầu nối nghiên cứu giữa Đại học Thái Nguyên, Viện Đại học Mở Hà Nội và các trung tâm nghiên cứu thú y quốc tế.
• Ngành công nghiệp sinh học thú y: Chứng minh khả năng tự chủ công nghệ sản xuất sinh phẩm chẩn đoán thú y công nghệ cao "Made in Vietnam", giúp giảm giá thành bộ kit chẩn đoán xuống chỉ bằng 20-30% so với kit CATT nhập khẩu từ Viện Y học Nhiệt đới Antwerp (Bỉ), tiết kiệm hàng tỷ đồng ngân sách quốc gia.
• Kinh tế - Xã hội: Bảo vệ đàn trâu 113.880 con của tỉnh Tuyên Quang và hàng triệu con trâu bò vùng trung du miền núi phía Bắc, giữ vững tư liệu sản xuất và sức cày kéo huyết mạch cho đồng bào các dân tộc thiểu số (Tày, Dao, Sán Chay, Mông, Nùng), góp phần xóa đói giảm nghèo bền vững và củng cố an sinh xã hội nông thôn.

Đối tượng hưởng lợi

1. Nghiên cứu sinh và Giảng viên chuyên ngành Ký sinh trùng: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từ tạo dòng phân tử, tinh sạch protein dung giải đến gắn vi hạt latex chẩn đoán.
2. Cán bộ thú y vùng cao và Trạm Thú y huyện: Sở hữu công cụ chẩn đoán nhanh tại thực địa cho kết quả sau 5 phút mà không cần phòng xét nghiệm phức tạp.
3. Doanh nghiệp sản xuất kit thú y: Nhận chuyển giao công nghệ làm chủ vector tái tổ hợp pET22b-RoTAT 1.2 để thương mại hóa quy mô công nghiệp.
4. Cơ quan hoạch định chính sách nông nghiệp: Sở Nông nghiệp & PTNT có căn cứ dữ liệu xác thực để phân bổ ngân sách phòng chống dịch bệnh định kỳ vào tháng 4 và tháng 8 hàng năm.
5. Người chăn nuôi đại gia súc: Giảm thiểu tối đa tỷ lệ trâu chết rét trong mùa đông do suy kiệt tiên mao trùng mạn tính, nâng cao giá trị đàn gia súc.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của công trình là gì và mở rộng học thuyết nào? Công trình đã mở rộng Thuyết Biến đổi Kháng nguyên Bề mặt (Antigenic Variation Theory) của Vickerman và Pays trong bối cảnh các chủng Trypanosoma evansi bản địa tại Việt Nam. Luận án chứng minh epitope RoTAT 1.2 là một "điểm neo miễn dịch học" (immunological anchor) ổn định tuyệt đối, không bị chi phối bởi hiện tượng đảo chuyển biểu hiện gen VSG, tạo tiền đề vững chắc cho việc thiết lập các công cụ chẩn đoán huyết thanh học kháng thể đặc hiệu cao.

2. Đổi mới phương pháp luận của nghiên cứu vượt trội hơn các công bố trước đây như thế nào? So với nghiên cứu của Phạm Sỹ Lăng (1982) dùng ngưng kết phiến kính SAT phụ thuộc vào tiên mao trùng sống (độ chính xác chỉ 70-80%) và Lê Ngọc Mỹ (1994, 2002) dùng kháng nguyên toàn phần ly giải từ chuột dễ phản ứng chéo, luận án của NCS. Phạm Thị Trang đã đổi mới căn bản bằng công nghệ DNA tái tổ hợp: sử dụng hệ vector pET22b biểu hiện đoạn gen RoTAT 1.2 kích thước chuẩn trong E. coli BL21, tinh sạch protein đơn nhất và gắn cộng hóa trị/hấp phụ chọn lọc lên hạt vi cầu latex nhuộm xanh CBB, mang lại độ nhạy 98,24% và độ đặc hiệu 98,68% tương đương ELISA nhưng rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống 5 phút.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ tập dữ liệu thực nghiệm là gì? Phát hiện bất ngờ là sự đồng nhất di truyền tuyệt đối (99,8 - 100%) của chuỗi gen 18S rRNA giữa các phân lập tại 4 huyện vùng núi Tuyên Quang với các chủng T. evansi tại Nam Mỹ và Bắc Phi, chứng minh tính bảo tồn cao của ký sinh trùng dù điều kiện địa lý và ký chủ hoàn toàn cách biệt. Đồng thời, nghiên cứu chứng minh tỷ lệ nhiễm ở trâu cày kéo trưởng thành (>3 năm tuổi) cao vượt trội nhóm nghé non, đảo ngược quan niệm truyền thống cho rằng gia súc non mẫn cảm hơn với dịch bệnh.

4. Giao thức nhân bản (Replication Protocol) có được mô tả đầy đủ để tái lập không? Quy trình thực nghiệm được mô tả chi tiết từng bước: từ nồng độ mồi PCR, chu trình nhiệt luân chuyển, nồng độ enzym Klenow, tỷ lệ plasmid:gen chèn trong phản ứng ghép nối T4 DNA Ligase, các nồng độ kháng sinh Ampicillin (50-100 $\mu$g/ml), nồng độ IPTG cảm ứng (0,8 mM), hệ đệm Tricine-SDS đến mật độ hạt latex và nồng độ chất bảo quản PMSF. Mọi phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn đều có thể tái lập 100% kết quả nghiên cứu.

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào? Lộ trình hướng tới 3 mục tiêu chiến lược: (1) Tích hợp công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) giám sát biến thể mất đoạn RoTAT 1.2 trên toàn quốc; (2) Chuyển đổi định dạng CATT sang dạng que thử nhanh sắc ký miễn dịch (Rapid Strip Test) phủ hạt nano vàng (Gold Nanoparticles); (3) Phát triển vắc xin tiểu phần tái tổ hợp kết hợp tá dược nano kích thích miễn dịch tế bào chống Trypanosoma.

Kết luận

Luận án tiến sĩ thú y của NCS. Phạm Thị Trang là một công trình khoa học mẫu mực, kết hợp nhuần nhuyễn giữa dịch tễ học thú y truyền thống và công nghệ sinh học phân tử hiện đại. Công trình tạo nên 5 dấu ấn đóng góp then chốt:

1. Xác định chuẩn xác đặc điểm dịch tễ học phân tử và tỷ lệ nhiễm bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang qua các chỉ số dịch tễ lứa tuổi, mùa vụ và danh tính gen 18S rRNA.
2. Tách dòng và biểu hiện thành công protein kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp RoTAT 1.2 có hoạt tính sinh học và tính đặc hiệu miễn dịch cao trên hệ thống vi khuẩn E. coli BL21.
3. Chế tạo thành công bộ Kit CATT ngưng kết hạt latex màu mang kháng nguyên tái tổ hợp rRoTAT 1.2 với độ nhạy 98,24% và độ đặc hiệu 98,68%, rút ngắn thời gian chẩn đoán còn 5 phút tại thực địa.
4. Xây dựng và chuẩn hóa phác đồ điều trị phối hợp Isometamidium chloride (Trypamidium samorin 1,0 mg/kg TT) cùng liệu pháp hồi sức nâng đỡ, đạt hiệu quả chữa khỏi 100% an toàn tuyệt đối.
5. Nội địa hóa quy trình công nghệ sản xuất kit chẩn đoán sinh học phân tử giá thành thấp, mở ra kỷ nguyên chủ động công nghệ phòng chống dịch bệnh ký sinh trùng đường máu đại gia súc tại Việt Nam và các quốc gia nhiệt đới đang phát triển.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài 1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật 1. Căn bệnh Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra.

Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae… có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra. Tiên mao trùng T.

evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m. Giữa thân tiên mao trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do (Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12]). Kinetoplast Màng rung Nhân Roi t do Hình 1. Cấu trúc của tiên mao trùng T.

evansi (Nguồn: Desquesnes M. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch., không ký sinh ở người (Phạm Sỹ Lăng và cs. Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae). Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học.

Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng. Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino F. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M.

Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu. evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc) c 6 đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina. evansi được tìm thấy không chỉ ở Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia, mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia, Kenya. Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á.

Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm Sỹ Lăng và cs. Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs. Đặc điểm gây bệnh của T.

evansi Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da. Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh. Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng.

Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da. Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân. Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt. Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có nhiều tiên mao trùng phát triển.

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. (2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và giác mạc mắt. Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau c 7 chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng.

Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết. Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc.

Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều phương pháp khác nhau: * Phương pháp chẩn đoán lâm sàng Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao.

Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác. * Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M. Cụ thể như sau: - Phương pháp phát hiện tiên mao trùng Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu (Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky); phương pháp tập trung tiên mao trùng. c 8 - Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.

Ở phương pháp này, người ta tiêm truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng chuột nhắt trắng). Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm truyền để phát hiện tiên mao trùng. Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại. Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được.

- Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ: Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh. Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện, đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán chuyên biệt.

Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính. Nếu động vật không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản ứng âm tính. c 9 Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test) Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi nhiễm. Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng.

Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng sống thực hiện phản ứng này. Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test) Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng. Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra.

Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Nhờ có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan sát hơn. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được.

Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán. Trong phương pháp này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp hai lớp.