Luận văn nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở đàn trâu tại tỉnh tuyên quang

Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và phát triển kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trypanosomiasis ở trâu tại Tuyên Quang, hỗ trợ phòng ngừa hiệu quả.

• Tác giả: Phạm Thị Trang
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Kim Lan
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật
• 1.1.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
• 1.1.3. Phương thức truyền lây tiên mao trùng
• 1.1.4. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 1.1.5. Đặc điểm gây bệnh của T. evansi
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.3.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị
• 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh
• 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả
• 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt
• 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ
• 3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang
• 3.3. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1
• 3.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T.
• 3.5. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến ở nhiều loài gia súc, đặc biệt là trâu. Tại tỉnh Tuyên Quang, bệnh này gây ra thiệt hại lớn cho người chăn nuôi do tỷ lệ nhiễm trùng cao và khó phát hiện. Theo nghiên cứu, Trypanosoma evansi là tác nhân chính gây bệnh, lây truyền qua các loài ruồi hút máu. Việc phát hiện và điều trị kịp thời là rất cần thiết để giảm thiểu thiệt hại. Do đó, nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán là một yêu cầu cấp thiết nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của đề tài là xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang và chế tạo kit chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng quy trình chẩn đoán và điều trị bệnh, từ đó nâng cao sức khỏe cho đàn gia súc và cải thiện đời sống cho người chăn nuôi.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin về tỷ lệ nhiễm và các biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng. Việc chế tạo kit chẩn đoán từ kháng nguyên tái tổ hợp sẽ giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác, từ đó giảm thiểu thiệt hại cho người chăn nuôi. Hơn nữa, nghiên cứu này còn khẳng định khả năng làm chủ công nghệ trong sản xuất kit chẩn đoán, góp phần vào sự phát triển của ngành thú y tại Việt Nam.

IV. Tình hình nhiễm tiên mao trùng

Tình hình nhiễm tiên mao trùng ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang cho thấy tỷ lệ nhiễm cao, đặc biệt trong mùa mưa khi côn trùng phát triển mạnh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm có sự khác biệt theo lứa tuổi và mùa vụ. Các triệu chứng lâm sàng như sốt cao, gầy yếu, và viêm kết mạc thường gặp ở những con bị nhiễm. Việc xác định tỷ lệ nhiễm và các yếu tố ảnh hưởng là rất quan trọng để xây dựng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

V. Chế tạo kit chẩn đoán

Quá trình chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng được thực hiện dựa trên công nghệ sinh học hiện đại. Kit CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) được phát triển từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2, cho phép phát hiện kháng thể kháng Trypanosoma evansi với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả thử nghiệm cho thấy kit này có thể áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh, giúp người chăn nuôi phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) do ký sinh trùng đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra là một bệnh truyền nhiễm đường máu phổ biến trên nhiều loài gia súc, đặc biệt là trâu và bò. Tại Việt Nam nói chung và tỉnh Tuyên Quang nói riêng, bệnh thường diễn biến ở thể mạn tính với các triệu chứng không điển hình, dẫn đến việc khó phát hiện và điều trị kịp thời. Hàng năm, trâu bò mắc bệnh bị suy giảm thể lực, giảm khả năng cày kéo và có tỷ lệ chết cao trong vụ Đông - Xuân khi thời tiết rét lạnh và nguồn thức ăn khan hiếm. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi tươi hoặc nhuộm tiêu bản máu có độ nhạy thấp; phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng đòi hỏi thời gian dài; kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) yêu cầu trang thiết bị hiện đại; trong khi các kỹ thuật huyết thanh học gặp thách thức do sự biến đổi liên tục của các glycoprotein bề mặt biến đổi (VSG) của ký sinh trùng. Khoảng trống nghiên cứu đặt ra là cần xác định chính xác đặc điểm dịch tễ tại địa phương, lựa chọn epitope kháng nguyên bề mặt có tính ổn định cao (RoTAT 1.2) để chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh dạng ngưng kết (Kit CATT) ứng dụng trực tiếp tại thực địa, đồng thời xác lập phác đồ điều trị đặc hiệu.

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang.
2. Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra trên đàn trâu; kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp RoTAT 1.2; bộ sinh phẩm Kit CATT phục vụ chẩn đoán bệnh; các loại hóa dược điều trị ký sinh trùng đường máu.
• Phạm vi không gian: Thu thập mẫu máu trâu và triển khai thử nghiệm tại các nông hộ thuộc 4 huyện của tỉnh Tuyên Quang gồm Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên và Chiêm Hóa. Các phân tích phòng thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Chăn nuôi Thú y (Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên), Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương và Khoa Công nghệ sinh học (Viện Đại học Mở Hà Nội).
• Phạm vi thời gian: Công trình được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2013 đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến dịch tễ học, đặc điểm bệnh học, phương pháp chẩn đoán và biện pháp điều trị bệnh do T. evansi:

Về tình hình nhiễm và dịch tễ học, trong nước, các nghiên cứu của Nguyễn Quốc Doanh và cs. (1996) ghi nhận tỷ lệ nhiễm 17,80% ở Thanh Trì (Hà Nội) bằng phương pháp tiêm truyền chuột và 30,12% tại Phấn Mễ bằng Card-test; Hà Viết Lượng (1998) xác định tỷ lệ nhiễm ở bò miền Trung là 8,99%; Nguyễn Quốc Doanh và Phạm Sỹ Lăng (2001) phát hiện tỷ lệ nhiễm trung bình 7,89% trên rắn và ba ba; Sengsouly P. và cs. (2013) ghi nhận tỷ lệ nhiễm 22,4% trên trâu tại Thái Nguyên và Cao Bằng; Nguyen T.K.L. và cs. (2014) khảo sát 484 mẫu huyết thanh trâu tại 5 tỉnh miền Bắc ghi nhận tỷ lệ dương tính 27,1%; Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) ghi nhận trâu có tỷ lệ nhiễm cao nhất (15,58%) trong các loài gia súc khảo sát. Ở nước ngoài, các công trình của Goossens B. và cs. (2006) tại Tanzania, Sinshaw A. và cs. (2006) tại Ethiopia, Carlos E. và cs. (2012) tại Philippines, Tehseen S. và cs. (2015) tại Pakistan, và Hassan-Kadle A. và cs. (2017) tại Ai Cập đã chứng minh sự lưu hành rộng rãi của T. evansi trên nhiều loài vật chủ khác nhau.

Về vật môi giới truyền lây, Bùi Quý Huy (2006), Phan Văn Chinh (2006) và Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2014) đã xác định vai trò truyền lây cơ học chủ yếu của các loài ruồi hút máu (Stomoxys calcitrans) và mòng hút máu (Tabanus rubidus, Tabanus kiangsuensis), với mùa hoạt động cao điểm từ tháng 4 đến tháng 9.

Về phương pháp chẩn đoán và đặc tính kháng nguyên, các nghiên cứu ban đầu sử dụng phản ứng ngưng kết trên phiến kính (Phạm Sỹ Lăng, 1982), ELISA phát hiện kháng thể (Lê Ngọc Mỹ, 2002; Trần Đức Hạnh và cs., 2009; Phạm Thị Tâm và cs., 2013; Sivajothi S. và cs., 2016). Kháng nguyên bề mặt của T. evansi có tính biến dị cao thông qua sự thay thế liên tục các biến thể VSG (Pays E., 2011; Phạm Đức Chương và cs., 2007). Tuy nhiên, các nghiên cứu của Urakawa T. (2001), Verloo D. và cs. (2001), Claes F. và cs. (2004), Vương Thị Lan Phương (2004), Abou El Naga T. và cs. (2012) khẳng định kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt biến đổi có mặt ở hầu hết các type kháng nguyên (VAT) của T. evansi, có tính bảo thủ và đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các loài ký sinh trùng khác. Nguyễn Mạnh Hùng và cs. (2015), Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2015) đã bước đầu thử nghiệm chế tạo kit latex và kit TUAF-CATT từ kháng nguyên RoTAT 1.2.

Về điều trị, các nghiên cứu sử dụng nhiều loại hóa dược như Novarsenobenzol (Phan Địch Lân, 2004), Naganin (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2008), Diminazene aceturate, Trypamidium samorin, Diminavet (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2013; Tuntasuvan D. và cs., 2003). Các nghiên cứu quốc tế gần đây của Tchamdja E. và cs. (2016) cảnh báo tình trạng kháng thuốc của tiên mao trùng đối với Diminazene diaceturate và Isometamidium chloride tại một số khu vực.

Vị trí của luận án được xác lập thông qua việc giải quyết khoảng trống: ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để tách dòng, biểu hiện thành công đoạn gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp RoTAT 1.2 của T. evansi, thiết lập quy trình công nghệ hoàn chỉnh để sản xuất bộ Kit CATT tại chỗ, đồng thời cung cấp bộ dữ liệu dịch tễ học và xác lập phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu tại địa bàn tỉnh Tuyên Quang.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp cơ sở lý thuyết ký sinh trùng học, dịch tễ học thú y và công nghệ sinh học phân tử:

• Căn bệnh học và miễn dịch học ký sinh trùng: Căn bệnh T. evansi thuộc lớp trùng roi Flagellata, có cấu trúc hình thoi dài 18 - 34 µm với nhân, màng rung và roi tự do. Quá trình né tránh miễn dịch của ký sinh trùng dựa trên cơ chế chuyển đổi các điểm biểu hiện (Expression Sites) hoặc tái tổ hợp các đoạn DNA mã hóa VSG. Kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên đặc hiệu có tính ổn định cao.
• Nguyên lý chẩn đoán ngưng kết hạt Latex (CATT): Dựa trên phản ứng ngưng kết miễn dịch giữa kháng nguyên RoTAT 1.2 gắn trên bề mặt hạt nhựa latex với kháng thể đặc hiệu kháng T. evansi có trong huyết thanh vật chủ, tạo thành các cụm ngưng kết quan sát được bằng mắt thường trên thẻ nhựa.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo các hợp phần kỹ thuật:

1. Phương pháp điều tra dịch tễ học: Thu thập mẫu máu trâu ngẫu nhiên tại 4 huyện; kiểm tra sự hiện diện của tiên mao trùng bằng phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng (chuột 18 - 20 g), theo dõi máu ngoại vi chuột hàng ngày; phân tích tỷ lệ nhiễm phân theo địa bàn hành chính, nhóm tuổi (< 1 năm, 1 - 3 năm, > 3 năm), tính biệt (đực, cái) và mùa vụ trong năm (Xuân, Hạ, Thu, Đông).
2. Phương pháp sinh học phân tử định danh loài và tách dòng gen:
   • Tách chiết DNA tổng số từ máu trâu nhiễm bệnh; khuếch đại gen 18S rRNA bằng phản ứng PCR; tinh sạch sản phẩm PCR, gắn nối vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt; biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli (E. coli) chủng DH5α. Giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ phân tử so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
   • Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2; xử lý sản phẩm PCR bằng enzyme Klenow; ghép nối vào vector tách dòng pJET1.2; kiểm tra dòng tái tổ hợp bằng phản ứng PCR và cắt giới hạn bằng enzyme EcoRI và SalI; giải trình tự đoạn gen chèn.
3. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp:
   • Cắt tách đoạn gen RoTAT 1.2 từ plasmid pJET1.2 tái tổ hợp và ghép nối vào vector biểu hiện pET-22b(+); chuyển nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21(DE3).
   • Khảo sát các điều kiện tối ưu cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp: mật độ quang tế bào trước khi cảm ứng ($OD_{600}$), nồng độ chất cảm ứng Isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), nhiệt độ nuôi cấy, thời gian cảm ứng, pH môi trường và nồng độ kháng sinh ampicillin.
   • Kiểm tra protein tái tổ hợp bằng điện di gel Tricine-SDS PAGE và xác định tính đặc hiệu bằng phản ứng Western blot với huyết thanh chuẩn.
4. Phương pháp chế tạo và đánh giá Kit CATT:
   • Tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex: khảo sát nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 và mật độ hạt latex, nhiệt độ và thời gian gắn kết.
   • Bổ sung chất nhuộm màu, chất ức chế phân giải protein (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride - PMSF), chất ổn định protein và chất diệt khuẩn.
   • Đánh giá độ pha loãng huyết thanh, thời gian đọc phản ứng, độ ổn định theo thời gian và nhiệt độ bảo quản.
   • Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của Kit CATT thông qua đối chứng song song với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng.
5. Phương pháp thử nghiệm phác đồ điều trị: Thiết kế thử nghiệm điều trị diện hẹp và diện rộng đối với trâu nhiễm bệnh, so sánh hiệu lực của 3 loại hóa dược: Azidin (Diminazene diaceturate, liều 4,0 mg/kg thể trọng), Trypanosoma (Isometamidium chlorhydrat chlorur, liều 1,0 mg/kg thể trọng) và Trypamidium samorin (Isometamidium chloride hypochloride, liều 1,0 mg/kg thể trọng), kết hợp thuốc trợ tim Cafein natri benzoat 20% và thuốc trợ sức (dung dịch nước muối sinh lý, Vitamin C 5%, Vitamin B1 2,5%).

Nguồn dữ liệu và vật liệu nghiên cứu bao gồm mẫu máu trâu thu thập tại tỉnh Tuyên Quang, động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng 18 - 20 g, thỏ 2,0 - 2,5 kg), các chủng vi khuẩn E. coli DH5α và BL21(DE3), các vector pJET1.2 và pET-22b(+), các cặp mồi chuyên biệt, hóa chất sinh học phân tử và các loại thuốc thú y thương mại. Số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm chuyên dụng trong thú y.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý luận và thực tiễn của đề tài:

• Trình bày chi tiết căn bệnh học Trypanosoma evansi, hình thái học, chu kỳ sinh học, phương thức truyền lây cơ học qua ruồi Stomoxys calcitrans và các loài mòng họ Tabanidae.
• Phân tích cơ chế bệnh sinh: hiện tượng ký sinh trùng sử dụng protein huyết tương gây giảm áp lực keo, tăng tính thấm thành mạch dẫn đến thủy thũng tổ chức; độc tố tác động lên trung khu điều hòa nhiệt gây sốt cách quãng; các biến đổi bệnh lý ở tim, phổi, gan, lách, thận và hệ thống thần kinh.
• Hệ thống hóa các phương pháp chẩn đoán từ lâm sàng, xét nghiệm ký sinh trùng học (soi tươi, nhuộm Giemsa, tập trung ký sinh trùng, tiêm truyền động vật thí nghiệm), chẩn đoán huyết thanh học (CATT, SAT, LATEX, IFAT, ELISA) đến chẩn đoán phân tử (PCR, Duplex-PCR).
• Phân tích cơ chế né tránh miễn dịch thông qua biến đổi kháng nguyên bề mặt VSG và khẳng định tính ổn định đặc thù của kháng nguyên RoTAT 1.2.
• Tổng quan các hệ thống tách dòng và biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn E. coli và nấm men; đặc điểm của các vector plasmid pJET1.2, pET-22b(+).
• Phân tích điều kiện tự nhiên, khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, đặc điểm địa hình đồi núi chiếm 53% diện tích và tập quán chăn nuôi trâu thả đồi tại tỉnh Tuyên Quang tạo điều kiện thuận lợi cho vật môi giới phát triển và duy trì mầm bệnh.

Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các tiêu chuẩn kỹ thuật:

• Trình bày đối tượng, địa điểm (4 huyện Tuyên Quang và 3 phòng thí nghiệm) và thời gian thực hiện (2013 - 2017).
• Liệt kê chi tiết danh mục vật liệu, chủng vi sinh vật, động vật thí nghiệm, hóa chất, enzyme giới hạn, kháng sinh, môi trường nuôi cấy (LB, PCA), thành phần dung dịch đệm (PBS, TEA), gel Tricine-SDS và các loại thuốc thú y (Azidin, Trypanosoma, Trypamidium samorin).
• Thiết lập quy trình khuếch đại gen 18S rRNA và gen mã hóa RoTAT 1.2 bằng PCR (thành phần phản ứng, chu trình nhiệt).
• Mô tả quy trình tạo dòng trên vector pJET1.2, chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường LB bổ sung Ampicillin, X-gal và IPTG; quy trình chuyển gen vào vector biểu hiện pET-22b(+).
• Thiết lập quy trình tối ưu hóa các thông số nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein RoTAT 1.2 trong E. coli BL21(DE3); quy trình kiểm tra bằng Western blot.
• Quy trình gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex, xác định nồng độ chất ức chế PMSF, chất ổn định, chất diệt khuẩn để hoàn thiện Kit CATT; quy trình đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và hạn sử dụng của kit.
• Thiết kế sơ đồ thử nghiệm lâm sàng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp và diện rộng.

Hợp phần nghiên cứu	Phương pháp / Kỹ thuật chính	Chỉ tiêu / Sản phẩm theo dõi
Dịch tễ học thực địa	Tiêm truyền chuột nhắt trắng, xét nghiệm máu	Tỷ lệ nhiễm theo huyện, lứa tuổi, tính biệt, mùa vụ
Định danh phân tử	PCR gen 18S rRNA, giải trình tự, cây phả hệ	Mức độ tương đồng nucleotide với các chủng trên NCBI
Công nghệ gen	Tách dòng pJET1.2, biểu hiện trên pET-22b(+)	Kích thước đoạn gen, mức độ biểu hiện protein RoTAT 1.2
Chế tạo Kit CATT	Gắn kháng nguyên lên hạt latex, nhuộm màu	Mật độ hạt latex, độ nhạy, độ đặc hiệu, thời hạn bảo quản
Điều trị thực nghiệm	Thử nghiệm lâm sàng so sánh 3 phác đồ	Tỷ lệ khỏi bệnh, thời gian sạch ký sinh trùng, tính an toàn

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm và thảo luận kết quả:

• Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang:
  • Tỷ lệ nhiễm chung tại 4 huyện khảo sát (Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên, Chiêm Hóa) được xác định cụ thể qua xét nghiệm tiêm truyền chuột.
  • Biến động tỷ lệ nhiễm theo lứa tuổi: trâu trên 3 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm cao hơn so với lứa tuổi 1 - 3 năm và dưới 1 năm tuổi.
  • Tỷ lệ nhiễm theo tính biệt: sự sai khác giữa trâu đực và trâu cái không mang ý nghĩa thống kê rõ rệt.
  • Tỷ lệ nhiễm theo mùa: tỷ lệ nhiễm tăng cao vào mùa Hè và mùa Thu (trùng với thời kỳ hoạt động mạnh của ruồi và mòng hút máu), giảm vào mùa Đông và Xuân.
• Kết quả định danh loài tiên mao trùng:
  • Khuếch đại thành công đoạn gen 18S rRNA của các mẫu phân lập tại 4 huyện (ký hiệu Tev-CH-VN, Tev-HY-VN, Tev-SD-VN, Tev-YS-VN).
  • Phân tích trình tự nucleotide và xây dựng cây phả hệ cho thấy các mẫu phân lập tại Tuyên Quang có độ tương đồng cao với các chuỗi gen Trypanosoma evansi đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI).
• Kết quả tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2:
  • Khuếch đại và tách dòng thành công đoạn gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 vào vector pJET1.2/blunt, xác định được trình tự nucleotide và trình tự axit amin suy diễn.
  • Chuyển nạp thành công đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET-22b(+) và biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3).
  • Xác định các thông số tối ưu cho biểu hiện protein tái tổ hợp RoTAT 1.2: giá trị $OD_{600}$ khi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian cảm ứng, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường và nồng độ ampicillin.
  • Kiểm tra bằng điện di Tricine-SDS PAGE và phản ứng Western blot khẳng định kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp có tính đặc hiệu miễn dịch cao với kháng thể kháng T. evansi.
• Kết quả chế tạo và thử nghiệm Kit CATT:
  • Xác định tỷ lệ tối ưu giữa mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp để tạo phức hợp ngưng kết rõ nét; xác định nhiệt độ và thời gian gắn kết thích hợp.
  • Lựa chọn chất nhuộm màu giúp quan sát rõ phản ứng ngưng kết trên thẻ nhựa; bổ sung chất ức chế protease PMSF, chất ổn định protein và chất diệt khuẩn giúp duy trì hoạt tính sinh học của kit.
  • Xác định độ pha loãng huyết thanh, thời gian phản ứng và nhiệt độ bảo quản kit; đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của Kit CATT đạt mức cao, tương đương với phản ứng ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng.
• Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị:
  • Thử nghiệm diện hẹp và diện rộng khẳng định phác đồ sử dụng thuốc Trypamidium samorin (hoặc Trypanosoma) kết hợp tiêm trợ tim bằng Cafein natri benzoat 20% trước 30 - 45 phút, sau đó truyền dung dịch nước muối sinh lý, Vitamin C và Vitamin B1 cho hiệu quả điều trị đạt 100%, trâu hồi phục nhanh và an toàn tuyệt đối.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự xác định các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn:

1. Đóng góp về mặt khoa học:
   • Cung cấp dữ liệu khoa học có hệ thống về dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang, xác định mối liên hệ giữa tỷ lệ nhiễm với lứa tuổi, tính biệt và mùa vụ trong năm.
   • Định danh chính xác loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu tỉnh Tuyên Quang là Trypanosoma evansi dựa trên phân tích trình tự gen 18S rRNA.
   • Tách dòng, xác định trình tự gen và biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp RoTAT 1.2 của T. evansi trong hệ thống tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3), làm chủ quy trình công nghệ tạo nguồn kháng nguyên ổn định phục vụ chẩn đoán.
2. Đóng góp về mặt thực tiễn:
   • Chế tạo thành công bộ sinh phẩm Kit CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2. Bộ kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thao tác đơn giản, cho kết quả nhanh và thuận tiện ứng dụng chẩn đoán trực tiếp tại các cơ sở chăn nuôi thực địa.
   • Xác lập và hoàn thiện quy trình điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu bằng việc kết hợp hóa dược đặc hiệu với phác đồ hồi sức, trợ lực, góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi tại địa phương.

Luận án đề xuất các kiến nghị và giải pháp:

• Ứng dụng rộng rãi bộ Kit CATT đã chế tạo để kiểm tra định kỳ, sàng lọc phát hiện sớm trâu mang mầm bệnh tiên mao trùng tại các địa phương thuộc vùng dịch tễ trung du và miền núi.
• Áp dụng phác đồ điều trị kết hợp hóa dược đặc hiệu và thuốc trợ tim, trợ sức vào các thời điểm nghỉ cày kéo (tháng 4 và tháng 8 hàng năm) nhằm nâng cao sức đề kháng cho đàn trâu trước mùa dịch.
• Tiếp tục duy trì các biện pháp vệ sinh chuồng trại, tiêu diệt ruồi, mòng hút máu nhằm ngăn chặn triệt để con đường truyền lây cơ học của bệnh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ vào nội dung và phạm vi nghiên cứu được trình bày trong luận án:

• Hạn chế: Nghiên cứu dịch tễ học và thử nghiệm thực địa mới chỉ tập trung trên đàn trâu tại 4 huyện của một tỉnh miền núi (Tuyên Quang), chưa mở rộng điều tra toàn diện trên các loài gia súc mẫn cảm khác (bò, ngựa, dê) trên phạm vi toàn vùng Đông Bắc Bộ. Quá trình bảo quản bộ Kit CATT trong điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên kéo dài cần tiếp tục được theo dõi để đánh giá hạn dùng tối đa.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng ứng dụng bộ Kit CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên các đối tượng gia súc khác tại nhiều vùng sinh thái khác nhau.
  • Hoàn thiện công nghệ sản xuất Kit CATT ở quy mô công nghiệp để thương mại hóa sản phẩm sinh phẩm thú y nội địa.
  • Tiếp tục theo dõi tính mẫn cảm của các chủng T. evansi thực địa đối với các loại thuốc điều trị nhằm kịp thời phát hiện hiện tượng kháng thuốc.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Thú y, Ký sinh trùng học và Công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình tách dòng gen, thiết kế vector tái tổ hợp (pJET1.2, pET-22b(+)), phương pháp tối ưu hóa điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli và quy trình chế tạo sinh phẩm chẩn đoán ngưng kết hạt latex.
• Bác sĩ thú y, cán bộ kỹ thuật tại các Trạm Chăn nuôi và Thú y, Chi cục Thú y các tỉnh: Tham khảo phương pháp chẩn đoán nhanh bằng Kit CATT tại thực địa, kỹ thuật tiêm truyền động vật thí nghiệm và quy trình phác đồ điều trị hồi sức kết hợp hóa dược đặc hiệu cho trâu bò.
• Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách chăn nuôi thú y: Sử dụng dữ liệu dịch tễ học theo mùa vụ và địa bàn để xây dựng kế hoạch phòng chống dịch bệnh ký sinh trùng đường máu, phân bổ nguồn lực thú y và tổ chức phòng trị định kỳ cho đàn gia súc miền núi.

Câu hỏi thường gặp

1. Căn bệnh gây bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu tại Tuyên Quang được xác định là loài nào và bằng phương pháp gì? Căn bệnh gây bệnh được xác định là loài Trypanosoma evansi (T. evansi), thuộc giới nguyên sinh động vật (Protozoa), lớp trùng roi (Flagellata). Luận án xác định chính xác loài này thông qua việc phân lập ký sinh trùng từ máu trâu, tiêm truyền chuột nhắt trắng, khuếch đại đoạn gen 18S rRNA bằng phản ứng PCR, giải trình tự nucleotide và phân tích cây phả hệ phân tử đối chiếu với cơ sở dữ liệu NCBI.

2. Tại sao tác giả lựa chọn kháng nguyên RoTAT 1.2 để chế tạo Kit CATT thay vì các kháng nguyên bề mặt khác của T. evansi? Kháng nguyên bề mặt của T. evansi phần lớn là các glycoprotein biến đổi (VSG) có khả năng thay đổi liên tục để né tránh hệ miễn dịch của vật chủ. Ngược lại, kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt biến đổi có mặt ở hầu hết các type kháng nguyên (VAT) của T. evansi, có tính ổn định cao, xuất hiện sớm sau khi nhiễm và không gây phản ứng chéo với kháng thể của các loài ký sinh trùng khác, đảm bảo cho sinh phẩm chẩn đoán đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

3. Hệ thống vector và tế bào chủ nào đã được sử dụng để biểu hiện gen kháng nguyên RoTAT 1.2? Đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 sau khi khuếch đại bằng PCR được tách dòng và lưu giữ trong vector pJET1.2/blunt trên tế bào E. coli DH5α. Sau đó, đoạn gen được cắt và ghép nối vào vector biểu hiện pET-22b(+) rồi biến nạp vào tế bào chủ E. coli chủng BL21(DE3) để tổng hợp protein kháng nguyên tái tổ hợp.

4. Phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng nào cho hiệu quả cao nhất trong các thử nghiệm của luận án? Phác đồ đạt hiệu quả cao nhất (tỷ lệ khỏi 100%, sạch ký sinh trùng và an toàn) là sử dụng thuốc đặc hiệu Trypamidium samorin (hoặc Trypanosoma) kết hợp tiêm bắp thuốc trợ tim Cafein natri benzoat 20% trước 30 - 45 phút, sau đó truyền bù dịch bằng nước muối sinh lý kết hợp Vitamin C 5% và Vitamin B1 2,5%.

5. Kết quả chẩn đoán của bộ Kit CATT tự chế tạo có tương đương với các phương pháp tiêu chuẩn không? Kết quả đánh giá cho thấy bộ Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương đương với phản ứng ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng, đồng thời vượt trội về tốc độ thực hiện và tính khả thi khi áp dụng tại điều kiện thực địa thiếu thiết bị chuyên sâu.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Thị Trang đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây ra trên đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang. Tác giả đã làm chủ quy trình công nghệ sinh học phân tử trong việc tách dòng, giải trình tự và biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên hệ thống E. coli. Bộ sinh phẩm Kit CATT được chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán nhanh tại thực địa. Đồng thời, luận án đã xác lập phác đồ điều trị kết hợp hóa dược đặc hiệu và hồi sức nâng cao thể trạng, mang lại giá trị khoa học và giá trị ứng dụng thực tiễn trong công tác thú y tại địa phương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài 1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật 1. Căn bệnh Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra.

Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae… có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra. Tiên mao trùng T.

evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m. Giữa thân tiên mao trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do (Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12]). Kinetoplast Màng rung Nhân Roi t do Hình 1. Cấu trúc của tiên mao trùng T.

evansi (Nguồn: Desquesnes M. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch., không ký sinh ở người (Phạm Sỹ Lăng và cs. Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae). Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học.

Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng. Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino F. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi (Nguồn: Desquesnes M.

Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu. evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc) c 6 đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina. evansi được tìm thấy không chỉ ở Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia, mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia, Kenya. Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á.

Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm Sỹ Lăng và cs. Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs. Đặc điểm gây bệnh của T.

evansi Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da. Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh. Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng.

Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da. Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân. Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt. Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có nhiều tiên mao trùng phát triển.

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. (2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và giác mạc mắt. Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau c 7 chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng.

Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết. Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc.

Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi có ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều phương pháp khác nhau: * Phương pháp chẩn đoán lâm sàng Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện được. Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao.

Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác. * Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M. Cụ thể như sau: - Phương pháp phát hiện tiên mao trùng Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu (Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky); phương pháp tập trung tiên mao trùng. c 8 - Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.

Ở phương pháp này, người ta tiêm truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng chuột nhắt trắng). Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm truyền để phát hiện tiên mao trùng. Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại. Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được.

- Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ: Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T. evansi: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh. Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện, đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán chuyên biệt.

Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính. Nếu động vật không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản ứng âm tính. c 9 Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test) Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi nhiễm. Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng.

Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng sống thực hiện phản ứng này. Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test) Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng. Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được. Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra.

Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Nhờ có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan sát hơn. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được.

Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán. Trong phương pháp này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp hai lớp.