MỞ ĐẦU Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp với khoảng 70% dân số sinh sống ở nông thôn và 48% lấy nông nghiệp làm sinh kế. Do đặc điểm tự nhiên và điều kiện nền kinh tế, phần lớn các hoạt động sản xuất nông nghiệp của nƣớc ta trong đó có sản xuất lúa gạo (nguồn lƣơng thực chính) bị phụ thuộc vào nguồn nƣớc mƣa tự nhiên và nguồn nƣớc đổ về qua hai hệ thống sông Hồng (miền Bắc) và sông Mekong (đồng bằng sông Cửu Long). Do đó, hạn hán hoặc hiện tƣợng thiếu nƣớc tƣới cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa nƣớc có thể xảy ra khi có sự thiếu hụt lƣợng mƣa hoặc nguồn nƣớc đổ về qua hai hệ thống sông chính bị hạn chế. Đối với sản xuất nông nghiệp, hạn hán là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng lớn nhất, là nguyên nhân chính làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng, đặc biệt là với những cây trồng cần nhiều nƣớc tƣới nhƣ cây lúa.
Gần đây, do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, gây tác động lớn tới tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia, ảnh hƣởng tới công tác xuất khẩu lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an ninh lƣơng thực trong khu vực và trên thế giới. Từ thực tế đó, việc tạo ra các giống cây trồng có năng suất cao, đồng thời chống/chịu đƣợc với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trở thành một trong những nhiệm vụ then chốt của khoa học nông nghiệp trong nƣớc. Thực tế hiện nay cho thấy những giống cây trồng chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi đƣợc sử dụng trong sản xuất ở Việt Nam đều đƣợc lai tạo dựa trên các phƣơng pháp chọn giống truyền thống, hầu nhƣ chƣa có giống cây trồng chịu hạn nào đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp công nghệ sinh học hiện đại. Hiện nay, với sự phát triển bùng nổ của sinh học phân tử và công nghệ tế bào, hai định hƣớng chọn giống chịu hạn đang đƣợc các nhà khoa học 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trong nƣớc cũng nhƣ quốc tế đặc biệt quan tâm là chọn giống kết hợp chỉ thị phân tử và chọn giống nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật.
Trong hai phƣơng pháp này thì bƣớc đầu phƣơng pháp chọn giống kết hợp chỉ thị phân tử đã bƣớc đầu thu đƣợc các kết quả ấn tƣợng đặc biệt là với các tính trạng đơn gen nhƣ các gen kháng, gen quy tính tính trạng số lƣợng. Tuy nhiên, do tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen nên định hƣớng chọn giống ứng dụng chỉ thị phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn. Gần đây, dựa trên những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, cùng với sự phát triển các kỹ thuật microaray, proteomic., các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen điều khiển mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn ở thực vật.
Phát hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu rất cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ cần chuyển một hay một vài gen điều khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cƣờng tính chống chịu của cây trồng. Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chuyển gen/chọn tạo giống chịu hạn. Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen thực vật đã bắt đầu đƣợc một số phòng thí nghiệm quan tâm. Tuy nhiên, hầu hết các chƣơng trình, dự án nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trƣờng nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều đƣợc tiến hành với 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nguồn vật liệu hoặc nền di truyền không phải của Việt Nam, do đó tính ứng dụng ra thực tiễn sản xuất ít nhiều bị hạn chế.
Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi đã đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục đích để tạo nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu điều kiện hạn. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Phân lập và chuyển đƣợc gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam để tạo nguồn vật liệu cho việc chuyển gen/lai tạo các giống cây chống chịu hạn. Mục tiêu cụ thể: i) Phân lập đƣợc gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A/2A liên quan tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam. ii) Tối ƣu hoá đƣợc quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa ở Việt Nam.
iii) Tạo ra đƣợc một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A/2A tăng khả năng chịu hạn trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án: (i) Các gen OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa trồng ở Việt Nam và vai trò, biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã này trong các dòng lúa chuyển gen dƣới sự điều khiển của các promoter liên tục hoặc cảm ứng; 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (ii) Khả năng tạo callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của một số giống lúa trồng ở phía Bắc Việt Nam. Các nội dung nghiên cứu chính: Nội dung 1: Phân lập và thiết kế vector chuyển gen OsDREB1/OsDREB2A của giống lúa Việt Nam dƣới sự điều khiển của promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9). Nội dung 2: Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống lúa trồng ở Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung 3: Tạo giống lúa Chành Trụi chuyển gen OsDREB1/OsDREB2A. Nội dung 4: Đánh giá kiểu hình và biểu hiện của các dòng chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn tại phòng thí nghiệm. Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) là địa chỉ uy tín , dẫn đầu trong cả nƣớc về công tác phân lập , nghiên cứu chức năng của các gen mã hóa nhân tố phiên mã ; và Phòng thí nghiệm Tƣơng tác Cây trồng -Vi sinh vật , Trung tâm nghiên cƣ́u vì sự phát triển (IRD, Montpellier) là phòng thí nghiệm hiện đại, có nhiều chuyên gia uy tín trong nghiên cứu chức năng, biểu hiện của gen/bộ gen thực vật (đặc biệt là lúa). Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng hai gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A liên quan tính chịu hạn.
Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa hai nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A đƣợc phân lập từ nguồn vật liệu di truyền của giống lúa Việt Nam và đƣợc đƣa vào vector biểu hiện thực vật dƣới sự điều khiển bởi 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin) hoặc promoter cảm ứng stress (Lip9). Bốn dòng lúa Chành trụi chuyển gen thế hệ T3 đã đƣợc xác định có mang gen chuyển ổn định (một bản sao, đồng hợp tử). Thử nghiệm cho thấy, cả bốn dòng lúa đều có khả năng sống sót và tiếp tục sinh trƣởng, ra hạt khi bị xử lý hạn cƣỡng bức ở giai đoạn mạ/sinh trƣởng. Đặc biệt là hai dòng L3 và L5 (Lip9:OsDREB1A) có kiểu hình tƣơng đồng với cây không chuyển gen trong điều kiện bình thƣờng và có tỷ lệ sống sót cao khi xử lý hạn.
Luận án đã nghiên cứu khả năng phát sinh callus và tái sinh chồi từ callus của lƣợng lớn giống lúa ở Việt Nam và đã chỉ ra đƣợc một số giống lúa có tiềm năng để nghiên cứu, xây dựng quy trình chuyển gen thích hợp cho từng giống lúa. Điều này càng ý nghĩa hơn khi thời gian gần đây với công nghệ chỉnh sửa hệ gen đang có những bƣớc tiến dài, chúng ta có thể tạo ra đƣợc các giống lúa công nghệ sinh học không qua lai tạo, có các đặc điểm nông sinh học vƣợt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống gốc ban đầu. Trong luận án này lần đầu tiên ở Việt Nam, phản ứng PCR định lƣợng đƣợc áp dụng thành công để ƣớc tính số lƣợng bản sao của cấu trúc chuyển gen và xác định các dòng chuyển gen đồng hợp ngay từ thế hệ T 1. Phƣơng pháp này có một số ƣu thế so với các phƣơng pháp trƣớc đó: tiết kiệm thời gian và vật liệu thí nghiệm, mức độ chính xác cao và xác định đƣợc thể đồng hợp ngay ở thế hệ T1 và rất phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế trong nƣớc.
Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng T3 (đồng hợp, một bản sao gen OsDREB1A dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng Lip9) có kiểu hình tƣơng đồng cây đối chứng không chuyển gen và đặc biệt có khả năng phục hồi và kết hạt sau 3 tuần ngừng tƣới nƣớc. Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsDREB1A và điều hòa biểu 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã dƣới sự điều khiển của promoter cảm ứng trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A đƣợc tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu. Ngoài ra dòng chuyển gen tiếp tục đƣợc duy trì theo dõi trong nhà lƣới để làm nguyên liệu cho công tác lai tạo giống khi điều kiện thực tế cho phép (chấp nhận cây lúa chuyển gen và vật liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra).