Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu tiến sĩ thuộc chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất (mã ngành Dược học), mang tên “Thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất, tinh chế từ cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam”, do nghiên cứu sinh Cao Ngọc Anh thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Đỗ Thị Hà và GS. Thái Nguyễn Hùng Thu. Luận án được hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Dược liệu trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ Y tế mang tên “Nghiên cứu cây Bảy lá một hoa (Paris Polyphylla var. chinensis Smith) theo hướng hỗ trợ điều trị ung thư vú”.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Theo Quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ phê duyệt “Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030”, mục tiêu đặt ra là phát huy tiềm năng dược liệu trong nước, sản xuất đạt 20% nhu cầu nguyên liệu làm thuốc và thuốc từ dược liệu chiếm 30% tổng giá trị tiêu thụ. Các sản phẩm chiết xuất tinh khiết, cao chuẩn là nhóm sản phẩm mũi nhọn.

Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ V (2017) ghi nhận 372 chuyên luận về dược liệu và thuốc từ dược liệu, nhưng chỉ có 117 chuyên luận ứng dụng chất chuẩn để định tính và định lượng hoạt chất. Nhiều chế phẩm thuốc nguồn gốc thảo dược lưu hành tại Việt Nam chưa xây dựng được phương pháp phân tích đặc hiệu cho các chất đánh dấu có hoạt tính sinh học chính, chủ yếu vẫn dùng phương pháp định tính so sánh sơ bộ hoặc định lượng toàn phần kém đặc hiệu do thiếu hụt chất chuẩn đối chiếu.

Quỹ chất chuẩn phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh mới chỉ thiết lập được khoảng 200 dược liệu chuẩn và 50 chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu. Phần lớn các chất chuẩn đơn chất phải nhập khẩu với chi phí cao, thời gian kéo dài và thủ tục phức tạp.

Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Sm.) là loài cây thuốc quý hiếm ở Việt Nam, có thành phần chính là các saponin steroid mang nhiều hoạt tính sinh học như ức chế khối u, điều hòa miễn dịch, cầm máu và chống viêm. Dược điển Trung Quốc (năm 2015) đã đưa 4 saponin làm chất chuẩn đánh dấu chất lượng gồm chonglou saponin I (polyphyllin D), chonglou saponin II (paris saponin II), chonglou saponin VI (paris saponin VI) và chonglou saponin VII (paris saponin VII), quy định tổng hàm lượng không thấp hơn 0,60%. Tại Việt Nam, dược liệu này chủ yếu được dùng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có nghiên cứu hệ thống về việc chiết xuất, tinh chế và thiết lập bộ chất chuẩn đối chiếu theo các nguyên tắc chuẩn mực quốc tế.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Phân lập và tinh chế một số hợp chất trong các bộ phận của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam đủ tinh khiết để làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.
  2. Xây dựng phương pháp phân tích một số saponin phục vụ cho việc thiết lập các chất chuẩn và khảo sát hàm lượng của các hợp chất nghiên cứu có trong một số mẫu cây Bảy lá một hoa.
  3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu và thiết lập chuẩn phòng thí nghiệm cho các nguyên liệu đã phân lập, tinh chế được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận thân rễ và phần trên mặt đất của loài Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis - mã hiệu mẫu PPC 01 cùng các mẫu thu hái khác); các phân đoạn chiết xuất; các hợp chất saponin tinh chế (paris saponin H, paris saponin II, gracillin, polyphyllin D, dioscin); các mẫu dược liệu tươi, dược liệu khô, cao khô và dạng bào chế viên nang có chứa Bảy lá một hoa.
  • Phạm vi không gian: Thực vật thu thập tại các vùng phân bố tự nhiên và trồng trọt ở Việt Nam; công nghiệm thực nghiệm, phân tích phổ học và kiểm nghiệm được tiến hành tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Dược liệu và Trường Đại học Dược Hà Nội.
  • Phạm vi thời gian: Công trình hoàn thành và bảo vệ năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trong nước và quốc tế

  • Phân loại thực vật và phân bố: Chi Paris thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae), bộ Củ nâu (Dioscoreales) theo phân loại của Takhtajan (1987). Trên thế giới có từ 22 đến 128 loài được ghi nhận tên khoa học, phân bố chủ yếu ở khu vực ôn đới và nhiệt đới châu Á. Tại Việt Nam, tài liệu ban đầu ghi nhận 6 loài gồm P. delavayi, P. polyphylla, P. hainanensis, P. yunnanensis, P. chinensis, P. fargesii; sau đó bổ sung thêm các loài như P. vietnamensis, P. caobangensis, P. cronquistii, P. xichouensis, P. dunniana. Cây thường phân bố ở các vùng rừng núi ẩm cao như Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương), Kon Tum (Kon Plong), Lai Châu, Hòa Bình.
  • Thành phần hóa học: Từ năm 1973 đến nay, khoảng 150 hợp chất saponin đã được phân lập từ chi Paris, gồm 125 saponin steroid và 15 saponin triterpenoid:
    • Saponin spirostan (1–63): Khung aglycon diosgenin hoặc pennogenin và các dẫn chất hydroxyl hóa ở C-23, C-24, C-27 liên kết chuỗi đường ở C-3 (Chen và cs., 1990, 1995; Nohara, 1982; Qin và cs., 2016).
    • Saponin furostan (64–86): Matsuda và cs. (2003) phân lập protogracillin mở vòng F có glycosid hóa ở C-26.
    • Saponin pseudo-spirostanol và pregnan (87–108): Công bố bởi Chen và cs. (1990, 1995) gồm nuatigenin và isonuatigenin.
    • Saponin triterpenoid (126–140): Wun và cs. (2012) phân lập 15 hợp chất, trong đó có 6 saponin oleanoid mới (paristrisid A–F).
    • Các nhóm chất khác: Flavonoid (kaempferol glycosid), anthraquinon, sterol (β-ecdyson, 20-hydroxyecdyson), polyacetylen (falcarindiol).
    • Nghiên cứu tại Việt Nam: Châu Thị Nhã Trúc và cs. (2015) phân lập 4 saponin từ thân rễ P. yunnanensis thu tại Kon Tum; Nguyễn Thị Duyên và cs. (2017) phân lập 21 hợp chất từ P. polyphylla var. chinensis.
  • Hoạt tính sinh học:
    • Ức chế tế bào ung thư: Kích thích apoptosis qua con đường ti thể và nội sinh/ngoại sinh (Man Shuli và cs., 2009 trên ung thư phổi LA795; Yan và cs., 2009; Li Xi và cs., 2010 trên ung thư đại tràng SW480; Chen Guang Lie và cs., 2013 trên ung thư cổ tử cung U14; Fu-Kang Li và cs., 2012 trên ung thư thực quản ECA109; Huang Y và cs., 2006 trên HepG2, SGC-7901; Jerzy Gajdus, 2006 trên HL-60, HeLa, MCF-7; Polyphyllin D ức chế dòng HepG2, R-HepG2, MCF-7, MDA-MB-231; Wenjie Zhang và cs., 2014 khảo sát PS-VII trên HeLa; Wun và cs., 2012 trên dòng CNE; Zhen Liu và cs., 2012 trên B16).
    • Điều hòa miễn dịch: Formosanin-C (PS-II) ức chế đáp ứng lymphocytic và kháng thể kháng kháng nguyên S trong viêm mống mắt tự miễn (Qin và cs., 2016).
    • Cầm máu và co thắt tử cung: L. Guo và cs. chứng minh paris saponin tổng và PS-H làm tăng co thắt tử cung chuột (EC50 19,82 mg/ml); Zhen Liu và cs. (2012) khảo sát khả năng rút ngắn thời gian máu chảy và đông máu của 6 loài; Ying Wang và cs. nghiên cứu phân đoạn n-butanol P. bashanensis.
    • Kháng vi sinh vật, bảo vệ dạ dày: Kháng Cladosporium cladosporioides, Candida albicans (Dawei Deng, 2008); kháng virus EV71 và CVB3 (Yuan-Chuen Wang, 2012); kháng ký sinh trùng Dactylogyrus intermedius và Leishmania (Devkota Krishna, 2007; Wang và cs., 2010); bảo vệ niêm mạc dạ dày (Hisashi Matsuda, 2003).
  • Phương pháp phân tích: HPLC-UV ở bước sóng 203 nm, HPLC-ELSD, LC-ESI-MS/MS, UPLC-PDA, UHPLC-QQQ-MS, quang phổ UV đo màu toàn phần, ELISA và FT-IR kết hợp hóa trắc lượng (PCA, PLS-DA) (Pei Chen và cs., 2014; Yuangui Yang và cs., 2016; Zhao và cs., 2016).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, nhưng tại Việt Nam việc nghiên cứu chiết xuất, tinh chế để thiết lập các chất chuẩn đối chiếu tinh khiết cao phục vụ kiểm tra chất lượng dược liệu Bảy lá một hoa và các chế phẩm liên quan vẫn chưa được thực hiện một cách hoàn chỉnh. Luận án giải quyết trực tiếp khoảng trống về quy trình công nghệ phân lập quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cơ sở, thẩm định phương pháp phân tích theo ICH và thiết lập hồ sơ chứng chỉ phân tích (CoA) cho 5 chất chuẩn saponin steroid.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và hướng dẫn tiêu chuẩn

Luận án áp dụng các hướng dẫn quốc tế và trong nước về thiết lập chất chuẩn hóa học:

  • Hướng dẫn thiết lập chất chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Hội đồng Dược điển Mỹ (USP), Hội nghị Quốc tế về Hòa hợp (ICH) và Dược điển Việt Nam V.
  • Nguyên tắc xác định hàm lượng chất chuẩn dựa trên độ tinh khiết khối phổ/sắc ký, hiệu chỉnh độ ẩm (mất khối lượng do làm khô) và cặn dung môi hữu cơ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Chiết xuất và phân lập:
    • Chiết hồi lưu/ngấm kiệt thân rễ và phần trên mặt đất của P. polyphylla var. chinensis bằng cồn (ethanol, methanol).
    • Phân bố lỏng - lỏng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (DCM, EtOAc, n-BuOH).
    • Sắc ký cột pha thường (Silica gel 60) và pha đảo (RP-18), kết hợp rửa giải đẳng dòng và gradient với hệ dung môi dichloromethane - methanol - nước hoặc acetonitril - nước.
  • Xác định cấu trúc hóa học:
    • Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) để xác định các nhóm chức đặc trưng.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, ROESY) để làm rõ trật tự liên kết và cấu hình lập thể mạch đường.
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy.
  • Kiểm tra và đánh giá chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn:
    • Đánh giá cảm quan và độ tan.
    • Xác định mất khối lượng do làm khô bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
    • Đo nhiệt độ nóng chảy bằng thiết bị đo điểm chảy chuyên dụng.
    • Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hàm lượng hoạt chất bằng HPLC-UV (detector UV/DAD ở bước sóng 203 nm, sử dụng cột pha đảo $C_{18}$).
    • Xây dựng và thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan bằng phương pháp sắc ký HPLC diện tích pic bình sai (normalization method / peak area percentage).
  • Quy trình thiết lập chất chuẩn:
    • Đóng gói đơn vị nhỏ đồng đều trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và nhiệt độ.
    • Đánh giá độ đồng nhất lô đóng gói theo phân tích thống kê (lấy mẫu ngẫu nhiên tại các vị trí đầu, giữa, cuối lô).
    • Thử nghiệm liên phòng (Inter-laboratory test) thực hiện song song tại 02 phòng thử nghiệm (PTN) độc lập để kiểm định sai số hệ thống.
    • Xử lý số liệu, tính toán độ không đảm bảo đo và xác định giá trị hàm lượng công bố trên Giấy chứng nhận phân tích (CoA).
    • Theo dõi độ ổn định của các lô chất chuẩn theo thời gian bảo quản.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về loài Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Sm.):

  • Tổng quan về hình thái học thực vật, vị trí phân loại học trong hệ thống Takhtajan (1987), danh lục 6 loài ban đầu và 5 loài mới bổ sung tại Việt Nam, đặc điểm sinh thái vùng phân bố núi cao ẩm mát.
  • Thành phần hóa học với 125 saponin steroid (spirostan, furostan, pseudo-spirostanol, pregnan, polyhydroxyl hóa) và 15 saponin triterpenoid oleanoid cùng các nhóm anthraquinon, flavonoid, sterol.
  • Phân tích cơ chế tác dụng dược lý: gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (LA795), ung thư gan (HepG2), ung thư cổ tử cung (HeLa, U14); cơ chế cầm máu thông qua rút ngắn thời gian đông máu và prothrombin; hoạt tính điều hòa miễn dịch, bảo vệ dạ dày, kháng nấm và kháng khuẩn.
  • Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp định lượng saponin chi Paris (HPLC-UV ở 203 nm, HPLC-ELSD, HPLC-MS/MS, FT-IR, ELISA).
  • Tổng kết cơ sở lý luận về vai trò chất chuẩn trong ngành Kiểm nghiệm thuốc, phân loại chất chuẩn và các bước tiêu chuẩn hóa quy trình thiết lập chất chuẩn chiết xuất từ nguồn gốc tự nhiên.

Chương 2: Đối tượng, nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về thiết kế thực nghiệm:

  • Mô tả nguồn gốc mẫu dược liệu Paris polyphylla var. chinensis (mẫu thân rễ PPC 01 và phần trên mặt đất) được định danh xác thực.
  • Danh mục hóa chất, dung môi sắc ký đạt tiêu chuẩn HPLC, chất đối chiếu chuẩn và các hệ thống máy sắc ký HPLC (Agilent, Waters), máy quang phổ FT-IR, máy đo nhiệt độ nóng chảy.
  • Chi tiết quy trình phân lập, các hệ dung môi chiết tách phân đoạn n-butanol.
  • Thiết kế phương pháp thẩm định quy trình phân tích theo tiêu chuẩn ICH: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng (tỷ lệ phục hồi), độ lặp lại và độ chính xác trung gian (RSD%), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).
  • Quy trình đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng gói, phương pháp tổ chức thử nghiệm liên phòng giữa 2 phòng thử nghiệm và quy tắc xử lý thống kê xác định giá trị công bố trên CoA.

Chương 3: Kết quả thực nghiệm

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được:

  1. Lựa chọn hợp chất thiết lập chuẩn:
    • Xây dựng thành công phương pháp HPLC định lượng đồng thời 4 saponin (chonglou saponin VII, VI, II và polyphyllin D).
    • Khảo sát hàm lượng saponin trong thân rễ mẫu PPC 01, các mẫu thân rễ khác và phần trên mặt đất. Dữ liệu cho thấy thân rễ chứa hàm lượng cao paris saponin H, polyphyllin D, dioscin và gracillin; phần trên mặt đất chứa lượng đáng kể paris saponin II.
    • Luận án đã lựa chọn 5 hợp chất để tiến hành tinh chế và thiết lập chuẩn: Paris saponin H (PS-H), Gracillin, Paris saponin II (PS-II), Polyphyllin D và Dioscin.
  2. Phân lập, tinh chế và nhận danh cấu trúc 5 hợp chất:
    • Paris saponin H: Chiết xuất từ cao n-butanol của thân rễ, tinh chế qua sắc ký cột; xác định cấu trúc pennogenin-3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosid bằng phổ 1D, 2D-NMR, IR, HPLC.
    • Gracillin: Phân lập từ thân rễ; khẳng định cấu trúc diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosid qua phổ NMR, IR và HPLC so sánh.
    • Paris saponin II: Chiết xuất và tinh chế thành công từ phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa; cấu trúc xác định qua dữ liệu phổ IR, NMR, HPLC.
    • Polyphyllin D và Dioscin: Phân lập đồng thời từ thân rễ bằng phân đoạn sắc ký cột; nhận danh cấu trúc chính xác bằng dữ liệu đo phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, IR và TLC.
  3. Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập 05 chất chuẩn phòng thí nghiệm:
    • Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở hoàn chỉnh cho từng chất gồm: cảm quan, độ tan, định tính phổ IR và thời gian lưu HPLC, nhiệt độ nóng chảy, mất khối lượng do làm khô, giới hạn tạp chất liên quan và định lượng hoạt chất.
    • Thẩm định phương pháp định lượng và tạp chất: các phương pháp HPLC đều đạt yêu cầu về tính đặc hiệu, độ tuyến tính ($R^2 > 0,999$), độ đúng thu hồi đạt từ 98% đến 102%, độ lặp lại có RSD < 2,0%.
    • Kết quả kiểm tra độ đồng nhất lô đóng gói của 5 chất chuẩn đều cho thấy sự phân bố đồng đều giữa các lọ mẫu phân tích (không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các vị trí đóng gói).
    • Kết quả thử nghiệm liên phòng tại 2 PTN độc lập cho kết quả thống nhất cao; xác định giá trị hàm lượng công bố trên Giấy chứng nhận phân tích (CoA) cho cả 5 chất (tính theo nguyên trạng và trừ ẩm).
    • Kết quả theo dõi độ ổn định xác nhận các chất chuẩn giữ nguyên chất lượng và hàm lượng trong điều kiện bảo quản quy định.
  4. Ứng dụng các chất chuẩn thiết lập được:
    • Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời 8 saponin (paris saponin VII, D, H, VI, II, dioscin, gracillin và polyphyllin D) bằng HPLC.
    • Ứng dụng định lượng thành công hàm lượng các saponin trong các mẫu thân rễ, mẫu phần trên mặt đất, mẫu cao khô và dạng bào chế viên nang chứa Bảy lá một hoa.
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+
| SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TỪ BẢY LÁ MỘT HOA                                  |
| Dược liệu Bảy lá một hoa (Thân rễ, Phần trên mặt đất)                                              |
|   --> Chiết xuất cồn, phân bố lỏng - lỏng (phân đoạn n-BuOH)                                       |
|   --> Sắc ký cột phân lập (Silica gel, RP-18) & tinh chế                                            |
|   --> Nhận danh cấu trúc hóa học (1D/2D-NMR, FT-IR, MS, nhiệt độ nóng chảy)                         |
|   --> Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở & Thẩm định phương pháp HPLC (định lượng, tạp chất)                |
|   --> Đóng lọ & Đánh giá đồng nhất lô                                                              |
|   --> Đánh giá liên phòng thử nghiệm (2 PTN) & Tính toán giá trị CoA                               |
|   --> Theo dõi độ ổn định & Ứng dụng phân tích mẫu dược liệu, cao khô, chế phẩm viên nang          |
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích sâu các khía cạnh chuyên môn:

  • Lựa chọn hợp chất và chiến lược chiết xuất, phân lập: Luận án biện giải tính khoa học khi chọn 5 saponin đại diện cho cả hai nhóm cấu trúc aglycon chính của chi Paris là diosgenin (gracillin, paris saponin II, polyphyllin D, dioscin) và pennogenin (paris saponin H). Việc tận dụng phần trên mặt đất để phân lập paris saponin II mở ra hướng tiếp cận mới trong khai thác nguồn nguyên liệu phụ phẩm.
  • Xây dựng các phương pháp phân tích sắc ký:
    • Phương pháp 1: Phân tích đồng thời 4 chất (PS-VII, PS-VI, PS-II, polyphyllin D).
    • Phương pháp 2: Phân tích đồng thời 3 chất (PS-H, PS-II, gracillin).
    • Phương pháp 3: Phân tích polyphyllin D và dioscin.
    • Phương pháp 4: Phân tích đồng thời 8 saponin trên cùng một sắc ký đồ.
    • Luận án đánh giá các điều kiện sắc ký pha đảo, bước sóng hấp thụ tử ngoại cực đại ở vùng 203 nm là phù hợp với đặc trưng hấp thụ kém của khung saponin steroid không liên hợp.
  • Tiêu chuẩn hóa và thiết lập chất chuẩn: Thảo luận về tính đại diện và tính tin cậy của quy trình thử nghiệm liên phòng tại 2 phòng thử nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP/ISO 17025. Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của chất chuẩn như độ ẩm dư, nhiệt độ và bao bì đóng gói.
  • Ý nghĩa ứng dụng: Khẳng định các chất chuẩn đã thiết lập đáp ứng đầy đủ tiêu chí kỹ thuật để dùng làm chất đối chiếu phân tích trong kiểm nghiệm dược liệu và thành phẩm thuốc.

Kết quả và những đóng góp mới

Tổng hợp các kết quả thực nghiệm chính

Bảng tổng hợp các chất chuẩn được thiết lập từ cây Bảy lá một hoa

Tên chất chuẩn Khung Aglycon Bộ phận phân lập Phương pháp xác định cấu trúc Các chỉ tiêu chất lượng chính đã xây dựng Giá trị công bố trên CoA
Paris saponin H (PS-H) Pennogenin Thân rễ NMR, FT-IR, Điểm chảy, HPLC Cảm quan, Điểm chảy, Mất KL do làm khô, Tạp chất liên quan, Định lượng HPLC Đạt chuẩn phòng thí nghiệm (Đã cấp CoA)
Gracillin Diosgenin Thân rễ NMR, FT-IR, Điểm chảy, HPLC Cảm quan, Điểm chảy, Mất KL do làm khô, Tạp chất liên quan, Định lượng HPLC Đạt chuẩn phòng thí nghiệm (Đã cấp CoA)
Paris saponin II (PS-II) Diosgenin Phần trên mặt đất NMR, FT-IR, Điểm chảy, HPLC Cảm quan, Điểm chảy, Mất KL do làm khô, Tạp chất liên quan, Định lượng HPLC Đạt chuẩn phòng thí nghiệm (Đã cấp CoA)
Polyphyllin D Diosgenin Thân rễ NMR, FT-IR, Điểm chảy, HPLC Cảm quan, Điểm chảy, Mất KL do làm khô, Tạp chất liên quan, Định lượng HPLC Đạt chuẩn phòng thí nghiệm (Đã cấp CoA)
Dioscin Diosgenin Thân rễ NMR, FT-IR, Điểm chảy, HPLC Cảm quan, Điểm chảy, Mất KL do làm khô, Tạp chất liên quan, Định lượng HPLC Đạt chuẩn phòng thí nghiệm (Đã cấp CoA)

Bảng tổng hợp các phương pháp sắc ký HPLC được xây dựng và thẩm định

Phương pháp Đối tượng phân tích Pha tĩnh & Điều kiện Bước sóng phát hiện Ứng dụng trong nghiên cứu
Phương pháp 1 Đồng thời 4 saponin (PS-VII, PS-VI, PS-II, Polyphyllin D) Cột C18, Gradient ACN - Nước 203 nm Sơ bộ sàng lọc và định lượng mẫu dược liệu
Phương pháp 2 Đồng thời 3 saponin (PS-H, PS-II, Gracillin) Cột C18, Gradient ACN - Nước 203 nm Kiểm tra độ tinh khiết và định lượng chất chuẩn
Phương pháp 3 Polyphyllin D và Dioscin Cột C18, Gradient ACN - Nước 203 nm Kiểm tra chất lượng và đánh giá liên phòng
Phương pháp 4 Đồng thời 8 saponin (PS-VII, PS-D, PS-H, PS-VI, PS-II, Dioscin, Gracillin, Polyphyllin D) Cột C18, Gradient ACN - Nước tối ưu hóa 203 nm Phân tích toàn diện thân rễ, lá, cao khô và viên nang

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về khoa học và lý luận:
    • Cung cấp dữ liệu phổ học đầy đủ, có hệ thống ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, FT-IR) và tính chất lý hóa của 5 saponin steroid phân lập từ cây Bảy lá một hoa tại Việt Nam.
    • Chứng minh phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa chứa hàm lượng cao paris saponin II, thiết lập cơ sở khoa học cho việc tận dụng nguồn phụ phẩm thân lá để sản xuất chất chuẩn và dược liệu.
  2. Về thực tiễn:
    • Lần đầu tiên tại Việt Nam thiết lập thành công 05 chất chuẩn phòng thí nghiệm (Paris saponin H, Paris saponin II, Gracillin, Polyphyllin D, Dioscin) có đầy đủ tiêu chuẩn cơ sở, hồ sơ thẩm định liên phòng và Giấy chứng nhận phân tích (CoA).
    • Xây dựng và thẩm định 4 quy trình phân tích HPLC đặc hiệu, chính xác để định lượng và kiểm soát giới hạn tạp chất của các saponin trong Bảy lá một hoa.
    • Ứng dụng bộ chất chuẩn và phương pháp phân tích để đánh giá chất lượng các mẫu dược liệu tươi, dược liệu khô, cao khô và viên nang thành phẩm hỗ trợ điều trị ung thư vú.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Ứng dụng bộ chất chuẩn đã thiết lập vào công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu Bảy lá một hoa tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và các cơ sở kiểm nghiệm trên toàn quốc.
  • Đề xuất bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng saponin đặc trưng sử dụng các chất chuẩn này vào chuyên luận Dược điển Việt Nam trong các lần tái bản tiếp theo.
  • Tiếp tục theo dõi độ ổn định dài hạn của các lô chất chuẩn đã đóng gói.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu tập trung phân lập và thiết lập chất chuẩn ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa phát triển quy trình chiết xuất tinh chế ở quy mô pilot/công nghiệp.
  • Thử nghiệm liên phòng mới tiến hành giữa 02 phòng thử nghiệm để cấp chứng chỉ chuẩn phòng thí nghiệm (Working standard), chưa mở rộng mạng lưới liên phòng quốc tế để nâng cấp thành chất chuẩn quốc gia (National Reference Standard).
  • Dữ liệu độ ổn định mới theo dõi trong khung thời gian quy định của đề tài, cần tiếp tục bổ sung số liệu theo dõi lão hóa tự nhiên dài hạn.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô chiết xuất và phân lập để cung cấp số lượng lớn chất chuẩn cho thị trường kiểm nghiệm trong nước.
  • Tiếp tục hoàn thiện hồ sơ đề nghị công nhận 5 chất chuẩn trên thành Chất chuẩn Quốc gia.
  • Ứng dụng phương pháp phân tích đồng thời 8 saponin để khảo sát, phân loại hóa học các loài Paris thu hái từ các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam.
  • Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiểm nghiệm cho các dạng bào chế mới phát triển từ dịch chiết Bảy lá một hoa.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Hóa thực vật và Phân tích Dược phẩm: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về kỹ thuật chiết tách phân đoạn, kỹ thuật sắc ký cột phân lập saponin steroid và phương pháp giải phổ NMR cấu trúc mạch glycosid phức tạp.
  • Đối với cán bộ kiểm nghiệm và nghiên cứu viên tại các Viện Kiểm nghiệm: Cung cấp quy trình bài bản từ A đến Z về thiết lập chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu theo tiêu chuẩn ICH và ISO Guide (xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật, thẩm định quy trình phân tích định lượng và tạp chất, kiểm tra độ đồng nhất lọ, tổ chức đánh giá liên phòng và tính giá trị CoA).
  • Đối với các cơ quan quản lý dược và các nhà sản xuất dược phẩm: Cung cấp phương pháp sắc ký tin cậy và nguồn chất chuẩn đối chiếu để tiêu chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào và kiểm soát chất lượng các sản phẩm cao thuốc, viên nang chứa Bảy lá một hoa lưu hành trên thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã thiết lập thành công chất chuẩn cho những hợp chất nào?

Luận án đã phân lập, tinh chế và thiết lập chuẩn phòng thí nghiệm thành công cho 05 hợp chất saponin steroid gồm: Paris saponin H, Gracillin, Paris saponin II, Polyphyllin D và Dioscin.

2. Các hợp chất nghiên cứu được phân lập từ những bộ phận nào của cây Bảy lá một hoa?

Các hợp chất Paris saponin H, Gracillin, Polyphyllin D và Dioscin được phân lập từ bộ phận thân rễ; riêng Paris saponin II được phân lập từ phần trên mặt đất (thân lá) của cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis).

3. Quy trình thiết lập chất chuẩn trong luận án gồm các bước chính nào?

Quy trình gồm 7 bước chính: (1) Kiểm tra sơ bộ nguyên liệu; (2) Xác định cấu trúc hóa học bằng phổ NMR, FT-IR, MS và nhiệt độ nóng chảy; (3) Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và thẩm định phương pháp HPLC xác định tạp chất, định lượng; (4) Đóng gói và đánh giá độ đồng nhất lô; (5) Đánh giá liên phòng thử nghiệm tại 2 PTN độc lập; (6) Xác định giá trị công bố trên Giấy chứng nhận phân tích (CoA); (7) Theo dõi độ ổn định của chất chuẩn.

4. Luận án đã xây dựng bao nhiêu quy trình phân tích HPLC và có phương pháp nào phân tích đồng thời nhiều saponin không?

Luận án đã xây dựng 4 phương pháp phân tích HPLC, trong đó có Phương pháp 4 cho phép phân tích đồng thời 8 saponin steroid (paris saponin VII, paris saponin D, paris saponin H, paris saponin VI, paris saponin II, dioscin, gracillin và polyphyllin D) ở bước sóng 203 nm.

5. Dược điển Trung Quốc năm 2015 quy định kiểm soát chất lượng Bảy lá một hoa bằng những chất chuẩn nào?

Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng 4 chất đánh dấu gồm chonglou saponin I (polyphyllin D), chonglou saponin II (paris saponin II), chonglou saponin VI (paris saponin VI) và chonglou saponin VII (paris saponin VII), với quy định tổng hàm lượng không được ít hơn 0,60% tính theo dược liệu khô kiệt.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Cao Ngọc Anh đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu đề ra về việc phân lập, tinh chế và nhận danh cấu trúc 5 saponin steroid từ thân rễ và phần trên mặt đất của cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis) ở Việt Nam. Công trình đã xây dựng, thẩm định đầy đủ 4 phương pháp sắc ký HPLC đặc hiệu và thiết lập thành công 05 chất chuẩn phòng thí nghiệm (Paris saponin H, Paris saponin II, Gracillin, Polyphyllin D, Dioscin) có chứng chỉ phân tích (CoA) thông qua đánh giá liên phòng thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu góp phần chủ động nguồn chất đối chiếu, mở rộng quỹ chất chuẩn quốc gia và nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng dược liệu cũng như các chế phẩm thuốc từ Bảy lá một hoa tại Việt Nam.