ĐẶT VẤN ĐỀ Trong “Chiến lƣợc quốc gia phát triển ngành Dƣợc Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (đƣợc ban hành theo Quyết định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tƣớng Chính phủ) có nêu rõ phát huy thế mạnh, tiềm năng của Việt Nam để phát triển sản xuất thuốc từ dƣợc liệu. Trong chiến lƣợc này, mục tiêu cụ thể đến năm 2020 là phấn đấu sản xuất đƣợc 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nƣớc, thuốc sản xuất trong nƣớc chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dƣợc liệu chiếm 30%. Đồng thời, các sản phẩm từ dƣợc liệu (cao chuẩn, bột nguyên liệu, chiết xuất các loại tinh dầu, các hoạt chất tinh khiết) là một trong 5 nhóm sản phẩm chủ lực cũng đƣợc đề cập trong chiến lƣợc này. Dƣợc điển Việt Nam xuất bản lần thứ năm (năm 2017) có 372 chuyên luận về dƣợc liệu và thuốc từ dƣợc liệu, trong đó có 117 chuyên luận dùng chất chuẩn để định tính, định lƣợng thành phần hoạt chất có trong dƣợc liệu và các sản phẩm có chứa nó.
Bên cạnh đó, tiêu chuẩn chất lƣợng của nhiều sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu chƣa xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng các thành phần hoạt chất hoặc các chất đánh dấu, mà mới định tính so sánh với dƣợc liệu chuẩn và định lƣợng hỗn hợp toàn phần bằng các phƣơng pháp kém hoặc không đặc hiệu và không định lƣợng đƣợc các hợp chất chính, đặc trƣng, đƣợc coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn đối chiếu. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu đƣợc chiết xuất từ dƣợc liệu ngày càng trở nên cần thiết đối với công tác đảm bảo chất lƣợng thuốc, từ giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng, cũng nhƣ việc kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc lƣu hành trên thị trƣờng của cơ quan quản lý. Trƣớc yêu cầu ngày càng cao của công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng và Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh hàng năm vẫn từng bƣớc thiết lập, mở rộng quỹ chất chuẩn (bao gồm cả dƣợc liệu chuẩn và chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dƣợc liệu). Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện tại, cả hai Viện mới thiết lập đƣợc khoảng 200 dƣợc liệu chuẩn và 50 chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập từ dƣợc liệu.
Phần lớn những chất chuẩn khác cần thiết cho công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng dƣợc liệu, thuốc từ dƣợc liệu vẫn phải nhập từ nƣớc ngoài với chi phí cao, thời gian cung cấp tƣơng đối lâu và thủ tục nhập khẩu còn phức tạp. -1- Bảy lá một hoa (Paris polyphylla Sm.) là cây thuốc quý và hiếm ở Việt Nam. Với thành phần hóa học chính là saponin, Bảy lá một hoa đã đƣợc chứng minh có các tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thƣ [27],[49],[110], kích thích miễn dịch [83], cầm máu [103], giảm đau, chống viêm [36], chữa rắn độc cắn [1]. Với những tác dụng và công dụng quý nhƣ trên, Dƣợc điển Trung Quốc năm 2015 đã sử dụng 4 chất là chonglou saponin I (polyphyllin D), chonglou saponin II (paris saponin II), chonglou saponin VI (paris saponin VI) và chonglou saponin VII (paris saponin VII) làm 4 chất đánh dấu để kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này.
Tổng hàm lƣợng của 4 chất trên không đƣợc ít hơn 0,60% tính theo dƣợc liệu khô kiệt [82]. Ở Việt Nam, Bảy lá một hoa mới chỉ đƣợc dùng trong trong các bài thuốc dân gian mà chƣa đƣợc nghiên cứu một cách có hệ thống và bài bản cũng nhƣ chƣa xây dựng, thiết lập đƣợc các chất đánh dấu, các chất chuẩn để kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này và các sản phẩm có chứa nó. Vì vậy việc thiết lập các chất chuẩn đƣợc chiết xuất, phân lập và tinh chế từ cây Bảy lá một hoa là nhiệm vụ cần thiết để góp phần chủ động nguồn cung cấp chất đối chiếu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lƣợng của dƣợc liệu này và những sản phẩm có chứa nó, góp phần mở rộng quỹ chất chuẩn dùng trong ngành Kiểm nghiệm thuốc ở Việt Nam. Xuất phát từ những lý do nêu trên, đề tài “Thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất, tinh chế từ cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam” đƣợc thực hiện với các mục tiêu là: 1.
Phân lập và tinh chế một số hợp chất trong các bộ phận của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam đủ tinh khiết để làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Xây dựng phương pháp phân tích một số saponin phục vụ cho việc thiết lập các chất chuẩn và khảo sát hàm lượng của các hợp chất nghiên cứu có trong một số mẫu cây Bảy lá một hoa. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu và thiết lập chuẩn phòng thí nghiệm cho các nguyên liệu đã phân lập, tinh chế được. -2- Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.
CÂY BẢY LÁ MỘT HOA 1. Đặc điểm thực vật và phân bố Bảy lá một hoa còn có các tên gọi khác là thất diệp nhất chi hoa, tảo hƣu, cúa dô (H’Mông). Tên khoa học là Paris polyphylla Sm. thuộc họ Trọng lâu (Trilliaceae), chi Paris [1].
Cây Bảy lá một hoa a) Phần trên mặt đất b,c) Lá và hoa d) Thân rễ Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris là: Phân giới thực vật bậc cao Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) -3- Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Loa kèn (Lilidae) Bộ củ nâu (Dioscoreales) Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae) Chi Bảy lá một hoa, Tảo hƣu (Paris) [2],[6]. Trên thế giới, đến nay ngƣời ta đã biết khoảng 22 loài [7] thuộc chi Paris, phân bố ở vùng nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nepal, Pakistan, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam), châu Âu và châu Mỹ; trong đó có hai loài đƣợc quan tâm nhất là Paris yunnanensis Franch và Paris chinensis Franch [1], [5], [6]. Theo thông tin cập nhật trên trang “The Plant List”, đến năm 2020 đã có 128 loài thuộc chi Paris đã đƣợc chấp nhận tên khoa học. Ở Việt Nam, theo tài liệu tham khảo [5] thì chi Paris có 6 loài gồm: (1) Paris delavayi Franch.
(Trọng lâu kim tiền); (2) Paris polyphylla Sm. (Trọng lâu nhiều lá); (3) Paris hainanensis Merr. (Trọng lâu hải nam); (4) Paris yunnanensis Franch. (Trọng lâu vân nam); (5) Paris chinensis Franch.
(Bảy lá một hoa, Tảo hƣu); (6) Paris fargesii Franch. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã bổ sung thêm thành phần loài thuộc chi Paris ở Việt Nam [10] gồm: (7) Paris vietnamensis (Takht.Li; (8) Paris caobangensis Y.Zhou; (9) Paris cronquistii (Takht.Li; (10) Paris xichouensis (H.Zhou; (11) Paris dunniana H. Đặc điểm thực vật Cây thảo nhiều năm, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Cây cao 40 - 170 cm.
Thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, chia thành nhiều đốt, có những ngấn ngang và sẹo to, đƣờng kính khoảng 2- 8 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh. Lá 5 - 8, xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, thuôn hình trứng ngƣợc, kích thƣớc 20 - 25 5 - 7 cm ; có 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 cm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, -4- thẳng đứng. Đài 5 - 6, dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thƣớc 5 - 8 × 1,5 - 2,5 cm, màu lục.
Cánh hoa 5 - 6, màu vàng, dạng dải, kích thƣớc 4,5 - 6 0,1 cm, bằng nhau. Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm. Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhuỵ 5 - 6. Quả nang, mở ở lƣng ô.
Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [1],[6],[9]. Phân bố Bảy lá một hoa mọc nơi đất ẩm, nhiều mùn, gần bờ nƣớc, khe suối hay hốc đá, dƣới tán rừng kín thƣờng xanh. Mùa ra hoa tháng 3-7, mùa quả tháng 8-12. Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Sơn La (Mộc Châu), Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong), Lai Châu (Phong Thổ), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu, Pà Cò).
Ngoài ra, Bảy lá một hoa còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [1], [4], [6]. Thành phần hóa học của cây Bảy lá một hoa Nghiên cứu về thành phần hóa học của Bảy lá một hoa cho thấy saponin là thành phần chính, ngoài ra còn có các nhóm chất khác nhƣ anthraquinon, flavonoid, sterol, polyacetylen và một số hợp chất phenolic. Trên thế giới Các hợp chất saponin Từ năm 1973 đến nay đã có khoảng 150 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ cây Bảy lá một hoa. Cấu trúc của các hợp chất này chủ yếu thuộc nhóm saponin steroid khung spirostan (diosgenin, pennogenin), pseudo-spirostan, furostan, pregnan và saponin triterpenoid.
Các hợp chất saponin steroid - Các hợp chất saponin spirostan: Các saponin nhóm này thƣờng có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin hoặc là các dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C- 24 hoặc C-27. Các saponin này có từ 1 đến 4 đƣờng và thƣờng liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số saponin pennogenin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 đƣợc phân lập bởi Chen và cộng sự [22],[23],[29] từ loài -5- Paris axialis H.Li và Paris polyphylla var. Theo thống kê đến thời điểm hiện tại có trên 60 hợp chất nhóm này đƣợc phân lập từ chi Paris, ký hiệu từ 1-63 (Hình 1.
Cấu trúc của các saponin spirostan (1-63) phân lập từ chi Paris. - Các saponin furostan: Các saponin furostan (Hình 1.3) có cấu trúc tƣơng tự nhƣ các saponin spirostan nhƣng bị phản ứng bởi enzym mở vòng ở vòng F và bị đƣờng hóa tại C-26. Cấu trúc dạng này lần đầu tiên phân lập từ chi Paris bởi Matsuda và cộng sự năm 2003 [74] là protogracillin. Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại khung E.
Cấu trúc của các saponin furostan (64-86) phân lập từ chi Paris - Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan: Chen và cộng sự lần đầu tiên phân lập đƣợc hai nhóm saponin pseudo- spirostanol và pregnan từ Paris polyphylla var.
