Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Đào Nguyệt Sương Huyền với đề tài "Nghiên cứu cải tiến qui trình tổng hợp nguyên liệu mesna và ứng dụng bào chế thuốc tiêm" thuộc chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm & Bào chế thuốc (Mã số: 62720402), được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Đình Luyện và PGS. Nguyễn Văn Hân (bảo vệ năm 2018).

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, các thuốc chống ung thư nhóm oxazaphosphorin như ifosfamid (IFM) và cyclophosphamid (CYP) được chỉ định trong nhiều phác đồ điều trị ung thư nhưng có độc tính cao trên đường tiết niệu, gây viêm bàng quang chảy máu do chất chuyển hóa acrolein. Mesna (natri 2-mercaptoethansulfonat) là hoạt chất giải độc đặc hiệu nhờ nhóm thiol (-SH) liên kết trực tiếp với acrolein tạo thành thioether trơ tan trong nước và đào thải ra ngoài mà không làm suy giảm hoạt lực chống ung thư của IFM và CYP. Mesna có mặt trong Danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam với hai dạng bào chế là viên nén (400 mg, 600 mg) và dung dịch tiêm 100 mg/ml. Tuy nhiên, toàn bộ nguyên liệu và chế phẩm mesna dùng trong nước đều phải nhập khẩu. Các quy trình tổng hợp mesna đã công bố trên thế giới chủ yếu sử dụng nguyên liệu ban đầu là 1,2-dibromoethan đắt tiền hoặc trải qua nhiều giai đoạn phản ứng phức tạp với hiệu suất thấp và khó loại tạp chất (đặc biệt là tạp chất dimesna do nhóm thiol rất dễ bị oxy hóa). Do đó, việc nghiên cứu cải tiến quy trình cũ và thiết kế các con đường tổng hợp mới từ nguồn nguyên liệu sẵn có, kết hợp xây dựng công thức dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml đạt tiêu chuẩn chất lượng là một yêu cầu thực tiễn của ngành dược trong nước.

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số như sau:

  1. Thiết kế được phương pháp mới tổng hợp mesna.
  2. Xây dựng được qui trình tổng hợp mesna qui mô 200 g/mẻ.
  3. Đánh giá được độc tính cấp, độ ổn định của nguyên liệu mesna.
  4. Xây dựng được công thức bào chế và đề xuất tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là hoạt chất mesna (nguyên liệu tổng hợp hóa học, các chất trung gian) và dạng thuốc dung dịch tiêm mesna nồng độ 100 mg/ml. Phạm vi nghiên cứu bao gồm thực nghiệm tổng hợp hóa dược từ chất ban đầu 1,2-dicloroethan tại phòng thí nghiệm; nâng cấp quy mô mẻ phản ứng lên 100 g/mẻ và 200 g/mẻ; kiểm nghiệm cấu trúc, độ tinh khiết và độ ổn định theo tiêu chuẩn Dược điển Anh (BP 2015); thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng; và phát triển công thức, quy trình bào chế, đánh giá độ ổn định của dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu trong luận án điểm lại các hướng nghiên cứu tổng hợp và kiểm nghiệm mesna, phân chia theo các nhóm phản ứng và phương pháp phân tích:

  1. Tổng hợp muối natri 2-halogenoethansulfonat (tiền chất của mesna):

    • Hướng đi từ 1,2-dibromoethan: C. Schramm và cộng sự (1950) đun hồi lưu 1,2-dibromoethan với natri sulfit trong ethanol 95% và nước (hiệu suất 78,6%); C. Marvel và cộng sự (2003) cải tiến phản ứng Strecker đạt hiệu suất 78–90%; K. Kawami và cộng sự (2004) tổng hợp từ natri isethionat và acid hydrobromic 47% (hiệu suất 48%). Nhược điểm của hướng này là giá thành 1,2-dibromoethan cao và dễ tạo sản phẩm phụ disulfonat do brom hoạt động mạnh.
    • Hướng đi từ 1,2-dicloroethan: E. Otto (1932) phản ứng 1,2-dicloroethan với natri sulfit; C. Schramm (1954) đun hồi lưu 28 giờ (hiệu suất 42% với natri sulfit và 64,3% với kali sulfit); R. Bai và cộng sự (2013) đun hồi lưu 22 giờ có bột đồng xúc tác đạt hiệu suất 81%.
    • Hướng đi từ carbyl sulfat hoặc ethylen clorobromid: C. Schramm (1954) dùng ethylen clorobromid (hiệu suất 89,1–90,7%); W. Jenkins (1959) và A. Roger (1959) nhiệt phân carbyl sulfat với natri clorid ở 190–195 °C (hiệu suất 36–90%).

  2. Các phương pháp tổng hợp mesna đã công bố:

    • Phương pháp qua trung gian muối thiouroni (phương pháp kinh điển): C. Schramm (1954) và Jarý cùng cộng sự (1985) cho natri 2-bromoethansulfonat phản ứng với thioure tạo 2-S-thiouroni ethansulfonat, sau đó amoniac phân tạo guanidini 2-mercaptoethansulfonat, rồi sắc ký trao đổi ion qua nhựa cation (Amberlite IR-120 hoặc Ostion KS) để thu acid 2-mercaptoethansulfonic, cuối cùng trung hòa bằng NaOH để tạo mesna.
    • Phương pháp qua trung gian thioester: A. Reiner và cộng sự (1983) cho natri 2-bromoethansulfonat phản ứng với acid thiobenzoic tạo natri benzoylthioethansulfonat (hiệu suất 60,5%), sau đó amoniac phân bằng NH₄OH ở 50 °C thu mesna (hiệu suất 84%); Wang XinJin (Trung Quốc) thủy phân dẫn chất acetyl của mesna trong môi trường HCl/ethanol rồi trung hòa về pH 5 (hiệu suất 72–82,3%).
    • Phương pháp qua trung gian muối xanthat: C. Schramm (1955) cho natri 2-bromoethansulfonat phản ứng với kali ethylxanthat rồi xử lý bằng NH₄OH (hiệu suất 41%); J. Leveque và cộng sự (2006) sử dụng tác nhân oxy hóa lauroyl peroxid trong 3 ngày để tạo trung gian dinatri 2-(2-sulfo-ethylsulfanylcarbonylsulfanyl)-ethansulfonat, sau đó thủy phân bằng NaOH 1N ở 80 °C.
    • Phương pháp khác: Kawami K. (2006) và một số tác giả sử dụng NaSH hoặc H₂S phản ứng với natri vinylsulfonat hoặc natri 2-bromoethansulfonat trong môi trường kiềm (chỉ tạo mesna làm chất trung gian để oxy hóa tiếp thành dimesna).

  3. Các nghiên cứu về phương pháp tạo nhóm thiol và phân tích định lượng mesna:

    • Tổng hợp nhóm thiol: từ trithiocarbonat (D. Greco, A. Ishii, W. Charles, Taguchi); từ muối Bunte (Weiss & Sokol, Kice, Vermeulen & Collin); từ thioester (Bobbio); từ hợp chất chứa lưu huỳnh khác (M. Madison, Hopkins).
    • Định lượng mesna: Chuẩn độ iod đo thể tích (Dược điển Anh BP 2015, Dược điển Mỹ USP 38); quang phổ UV-Vis qua tạo dẫn xuất màu (Skowen, Capita-Vallvey, Lin Ling); HPLC với các đầu dò UV, huỳnh quang hoặc khối phổ (Rizk, D. Salman).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Luận án tập trung giải quyết sự phụ thuộc vào nguyên liệu đắt tiền (chuyển đổi hoàn toàn sang 1,2-dicloroethan), khắc phục nhược điểm của phương pháp kinh điển (quá nhiều bước, mất 5 ngày, hiệu suất thấp do phải dùng cột trao đổi ion), và thiết kế các con đường hóa học mới rút ngắn thời gian, nâng cao hiệu suất tổng hợp nguyên liệu mesna đạt tiêu chuẩn BP 2015, đồng thời khắc phục độ kém ổn định (dễ bị oxy hóa tạo tạp D - dimesna) trong quá trình bào chế dung dịch tiêm 100 mg/ml.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử ($S_N2$) giữa 1,2-dicloroethan và ion sulfit ($SO_3^{2-}$) theo cơ chế Strecker tạo natri 2-cloroethansulfonat.
  • Lý thuyết tạo nhóm thiol (-SH) từ dẫn xuất halogen thông qua 4 con đường hóa học:
    1. Con đường I (Thiouroni): Thế $S_N2$ bởi thioure tạo muối 2-S-thiouroni ethansulfonat, amoniac phân tạo muối guanidini, sau đó trao đổi cation để chuyển thành mesna.
    2. Con đường II (Thioester): Thế $S_N2$ bởi natri thiobenzoat tạo natri benzoylthioethansulfonat, tiếp theo là phản ứng amoniac phân cắt liên kết S-CO.
    3. Con đường III (Muối Bunte): Thế $S_N2$ bởi ion thiosulfat ($S_2O_3^{2-}$) tạo muối Bunte (natri S-(2-sulfonatoethyl)thiosulfat), sau đó thủy phân trong môi trường acid vô cơ.
    4. Con đường IV (Trithiocarbonat): Thế $S_N2$ bởi natri trithiocarbonat ($Na_2CS_3$) tạo dẫn xuất monoalkyl trithiocarbonat (natri 2-(sulfoethyl)trithiocarbonat), sau đó thủy phân chọn lọc trong môi trường acid giải phóng khí $CS_2$ và $H_2S$ để thu trực tiếp mesna.
  • Lý thuyết về độ ổn định và cơ chế oxy hóa của nhóm thiol: Nhóm thiol bị oxy hóa bởi oxy không khí xúc tác bởi ion kim loại nặng ($Fe^{3+}, Cu^{2+}, Pb^{2+}$), pH môi trường và nhiệt độ tạo liên kết disulfid (dimesna / tạp D). Cơ chế bảo vệ dung dịch tiêm dựa trên việc kiểm soát pH (khoảng 7,0–8,0), loại trừ oxy hòa tan bằng sục khí nitơ, và tạo phức chelat cố định ion kim loại vết bằng dinatri edetat ($Na_2EDTA$).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp tổng hợp và xác định cấu trúc: Tổng hợp hóa học trong hệ thống phản ứng có hồi lưu và kiểm soát nhiệt độ, áp suất; tinh chế sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại phân đoạn theo dung môi (nước, ethanol, methanol, isopropanol). Cấu trúc của các chất trung gian và mesna được xác định bằng phổ hồng ngoại (IR, đo số sóng $\nu_{max}$ từ 4000 đến 400 cm⁻¹), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) và xác định nhiệt độ nóng chảy ($t^o_{nc}$).
  • Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu: Kiểm nghiệm đầy đủ các chỉ tiêu theo chuyên luận Mesna của Dược điển Anh (BP 2015): cảm quan, độ tan, độ trong và màu sắc dung dịch, mất khối lượng do làm khô, giới hạn clorid, sulfat, dinatri edetat, kim loại nặng, tạp chất liên quan (tạp A, B, C, D, E và các tạp khác bằng phương pháp HPLC và sắc ký lớp mỏng SKLM), và định lượng hàm lượng mesna khan bằng phương pháp chuẩn độ thể tích với dung dịch iod 0,05 M (chỉ thị hồ tinh bột).
  • Phương pháp định lượng mesna bằng HPLC: Phát triển quy trình định lượng mesna trên hệ thống HPLC sử dụng cột pha đảo RP amid C16 (150 mm $\times$ 4,6 mm; 5 $\mu$m), pha động đệm phosphat pH 3,0 – methanol, bước sóng phát hiện UV 210 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút.
  • Phương pháp thử độc tính cấp: Xác định $LD_{50}$ của nguyên liệu mesna tổng hợp theo đường uống và đường tiêm tĩnh mạch trên chuột nhắt trắng khỏe mạnh chủng Swiss (trọng lượng 18–22 g) theo phương pháp Litchfield–Wilcoxon hoặc Behrens.
  • Phương pháp bào chế và đánh giá thuốc tiêm: Bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml trong điều kiện phòng thí nghiệm; khảo sát các yếu tố ảnh hưởng gồm pH, loại chất điều chỉnh pH, nồng độ dinatri edetat, thời gian và nhiệt độ hấp tiệt trùng (100 °C và 121 °C), ảnh hưởng của ánh sáng và sục khí nitơ.
  • Phương pháp đánh giá độ ổn định: Theo dõi độ ổn định của nguyên liệu và thành phẩm thuốc tiêm ở điều kiện dài hạn (25 $\pm$ 2 °C, độ ẩm 60 $\pm$ 5% RH) và điều kiện lão hóa cấp tốc (40 $\pm$ 2 °C, độ ẩm 75 $\pm$ 5% RH) theo hướng dẫn của Hội nghị hòa hợp quốc tế (ICH); xử lý thống kê số liệu để dự đoán tuổi thọ.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về mesna, các phương pháp tổng hợp và bào chế thuốc tiêm

Chương 1 tổng hợp các tài liệu lý thuyết và thực nghiệm về đặc tính hóa lý, dược lý học và ứng dụng lâm sàng của mesna. Mesna có công thức phân tử $C_2H_5NaO_3S_2$, khối lượng phân tử 164,17 đvC, là bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm, tan tự do trong nước. Về dược động học, khi tiêm tĩnh mạch, thuốc có thể tích phân bố 0,652 l/kg, độ thanh thải huyết tương 1,23 l/kg/giờ, bài tiết nhanh qua nước tiểu trong vòng 2–4 giờ ở dạng mesna tự do và dimesna. Về dược lý, mesna bất hoạt acrolein thông qua phản ứng cộng ái nhân vào liên kết đôi và phản ứng với 4-hydroxyoxazaphosphorin, đồng thời làm tăng đào thải cystein giúp bảo vệ biểu mô bàng quang.

Chương này cũng phân loại chi tiết các phản ứng tổng hợp natri 2-halogenoethansulfonat và 3 con đường tổng hợp mesna đã công bố (qua muối thiouroni, thioester, xanthat), các phản ứng tạo nhóm thiol nói chung, các yếu tố ảnh hưởng đến sự oxy hóa nhóm thiol (tác nhân oxy hóa, ion kim loại, pH, amin, bức xạ), và nguyên lý chống oxy hóa khi xây dựng công thức thuốc tiêm chứa dược chất thiol.

Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích (AR) hoặc dược dụng: 1,2-dicloroethan, natri sulfit, thioure, acid thiobenzoic, natri thiosulfat, carbon disulfid, natri sulfid, dinatri edetat, các chất chuẩn mesna và tạp chất chuẩn đối chiếu (tạp A, B, C, D, E). Trang thiết bị chính bao gồm hệ thống sắc ký lỏng HPLC đầu dò UV-Vis, máy đo quang phổ tử ngoại - khả kiến UV-Vis, máy quang phổ hồng ngoại FTIR, máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR 500 MHz, máy đo khối phổ ESI-MS, máy đo pH, tủ thử độ ổn định vi khí hậu, thiết bị lọc vô trùng và nồi hấp tiệt trùng áp suất cao. Chương này quy định các bước tiến hành thực nghiệm tổng hợp hóa học, quy trình tinh chế, thẩm định phương pháp phân tích HPLC, phương pháp xác định $LD_{50}$ trên động vật thực nghiệm và quy trình theo dõi độ ổn định theo ICH.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được trong luận án, chia thành các nội dung chính:

1. Khảo sát các con đường tổng hợp mesna ở quy mô phòng thí nghiệm

  • Tổng hợp natri 2-cloroethansulfonat (chất 2) từ 1,2-dicloroethan (chất 1): Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng cho thấy tỷ lệ mol tối ưu giữa chất 1 và $Na_2SO_3$ là 3,0 : 1; tỷ lệ thể tích dung môi ethanol 96% : nước là 1 : 1,2; nhiệt độ phản ứng hồi lưu 85–90 °C trong 22 giờ; tinh chế bằng phương pháp chiết nóng với ethanol 96%, hiệu suất tạo chất 2 đạt 80,5–82,0%.
  • Con đường I (Qua trung gian muối thiouroni):
    • Phản ứng giữa chất 2 và thioure tạo 2-S-thiouroni ethansulfonat (chất 3): tỷ lệ mol 1 : 1, nhiệt độ 95–100 °C trong 4 giờ, hiệu suất đạt 72,4%.
    • Phản ứng amoniac phân chất 3 tạo guanidini 2-mercaptoethansulfonat (chất 4): nhiệt độ 60–65 °C, tỷ lệ mol $NH_3$ : chất 3 = 4 : 1, thời gian 2 giờ, hiệu suất đạt 85,2%.
    • Chuyển hóa chất 4 thành mesna: qua cột trao đổi cation Amberlite IR-120 thu acid mercaptoethansulfonic, trung hòa bằng NaOH đến pH 6,5–7,0, tinh chế bằng ethanol thu mesna với hiệu suất giai đoạn đạt 58,6%. Hiệu suất toàn quy trình con đường I tính từ chất 2 đạt 36,1%.
  • Con đường II (Qua trung gian thioester):
    • Tổng hợp natri benzoylthioethansulfonat (chất 5) từ chất 2 và acid thiobenzoic ở 85–90 °C trong 16 giờ, hiệu suất đạt 62,3%.
    • Thủy phân amoniac chất 5 ở 50 °C trong 3,5 giờ có sục khí nitơ, tinh chế bằng methanol/ethanol, hiệu suất giai đoạn đạt 78,5%. Hiệu suất toàn bộ con đường II tính từ chất 2 đạt 48,9%.
  • Con đường III (Phương pháp mới qua trung gian muối Bunte):
    • Phản ứng giữa chất 2 và $Na_2S_2O_3\cdot 5H_2O$ tạo muối Bunte (chất 6): tỷ lệ mol 1 : 1,1 trong dung môi nước : ethanol 96% (1 : 1), đun hồi lưu 6 giờ, hiệu suất đạt 76,8%.
    • Thủy phân chất 6 trong môi trường acid vô cơ ($HCl$ hoặc $H_2SO_4$): hiệu suất tạo mesna chỉ đạt 38,2% do phản ứng phụ tạo disulfid và sản phẩm phân hủy không hoàn toàn. Hiệu suất toàn quy trình con đường III đạt 29,3%.
  • Con đường IV (Phương pháp mới qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat):
    • Điều chế natri trithiocarbonat ($Na_2CS_3$) từ $Na_2S$ và $CS_2$ trong nước.
    • Phản ứng giữa chất 2 và $Na_2CS_3$ tạo natri 2-(sulfoethyl)trithiocarbonat (chất 7): tỷ lệ mol $Na_2CS_3$ : chất 2 = 1,1 : 1, nhiệt độ 70–75 °C trong 3 giờ, hiệu suất đạt 84,6%.
    • Thủy phân chất 7 trong môi trường acid ($HCl$ 36% điều chỉnh về pH 1,0–1,5) ở 80–85 °C trong 2 giờ giải phóng $CS_2$ và $H_2S$, sau đó trung hòa bằng NaOH đến pH 6,5, cất thu hồi nước dưới áp suất giảm, tinh chế bằng ethanol 96% thu mesna kết tinh màu trắng với hiệu suất giai đoạn đạt 81,2%. Hiệu suất toàn quy trình con đường IV tính từ chất 2 đạt 68,7%.

Bảng tổng hợp so sánh 4 con đường tổng hợp mesna từ natri 2-cloroethansulfonat:

Tiêu chí so sánh Con đường I (Thiouroni) Con đường II (Thioester) Con đường III (Muối Bunte) Con đường IV (Trithiocarbonat)
Số giai đoạn phản ứng 3 giai đoạn 2 giai đoạn 2 giai đoạn 2 giai đoạn
Hóa chất/tác nhân chính Thioure, $NH_4OH$, nhựa trao đổi ion Acid thiobenzoic, $NH_4OH$ $Na_2S_2O_3$, dung dịch acid $Na_2S$, $CS_2$, dung dịch acid
Tính sẵn có của hóa chất Sẵn có, thông dụng Đắt tiền, khó mua Rất sẵn có, rẻ tiền Sẵn có, rẻ tiền
Thời gian thực hiện quy trình 4–5 ngày 2 ngày 1,5 ngày 1–1,5 ngày
Hiệu suất toàn quy trình (%) 36,1% 48,9% 29,3% 68,7%
Độ tinh khiết sản phẩm thô Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Nhiều sản phẩm phụ Cao, dễ tinh chế

2. Nâng cấp quy mô tổng hợp và tinh chế mesna đạt tiêu chuẩn BP 2015

Từ kết quả so sánh, con đường IV được lựa chọn để nâng cấp quy mô mẻ:

  • Quy mô 100 g/mẻ: Thực nghiệm lặp lại 3 mẻ, hiệu suất trung bình đạt 67,8 $\pm$ 1,2%, sản phẩm sau tinh chế bằng ethanol đạt hàm lượng 99,1–99,8% tính theo chế phẩm khan.
  • Quy mô 200 g/mẻ: Thực hiện thành công quy trình tổng hợp natri 2-(sulfoethyl)trithiocarbonat từ 250 g natri 2-cloroethansulfonat và thủy phân tạo mesna. Thu được 168,5 g mesna nguyên liệu (hiệu suất 68,2%), hàm lượng hoạt chất đạt 99,4%, các chỉ tiêu tạp chất A, B, C, E đều < 0,1%, tạp D (dimesna) < 1,5%, kim loại nặng < 10 ppm, clorid < 250 ppm, sulfat < 500 ppm, mất khối lượng do làm khô < 0,8%, đạt toàn bộ chỉ tiêu chất lượng của Dược điển Anh BP 2015.

3. Đánh giá độc tính cấp và độ ổn định của nguyên liệu mesna

  • Độc tính cấp: Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng xác định giá trị $LD_{50}$ của mesna tổng hợp theo con đường IV:
    • Đường uống: $LD_{50} = 4415$ mg/kg (khoảng tin cậy 95%: 4120–4730 mg/kg).
    • Đường tiêm tĩnh mạch: $LD_{50} = 1520$ mg/kg (khoảng tin cậy 95%: 1410–1640 mg/kg). Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các dữ liệu độc tính đã công bố quốc tế đối với mesna chuẩn.
  • Độ ổn định nguyên liệu: Theo dõi trong 12 tháng ở điều kiện dài hạn và 6 tháng ở điều kiện cấp tốc. Nguyên liệu đóng gói trong túi polyethylene hàn kín đặt trong lọ thủy tinh màu hổ phách duy trì hàm lượng hoạt chất > 98,5%, tỷ lệ tạp D tăng không đáng kể (từ 0,6% lên 1,4% ở điều kiện cấp tốc), dự đoán tuổi thọ nguyên liệu đạt trên 36 tháng.

4. Xây dựng công thức và quy trình bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml

  • Thẩm định phương pháp định lượng mesna và tạp D bằng HPLC: Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ 50–1000 $\mu$g/ml ($R^2 = 0,9998$), độ lặp lại $RSD < 1,5%$, độ thu hồi đạt 98,5–101,2%.
  • Khảo sát các yếu tố công thức:
    • Ảnh hưởng của pH: Mesna ổn định nhất trong khoảng pH 7,0–8,0; ở pH < 6,0 tốc độ tạo disulfid tăng khi có mặt oxy; ở pH > 8,5 phản ứng tự oxy hóa tăng mạnh. Dung dịch được đệm/chỉnh pH bằng NaOH 1M và HCl 1M.
    • Ảnh hưởng của chất chống oxy hóa/khóa kim loại: Bổ sung dinatri edetat ($Na_2EDTA$) ở nồng độ 0,25 mg/ml (0,025% w/v) có tác dụng ức chế rõ rệt phản ứng oxy hóa xúc tác bởi kim loại nặng vết so với các mẫu không có edetat.
    • Ảnh hưởng của khí bảo vệ: Sục khí nitơ tinh khiết trước và trong quá trình pha chế, đóng ống giúp giảm hàm lượng oxy hòa tan xuống dưới 1 ppm, hạn chế tối đa sự gia tăng của tạp D trong quá trình tiệt trùng.
    • Chế độ tiệt trùng: Khảo sát tiệt trùng nhiệt ẩm ở 121 °C trong 15 phút và 100 °C trong 30 phút; chế độ 100 °C trong 30 phút hoặc hấp 121 °C trong 15 phút (với điều kiện kiểm soát nồng độ oxy và edetat) giữ cho hàm lượng mesna đạt > 98,0% và tạp D < 2,0%.
  • Đề xuất công thức hoàn chỉnh cho 1 ml dung dịch tiêm:
    • Mesna (tính theo chế phẩm khan): 100,0 mg
    • Dinatri edetat ($Na_2EDTA$): 0,25 mg
    • Dung dịch NaOH 1M / HCl 1M: vừa đủ điều chỉnh pH 7,2 – 7,8
    • Nước cất pha tiêm (đã sục khí nitơ): vừa đủ 1,0 ml.
  • Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm: Theo dõi các lô thuốc tiêm sản xuất từ nguyên liệu của con đường IV và con đường I; so sánh song song với thuốc tiêm đối chứng Uromitexan 100 mg/ml (Baxter). Kết quả theo dõi 12 tháng điều kiện thường và 6 tháng cấp tốc cho thấy chế phẩm ổn định về cảm quan (dung dịch trong suốt, không màu), pH ổn định (7,2–7,6), hàm lượng hoạt chất đạt 97,5–101,5%, tạp D < 3,0%, độ vô khuẩn và nội độc tố vi khuẩn đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm. Tuổi thọ dự đoán của thuốc tiêm đạt ít nhất 24 tháng.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 phân tích sâu về cơ chế hóa học và tính khả thi công nghệ:

  • Biện luận việc thay thế hoàn toàn 1,2-dibromoethan bằng 1,2-dicloroethan: Khắc phục sự tạo thành dẫn chất phụ disulfonat do 1,2-dicloroethan có tính phản ứng chọn lọc một nhóm clorid tốt hơn, giá thành rẻ hơn gấp nhiều lần.
  • Giải thích cơ chế các con đường tổng hợp: Con đường I tạo sản phẩm phụ dimesna trong giai đoạn amoniac phân và việc dùng cột trao đổi ion tốn nhiều thời gian, lượng nước thải lớn; Con đường II vướng phải giá thành cao của acid thiobenzoic; Con đường III tạo hỗn hợp nhiều sản phẩm trung gian phức tạp khi thủy phân muối Bunte. Con đường IV qua monoalkyl trithiocarbonat là tối ưu nhất vì phản ứng xảy ra êm dịu, chất trung gian dễ thủy phân hoàn toàn trong môi trường acid giải phóng khí, sản phẩm mesna dễ kết tinh làm sạch bằng dung môi ethanol, nâng hiệu suất toàn bộ quy trình lên 68,7%.
  • Biện luận các giải pháp công nghệ nâng cao độ ổn định của thuốc tiêm mesna 100 mg/ml: Sự phối hợp đồng thời của 3 yếu tố (kiểm soát pH 7,2–7,8; thêm dinatri edetat 0,025% để chelat hóa ion kim loại; sục khí nitơ loại oxy) đã giải quyết triệt để vấn đề phân hủy của dược chất thiol trong dạng dung dịch tiêm nước.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về lý luận và khoa học

  1. Đã nghiên cứu có hệ thống và so sánh thực nghiệm 4 con đường hóa học tổng hợp mesna từ nguyên liệu ban đầu 1,2-dicloroethan.
  2. Thiết kế và chứng minh thành công cơ chế của 2 con đường mới tổng hợp mesna: qua trung gian muối Bunte (con đường III) và qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat (con đường IV). Trong đó, con đường tổng hợp qua monoalkyl trithiocarbonat là hướng tiếp cận mới chưa từng được công bố trước đó trong tổng hợp mesna, giúp rút ngắn số bước phản ứng và loại bỏ sự cần thiết của cột nhựa trao đổi ion.
  3. Làm sáng tỏ động học quá trình oxy hóa phân hủy mesna trong dung dịch nước dưới tác động đồng thời của pH, oxy hòa tan, ion kim loại vết và nhiệt độ tiệt trùng.

Đóng góp mới về thực tiễn và công nghệ

  1. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình công nghệ tổng hợp và tinh chế nguyên liệu mesna qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat ở quy mô 200 g/mẻ, với hiệu suất toàn quy trình đạt 68,2%, sản phẩm thu được đạt toàn bộ các tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Dược điển Anh (BP 2015).
  2. Xây dựng được phương pháp định lượng và kiểm soát tạp chất liên quan (đặc biệt là tạp D) của mesna bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có độ chọn lọc và độ chính xác cao.
  3. Xây dựng thành công công thức và quy trình bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml quy mô phòng thí nghiệm, sản phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở tương đương với biệt dược gốc Uromitexan 100 mg/ml của hãng Baxter, có độ ổn định dự đoán trên 24 tháng.

Đề xuất và kiến nghị

  • Hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu mesna và dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml để phục vụ công tác kiểm nghiệm và đăng ký thuốc.
  • Triển khai nâng cấp quy mô tổng hợp nguyên liệu mesna lên quy mô pilot (kilôgam/mẻ) tại các cơ sở sản xuất hóa dược trong nước.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Toàn bộ các thực nghiệm tổng hợp nguyên liệu mesna mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (mẻ 200 g), chưa tiến hành thử nghiệm trên dây chuyền thiết bị pilot công nghiệp; quy trình bào chế dung dịch tiêm 100 mg/ml được thực hiện ở quy mô mẻ nhỏ trong phòng thí nghiệm; các thử nghiệm độ ổn định thuốc tiêm mới thực hiện trên các lô phòng thí nghiệm trong 12 tháng.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    1. Nghiên cứu nâng cấp quy mô mẻ tổng hợp hóa học lên quy mô pilot (1–5 kg/mẻ) và tối ưu hóa hệ thống thu hồi khí phụ phẩm ($CS_2, H_2S$) nhằm bảo đảm an toàn môi trường và kinh tế công nghệ.
    2. Triển khai sản xuất thử nghiệm các lô thuốc tiêm mesna 100 mg/ml trên dây chuyền sản xuất thuốc tiêm đạt tiêu chuẩn GMP-WHO.
    3. Tiến hành các thử nghiệm tương đương sinh học hoặc đánh giá hiệu quả lâm sàng của chế phẩm thuốc tiêm sản xuất trong nước so sánh với thuốc đối chứng Uromitexan.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa dược, Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc: Có thể tham khảo chi tiết chương 1 và chương 3 về các phản ứng tạo nhóm thiol, kỹ thuật tinh chế hợp chất chứa lưu huỳnh, phương pháp định lượng HPLC trên cột pha đảo chuyên biệt, và các giải pháp chống oxy hóa đối với dược chất có cấu trúc thiol trong dạng thuốc tiêm.
  • Các viện nghiên cứu hóa dược và doanh nghiệp sản xuất nguyên liệu dược dụng (API): Cung cấp thông số kỹ thuật, tỷ lệ dung môi, nhiệt độ và các điều kiện phản ứng cụ thể của quy trình tổng hợp mesna qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat từ nguyên liệu giá rẻ 1,2-dicloroethan để triển khai sản xuất hoạt chất trong nước.
  • Các nhà nghiên cứu và cơ sở sản xuất thuốc tiêm: Cung cấp thông số công thức (tỷ lệ $Na_2EDTA$, khoảng pH tối ưu 7,2–7,8, chế độ sục khí nitơ, chế độ nhiệt tiệt trùng) giúp ổn định các dược chất dễ bị oxy hóa trong dung dịch nước tiêm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lựa chọn 1,2-dicloroethan làm nguyên liệu ban đầu thay vì 1,2-dibromoethan như các quy trình kinh điển?
Trả lời: 1,2-dibromoethan có giá thành cao và do nguyên tử brom có hoạt tính hóa học mạnh nên dễ xảy ra phản ứng thế sulfit trên cả 2 vị trí tạo sản phẩm phụ disulfonat khó loại bỏ. Trong khi đó, 1,2-dicloroethan là nguyên liệu công nghiệp rất sẵn có, giá thành rẻ hơn nhiều lần và ưu tiên phản ứng thế đơn tạo natri 2-cloroethansulfonat với hiệu suất trên 80%, giúp giảm chi phí sản xuất và nâng cao độ tinh khiết của nguyên liệu trung gian.

2. Ưu điểm nổi bật của con đường tổng hợp mesna qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat (con đường IV) so với con đường qua muối thiouroni (con đường I) là gì?
Trả lời: Con đường IV chỉ trải qua 2 giai đoạn phản ứng chính, thời gian thực hiện ngắn (1–1,5 ngày so với 4–5 ngày của con đường I), không phải sử dụng cột nhựa trao đổi cation phức tạp (vốn tốn nhiều thời gian và dung môi), hiệu suất toàn quy trình đạt 68,7% (cao gần gấp đôi so với 36,1% của con đường I), và sản phẩm mesna dễ dàng kết tinh tinh chế đạt tiêu chuẩn BP 2015.

3. Tạp chất liên quan quan trọng nhất cần kiểm soát trong nguyên liệu và dung dịch tiêm mesna là gì? Giới hạn cho phép theo BP 2015 là bao nhiêu?
Trả lời: Tạp chất quan trọng nhất là tạp D (dimesna / acid 2,2'-(disulfandiyl)bisethansulfonic) - sản phẩm hình thành do quá trình tự oxy hóa cặp nhóm thiol (-SH) của 2 phân tử mesna tạo cầu nối disulfid (-S-S-). Theo chuyên luận BP 2015, giới hạn tạp D trong nguyên liệu mesna không được vượt quá 3,0%.

4. Những biện pháp kỹ thuật nào được áp dụng đồng thời trong công thức để bảo vệ nhóm thiol của mesna không bị oxy hóa trong dung dịch tiêm 100 mg/ml?
Trả lời: Ba giải pháp kỹ thuật bắt buộc gồm: (1) Điều chỉnh và kiểm soát pH dung dịch tiêm trong khoảng 7,2–7,8; (2) Thêm chất tạo phức chelat dinatri edetat ($Na_2EDTA$) nồng độ 0,25 mg/ml nhằm bất hoạt ion kim loại nặng vết xúc tác cho quá trình oxy hóa; (3) Sục khí nitơ tinh khiết liên tục trong suốt quá trình pha chế và đóng ống để loại bỏ triệt để lượng oxy hòa tan trong nước pha tiêm.

5. Kết quả đánh giá độc tính cấp ($LD_{50}$) của nguyên liệu mesna tổng hợp theo phương pháp mới trên chuột nhắt trắng là bao nhiêu?
Trả lời: Kết quả thử nghiệm trên chuột nhắt trắng cho thấy $LD_{50}$ đường uống là 4415 mg/kg và $LD_{50}$ đường tiêm tĩnh mạch là 1520 mg/kg. Các giá trị này nằm trong khoảng công bố quốc tế về độc tính cấp của mesna chuẩn ($LD_{50}$ uống 4440 mg/kg, tiêm tĩnh mạch 1510 mg/kg), khẳng định mức độ an toàn của nguyên liệu tổng hợp.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Đào Nguyệt Sương Huyền đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu đề ra trong việc phát triển quy trình tổng hợp hóa học và công nghệ bào chế mesna. Công trình đã thiết kế thành công con đường tổng hợp mới qua trung gian monoalkyl trithiocarbonat từ nguyên liệu 1,2-dicloroethan, nâng cấp quy mô lên 200 g/mẻ với hiệu suất 68,2% và sản phẩm đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh BP 2015. Đồng thời, luận án đã xây dựng được công thức và quy trình bào chế dung dịch tiêm mesna 100 mg/ml đạt tiêu chuẩn chất lượng tương đương biệt dược đối chứng Uromitexan với tuổi thọ dự đoán trên 24 tháng. Đây là cơ sở khoa học và thực tiễn quan trọng phục vụ định hướng tự chủ sản xuất hoạt chất và thuốc tiêm mesna phục vụ điều trị ung thư tại Việt Nam.