MỞ ĐẦU Các polymer tự nhiên cũng như polymer tổng hợp luôn là đối tượng thu hút các nhà khoa học trong các lĩnh vực nghiên cứu hiện đại. Các vật liệu nano polymer sinh học đang được tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện để ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và y sinh học. Trong số các vật liệu này, các dendrimer đã nổi lên như là một trong những chất mang nano polymer đầy triển vọng dùng để mang các loại thuốc điều trị. Dendrimer lần đầu tiên được tổng hợp từ năm 1970-1990 bởi hai nhóm khác nhau (Buhleier và cộng sự; Tomalia và cộng sự).
Ngược lại với các polymer cao phân tử mạch nhánh và thẳng thông thường, các dendrimer được kiểm soát rất chặt chẽ về cấu trúc và có các nhóm chức bề mặt có thể biến tính rất dễ dàng tùy thuộc vào mục đích sử dụng [1], [2]. Hiện nay, số lượng các công trình nghiên cứu về dendrimer được công bố ngày càng nhiều, tập trung vào khảo sát khả năng của dendrimer trong việc vận chuyển các hoạt chất sinh học khác nhau, ví dụ như: thuốc, oligonucleotide, enzyme và vaccine. Các dendrimer được thiết kế để vận chuyển thuốc nhằm gia tăng dược động học và phân phối sinh học của thuốc cũng như tăng cường khả năng hướng đích của thuốc. Dendrimer tương tác với các phân tử thuốc bằng cách hấp phụ trên bề mặt, bằng các tương tác tĩnh điện hoặc liên kết với các nhóm chức bề bằng liên kết hóa trị hoặc bằng cách bao gói thuốc vào các khoang trống của dendrimer.
Các khoang trống bên trong thường có tính chất kỵ nước, cho phép tương tác với các loại thuốc hòa tan kém. Sự tồn tại của các nguyên tử nitơ và oxy trong cấu trúc bên trong của dendrimer cho phép tương tác bởi liên kết hydro với thuốc. Với số lượng lớn các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer (như amine - NH2 và nhóm cacboxylate -COO-) cho phép gắn lượng lớn các loại thuốc khác nhau bằng tương tác tĩnh điện và vận chuyển chúng đến đích [4]. Cisplatin từ lâu được dùng trong điều trị lâm sàng các loại bệnh ung thư do khả năng gây chết tế bào ung thư của thuốc.
Tùy thuộc vào loại tế bào và nồng độ Cisplatin sẽ gây độc tế bào. Ngoài ra, Cisplatin làm tổn thương các khối u thông qua việc tác động lên hiệu ứng gây chết tế bào apoptosis theo các phương thức 1 khác nhau [4], [5]. Mặt khác, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Cisplatin gây ra nhiều tác dụng phụ như thần kinh, độc tính với thận hoặc ức chế tủy xương. Hơn nữa, Cisplatin liên kết với protein và enzyme có thể gây ra việc điều chỉnh cơ chế sinh hóa của chúng.
Quá trình điều trị ung thư bằng Cisplatin cũng dẫn tới các tế bào ung thư có thể trở nên kháng Cisplatin và làm giảm khả năng điều trị của thuốc [5]. Nhiều cơ chế kháng Cisplatin đã được nghiên cứu bao gồm những thay đổi trong sự hấp thụ tế bào, tràn dịch thuốc, tăng giải độc, ức chế quá trình chết tế bào apoptosis và tăng sửa chữa DNA. Để giảm thiểu việc kháng thuốc Cisplatin cũng như giảm độ gây độc tế bào của Cisplatin, liệu pháp tổ hợp đã được phát triển và đã chứng minh hiệu quả hơn trong điều trị bệnh ung thư. Một trong các giải pháp đó là việc sử dụng các PAMAM dendrimer làm chất mang thuốc Cisplatin.
Trong luận án này, chúng tôi sẽ tiếp tục cải thiện khả năng mang thuốc Cisplatin của PAMAM dendrimer trên cơ sở tăng cường nhóm chức bề mặt của dendrimer nhằm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin của hệ chất mang này. Mục tiêu của luận án Tổng hợp hệ vật liệu nano mang thuốc trên nền dendrimer (PAMAM) biến tính với PNIPAM và PAA tương hợp sinh học nhằm cải thiện hiệu quả mang thuốc Cisplatin. Cơ chế mang thuốc của PAMAM dendrimer thế hệ lẻ [6] 2 Hình 2: Cơ chế mang thuốc của hệ G4.0-PAA-Cisplatin [6] Hình 3. Cơ chế mang thuốc của hệ G3.5-PNIPAM-Cisplatin Ý nghĩa khoa học của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy một số kết luận có ý nghĩa khoa học sau: - Sử dụng polymer nhạy nhiệt (PNIPAM), polymer nhạy pH (PAA) làm tác nhân hướng đích trên cơ sở nhiệt độ và pH của tế bào để biến tính Dendrimer tạo hệ chất vận chuyển thuốc đến tế bào ung thư.
Đặc điểm hình thái của các tế bào ung thư tạo ra khoảng không gian giữa các tế bào rộng hơn so với các mô bình thường. Các phức hợp chất mang thuốc sau khi đã đi vào các khe hở tế bào này sẽ bị giữ lại khi các tế bào ung thư phát triển. Thêm vào đó, do không có hệ bạch huyết cần thiết, tốc độ đào thải các phức hợp này ra khỏi mô ung thư là rất hạn chế. 3 pH = 7,4 pH = 5,5 Hình 4.
Định hướng thụ động theo cơ chế EPR [7], [8]. - Thủy phân Cisplatin bằng AgNO3 trước khi thực hiện phản ứng tạo phức và kết hợp sóng siêu âm trong quá trình tổng hợp phức dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G4.0- PAA-Cisplatin và G4.0-PAA-Cisplatin làm tăng khả năng mang thuốc Cisplatin của các hệ chất mang. - Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5-PNIPAM và G4PAA cho thấy khả năng nhả thuốc Cisplatin chậm và ổn định trong điều kiện in vitro. - Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM có khả năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) và Cisplatin (35,22%) và cũng có thể áp dụng để mang các loại thuốc khác.
- Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer G3.5- PNIPAM-Cisplatin-5FU và G4.0-PAA-Cisplatin thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư và có khả năng nhả thuốc tốt hơn trong môi trường acid pH 5,5. Đóng góp mới của luận án - Đã tổng hợp thành công các phức PAMAM dendrimer G3.0-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4. 4 - Đã tổng hợp thành công các phức PAMAM dendrimer G2.5-Cisplatin, PAMAM dendrimer G3.5-Cisplatin và PAMAM dendrimer G4.5-Cisplatin có và không có sử dụng sóng siêu âm. Phương pháp tổng hợp có thủy phân Cisplatin bằng AgNO3 trước khi thực hiện phản ứng tạo phức với các nhóm carboxylate trên bề mặt của PAMAM dendrimer thế hệ lẻ kết hợp với siêu âm làm tăng đáng kể hàm lượng Pt trong sản phẩm so với phương pháp không thủy phân Cisplatin.
- Đã biến tính thành công PAMAM dendrimer G3.0 với Poly N- isopropylacrylamide (PNIPAM-COOH) với các tỉ lệ mol khác nhau và tổng hợp thành công hệ chất mang G3. Đã tính toán được số nhóm PNIPAM gắn vào PAMAM dendrimer G3.0 và tính KPLPT của sản phẩm dựa trên phổ 1H- NMR. Bước đầu thử nghiệm cho thấy hệ chất mang G3.5-PNIPAM cho thấy khả năng mang đồng thời hai thuốc chống ung thư 5-FU (20,43%) và Cisplatin (35,22%) và cũng có thể áp dụng để mang các loại thuốc khác. - Đã biến tính thành công PAMAM dendrimer G3.0 với acid poly acrylic (PAA) với các tỉ lệ mol khác nhau.
Tính toán được số nhóm PAA gắn vào PAMAM dendrimer và tính KPLT của sản phẩm dựa trên phổ 1H-NMR. Hệ chất mang G4.0-PAA với số nhóm PAA gắn lên bề mặt PAMAM dendrimer G4.0 là 15 nhóm thể hiện khả năng mang thuốc Cisplatin tốt nhất (40,44%).0- PAA-Cisplatin có độc tố giảm so với Cisplatin tự do (có IC50 cao gấp 3 lần Cisplatin tự do) khi thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H460 nhưng vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư và thể hiện khả năng nhả thuốc tốt trong môi trường acid pH 5,5. - Các hệ chất mang carboxylate PAMAM dendrimer G2.5-PNIPAM và G4PAA cho thấy khả năng nhả thuốc chậm và ổn định trong điều kiện in vitro. - Các hệ chất mang và các phức PAMAM dendrimer G3.5- PNIPAM-Cisplatin-5FU thể hiện khả năng giảm độc tính của thuốc chống ung thư Cisplatin đồng thời vẫn thể hiện hoạt tính ức chế hiệu quả đối với sự phát triển của tế bào ung thư.
Giới thiệu dendrimer 1. Khái niệm và phân loại Khái niệm dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào năm 1985 [1]. Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là nhánh cây.
Từ đó đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất, phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực khác nhau [3], [9], [10], [11], [12], [13]. Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính chất ưu việt hơn so với polymer mạch thẳng. Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1. Cấu tạo phân tử Dendrimer - Một lõi (nhân hoặc core) ở trung tâm của dendrimer bao gồm (i) một nguyên tử hoặc một phân tử có ít nhất hai nhóm chức giống nhau; (ii) nhánh, phát ra từ lõi, được lặp đi lặp lại và có nhiệm vụ liên kết nhóm ngoài cùng với nhân; và (iii) nhiều nhóm bên ngoài (nhóm anion, cation, nhóm trung tính, các nhóm ưa nước hay kỵ nước) còn gọi là nhóm bề mặt hoạt động.
Những nhóm bề mặt này rất quan trọng trong việc xác định các tính chất của các cao phân tử dendrimer. 6 Các dendrimer được phân loại theo các tiêu chí sau: (a) Theo cấu trúc hình học [3], [7], [14] Theo cấu trúc hình học, dendrimer được phân chia thành các dạng sau: dendrgraft; dendron; dendrimer (hình 1. Cấu trúc phân tử của Random Hyperbranched, dendrigraft, dendron và dendrimer (b) Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau thì được phân chia và gọi tên khác nhau (hình 1.3): nhánh N; nhánh aryl; nhánh C; nhánh Si; nhánh Saccharide; nhánh P; 7 Dendrimer nhánh N Dendrimer nhánh Aryl Hình 1. Cấu trúc phân tử của dendrimer có nguyên tử tạo nhánh khác nhau (c) Theo loại kết nối Theo loại kết nối (connectivity) sẽ phân chia và gọi tên theo các loại liên kết hóa học tại vị trí kết nối (hình 1.4): cầu nối aryl; cầu nối amide; cầu nối este; cầu nối ether; cầu nối N; cầu nối O; cầu nối Si; cầu nối urea; cầu nối alkyl; cầu nối alken; cầu nối alkyn; … (C6H13)2N CN NC CN CN CN CN NC NC CN NC CN CN CN CN CN CN (C6H13)2N N(C6H13)2 (C6H13)2N N(C6H13)2 H2N H2N NH2 NH2 H2N N N CN NH2 CN NC N N N N NC CN H2N NC CN NH2 N N CN N(C6H13)2 N(C6H13)2 CN H2N N N NH2 NC CN N CN CN N CN NC H2N N N NH2 CN H2N NH2 H2N NH2 N(C6H13)2 N(C6H13)2 N(C6H13)2 N(C6H13)2 NC NC CN CN CN NC CN NC CN CN NC NC CN NC CN CN N(C6H13)2 Hình 1.