Chương 1 ▪ Mục tiêu là thiết lập một kỹ thuật để sản xuất enzyme có độ tinh khiết mà khách hàng yêu cầu với giá cả phải chăng nhứt. ▪ Để thiết lập kỹ thuật này, ta cần biết: 1. Nguồn gốc của enzyme (chương 2). Enzyme có đặt tính gì? 3.
Phương pháp đo lường khối lượng và chất lượng của enzyme. Các kỹ thuật trích chiết và tinh lọc Các dữ kiện sau đây giúp ích trong việc thiết lập một phương pháp sản xuất enzyme: •Khả năng hòa tan ̣(trong nước? hay trong cồn) •Khối lượng phân tử của enzyme •Điểm đằng điện, điện tính của phân tử enzyme. •Khả năng bám chuyên biệt của enzym 2. Kiểm soát chất lượng và Bảo đảm chất lượng •Chúng ta cần một phương pháp để nhật diện enzyme này, để đo lường số lượng và độ tinh khiết của nó.
Đây là Kiển soát chất lượng •Chúng ta cũng cần phải bảo đảm rằng tiến trình sản xuất nhất định, không sai lệch và tất cả những thành phần vật liệu xử dụng trong tiến trình sản xuất đều có xuất xứ rõ rệt. Đây là Bảo đảm chất lượng. Dưới đây là vài kỹ thuật tinh lọc thông dụng Kỹ thuật trầm hiện. Salting out • Phân tử Protein cuộn theo hình thể mà những amino acid (AA) kỵ nước tụ lại nhau để cho những AA háo nước bao phũ bên ngoài, Những AA này nối liền với các phân tử nước xung quanh bằng hydrogen bonds.
Đây là lớp hòa tan (solvation layer) của phân tử protein làm cho the protein hòa tan trong nước. • Khi nồng độ muối trong dung dịch gia tăng, ion muối bẻ gảy hydrogen bond của lớp hòa tan này làm cho các phân tử protein dính liền nhau và đưa đến sự trầm hiện. Lớp hòa tan xung quang phân tử protein. Lưu ý những phân tử nước dang hydrogen bond ra đến phân tử protein.
Hình phải cho thấy 2 phân tử protein trầm hiện Kỹ thuật trầm hiện. Salting out (tiếp.) • Khả năng protein hòa tan trong nước khác nhau tùy vào mức độ háo nước hay kỵ nước trên bề mặt của phân tử protein. Proteins có bề mặt có tính chất kỵ nước cao thì dể trầm hiện. Hoffmeister Series • Anions and cations được xếp hạng theo khả năng trầm hiện proteins của chúng.
Đó là Hoffmeister Series. • Đối với Anions • Đối vớ Cations Kỹ thuật trầm hiện. Salting out (tiếp.) • Một trong những muối dùng nhiều nhứt để salt out là ammonium sulfate (AS) vì: ➢ Nó rất hòa tan trong nước ➢ Hầu hết tất cả protein đều trầm hiện trong dung dịch bảo hòa AS (4M). ➢ Khi hòa tan AS, nó không phát ra nhiệt, do đó tránh protein không bị denatured.
➢ Dung dịch bảo hòa AS có tỉ trọng thấp (1.25g/mL), nhờ vậy mà ta có thể ly tâm protein xuống đáy và AS dung dịch ở trên. Preparation of ammonium sulfate % Preparation of ammonium sulfate % •Cách xử dụng bảng Ammonium sulfate (AMS) •Ta muốn trần hiện một protein của plasma ở nồng độ 25% ammonium sulfate (AMS). •Bắt đầu là plasma, tức là 0% AMS. Xem bảng cột trái “Starting % saturation”.
Nhìn bảng hàng dưới “Final Perccent Saturation to be Obtained”, chọn cột 25. T cần 144g AMS cho 1L plasma để đạt được 25% AMS Kỹ thuật sắc ký hoán chuyển ion (IEC) • Kỹ thuật IEC dựa vào sự hấp thu có thể bám, nhả (reversible) của những phân tử hòa tan (enzyme) đến ion có điện tính đối ngược. Đây là những ion cố định và có bán được trên thị trường. • Hầu hết IEC gồm có 5 giai đoạn Ion exchange chromatography (cont.) Sắc ký trao đổi ion (tiếp.) •Tùy theo điện tính của phân tử ta muốn cho bám, ta có thể dùng hạt trao đổi anion (anion exchanger) hay cation (cation exchanger): Sắc ký trao đổi ion (tiếp.) •Đây là vài enzyme nguồn vi sinh xử dụng trong kỹ nghệ thực phẩm và điểm đẳng điện: ➢ 𝞪- amylase pI 4.12 •Điện tính trên bề mặt của enzymes thay đổi tùy theo pH của môi trường Sắc ký trao đổi ion (tiếp.) • Khi pH = pI thì enzyme trở nên trung tính.
• In native environment, pH ~7, the above enzymes are negatively charged Sắc ký trao đổi ion (tiếp.) •Do đó ta xử dụng anion exchanger để tinh lọc enzyme. Hạt sắc ký này mang điện tính dương. Nó sẽ bám enzyme ở pH thiên nhiên của nó, trong khi đó những protein khác không bám các hạt này, chảy xuyên qua cột. •Ta có thể thay đổi điều kiện môi trường (pH hoặc nồng độ muối của môi trường), làm cho enzyme đang bám sẽ nhã ra và ta có thể thu hoạch được.
Gel Filtration Chromatography (GFC) •Gel filtration tách các phân tử dựa vào kích thước của phân tử khi chúng chảy qua cột sắc ký này. •Những hạt sắc ký này hình cầu và có khe. Khi các phân tử nhỏ chảy xuyên qua cột sắc ký sẽ lọt vào các khe và di chuyển lâu hơn mới xuyên qua cột được. Trong khi đó phân tử lớn không lọt vào các khe, mà chỉ chảy thẳng xuyên qua cột nên sẽ chảy ra trước.
Gel Filtration Chromatography (cont.) Gel filtration bead Gel Filtration Chromatography (cont.) •Các phân tử protein sẽ chảy ra khỏi cột vào các thời điểm khác nhau, phân tử lớn ra trước, xong đến phân tử trung và cuối cùng là phân tử nhỏ. •Ta hứng các dung dịch từ cột sắc ký theo thứ tự thời gian thì ta sẽ có các protein lớn trung và nhỏ trong những ống chứa khác nhau. Tức là ta đã tách các protein này ra tùy theo kích thước phân tử. Td enzyme có phân tử nhỏ.
•Người ta ít dùng GFC trong sản xuất vì không thích hợp cho sản xuất đại trà. Diafiltration • Đây là kỹ thuậtdùng để loại bỏ muối khỏi sản phẩm. Nó còn được gọi là Ultrafiltration (UF). khi ta dùng ammonium sulfate (AS) để trầm hiện enzyme.
Dung dịch enzyme sẽ có nhiều AS. Ta dùng UF để loại AS này. • Trong kỹ thuật này thì ta cho dung dịch sản phẩm chảy dọc theo bề mặt của màng lọc. Một phần dung dịch sẽ xuyên qua lổ nhỏ trên màng lọc.
Phần lớn của dung dịch sẽ chảy thẳng dọc theo màng lọc trở về bể chứa. • Màng lọc được phân loại (tùy theo kích thước các lổ này) thành Molecular Weight Cut Off (MWCO). 30, 100 MWCO UF cartridge of hollow fiber membranes Ống màng siêu lọc loại sợi rổng Sơ đồ màng siêu lọc loại sợi rổng dùng trong tiếng trình UF Tiến trình loại bỏ các phân tử nhỏ trong sản phẩm. Màng lọc tách các protein ra tùy theo kích thước các lổ trong màng lọc Affinity Chromatography (AF) •AF phân tách protein dựa trên sự tương tác có thể đảo ngược giửa 1 protein và chất bám chuyên biệt của nó, và chất này đang kép trên hạt sắc ký.
•Các chất bám này phải còn giử được khả năng bám của chúng với phân tử mục tiêu sau khi ta rửa sạch chúng để loại trừ những phân tử khác. Sau khi được tách ra khỏi chất bám, các phân tử bám phải còn giử được trạng thái linh hoạt. Affinity Chromatography (cont.) •Sau đây là vài phản ứng tương tác thường được xử dụng trong AF: ➢ Enzyme Substrate analogue, cofactor, inhibitor. ➢ Hormone Receptor Kiểm soát chất lượng • Sự thành công của phương pháp sản xuất (trích lọc / tinh lọc) là dựa vào số thu hoạch và độ tinh khiết của sản phẩm.
Thu hoạch Ta đo số thu hoạch bằng assay. Có nhiều loại assay đo lường số lượng sản phẩm thu hoạch. Bài giảng trình bày hai loại: assay protein và assay hoạt lực. • Enzymes là protein.
Tuy nhiên không phải tất cả protein trong sản phẩm đều là enzyme. Đó là tùy vào độ tinh khiết của sản phẩm. Có bao nhiêu phần trăm trong sản phẩm là enzyme? Đó là độ tinh khiết của sản phẩm Quality control (cont.) •Nếu sản phẩm là 100% tinh khiết, nghỉa là tất cả proteintrong sản phẩm đều là enzyme. Assay protein cho kết quả là lượng protein trong sản phẩm.kết quả là 100mg/ml và: ➢Nếu sản phẩm 100% tinh khiết.
Thì nồng độ enzyme trong sản phẩm là100mg/mL x 100% = 100mg/mL ➢Nếu sản phẩm 60% tinh khiết, thì nồng độ enzyme trong sản phẩm là 100mg/mL x 60% = 60mg/mL. Phần còn lại 40% là những protein khác không phải enzyme Quality control (cont.) •Có nhiều loại assay đo protein. Sau đây là 5 loại thường dùng nhứt: ➢UV-Vis Absorbance at 280nm ➢The Bradford assay ➢The Bicinchoninic Acid assay (BCA) ➢The Folin-Lowry assay ➢The Kjeldahl method 2. Assay sinh học (hoạt tính) Quality control (cont.) •Khách hàng chú tâm đến hoạt tính sinh học của enzyme hơn là số lượng protein của sản phẩm.
Hoạt tính là khả năng enzyme xúc tác chất nền của nó (substrate). •Hoạt tính của enzyme đo lường bằng đơn vị (Unit). Đó là số lượng enzyme có khả năng xúc tác phản ứng biến 1 𝞵mole chất nền trong 1 phút ở một nhiệt độ nhứt định. • Mổi enzyme có 1 chất nền chuyên biệt, td.
enzyme thrombin xúc tác biến fibrinogen thành fibrin. Quality control (cont.) •Assay sinh học đo lường khả năng của enzyme xúc tác chất nền. Người ta đo khả năng này dựa trên số lượng chất nền mất đi hay số lượng sàn phẩm được tạo ra. Độ tinh khiết •Độ tinh khiết của sản phẩm enzyme là phần trăm sản phẩm chứa chỉ enzyme.
sản phẩm 70% tinh khiết nghỉa là trong 100mg protein của sản phẩm chứa 70mg enzyme, còn 30mg protein còn lại là chất nhiểm. Quality control (cont.) • Người ta đo độ tinh khiết bằng gel electrphoresis. Kỹ thuật này dùng điện để tách các protein trên sàn gel, dựa trên kích thước phân tử của chúng • Sản phẩm enzyme cho chạy song song với một hổn hợp của các protein mẫu có khối lượng phân tử được biết (markers). • Những vạch trên làn sản phẩm là những loại protein chứa trong sản phẩm.
Vị trí của mổi vạch này sẽ được so sánh với vị trí của marker. Từ đó ta có thể tính ra được khối lượng phân tử của protein trong lằng đó Phân tích điện di của các sản phẩm thu hoạch sau mổi giai đoạn tinh lọc protein. Protein markers trong làn bên trái Quality control (cont.) •Tiến trình tinh lọc của thí dụ này gồm 5 giai đoạn. Một mẫu sản phẩm của mổi giai đoạn được nhặt và cho chạy electrophoresis.
•Ta nhận thấy rằng số vạch trong mổi làn giảm dần sau mổi giai đoạn tinh lọc. •Làn 5 chỉ cỏn chứa 1 vạch thôi, ở vị trí ngang với vạch 35kD của làn marker. Điều này chỉ rằng sản phẩm của làn 5 có độ tinh khiết 100% và lượng protein trong sản phẩm này hoàn toàn là enzyme mình muốn tinh lọc, và nó có khối lượng phân tử là 35kD Quality control (cont.) •Trong trường hợp mà có nhiều hơn 1 vạch trong sản phẩm cuối cùng. người ta phải đo độ đậm của mổi vạch và tính số phần trăm của mổi vạch là bao nhiêu.
Người ta dùng máy đo độ dầy đặc.