Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm tạo điều kiện cho Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú, trong đó nhiều loài thảo dược tự nhiên đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền để chăm sóc sức khỏe và điều trị bệnh tật. Cây Hà thủ ô trắng, có tên khoa học là Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae), là một cây thuốc bản địa được đồng bào các dân tộc vùng núi phía Bắc (như Vĩnh Phúc, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn) và vùng đồi bán sơn địa phía Nam (như An Giang) sử dụng trong các bài thuốc trị sốt rét rừng, cảm sốt hoặc tăng tiết sữa cho phụ nữ sau sinh. Theo các ghi chép dược liệu học của TS. Đỗ Tất Lợi, hà thủ ô trắng có một số công dụng tương tự như hà thủ ô đỏ, bao gồm bồi bổ khí huyết, hỗ trợ điều trị suy nhược thần kinh và làm khỏe gân cốt.

Các nghiên cứu hóa học và dược lý hiện đại trên thế giới và tại Việt Nam đã chỉ ra rằng rễ của cây Hà thủ ô trắng chứa hàm lượng lớn các hợp chất nhóm triterpene, cardenolide và steroid glycoside có khả năng ức chế hoặc gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư ở người. Mặc dù bộ phận rễ đã được khảo sát tương đối chi tiết, các bộ phận trên mặt đất như lá và thân dây leo của loài này—vốn được đồng bào dân tộc Thái và Khmer thu hái làm thuốc trị cảm sốt và sốt rét—vẫn chưa được khảo sát đầy đủ về mặt hóa thực vật. Do đó, đề tài "Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn A cao chloroform của lá và thân dây leo cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas)" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

  1. Thu hái, xử lý nguyên liệu thực vật và điều chế các phân đoạn cao chiết từ lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng bằng phương pháp ngâm chiết và chiết phân bố lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
  2. Thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường trên cao chloroform để thu nhận phân đoạn A, tiếp tục phân tách các phân đoạn nhỏ hơn bằng các hệ dung môi thích hợp.
  3. Cô lập các hợp chất hữu cơ sạch từ phân đoạn A (cụ thể là từ phân đoạn phụ A4) bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế.
  4. Xác định và biện luận cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được thông qua các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR), kết hợp so sánh với các dữ liệu đã công bố trong tài liệu tham khảo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá và thân dây leo của cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr.), họ Thiên lý (Asclepiadaceae).
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại địa bàn xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang, được nhận danh tên khoa học bởi lương y Nguyễn Thiện Chung.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nguyên liệu được thu hái vào tháng 05 năm 2018; các thực nghiệm chiết xuất, phân lập và đo phổ được thực hiện để hoàn thành khóa luận vào tháng 04 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của khóa luận dựa trên nguyên lý phân loại thực vật học, dược lý học thực nghiệm và hóa học các hợp chất tự nhiên. Về mặt phân loại, cây Hà thủ ô trắng còn được biết đến với các tên gọi dân gian khác nhau như hà thủ ô nam, dây sữa bò, bạch hà thủ ô, dây mốc, cây sừng bò, khâu can cà (tiếng Thổ), khâu nước (Lạng Sơn), hoặc mã liên an, mã lin ón (Lào). Dược tính cổ truyền ghi nhận loài cây này có vị ngọt đắng, tính mát, quy vào can thận, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu viêm, cầm máu và kích thích tiêu hóa. Nghiên cứu thực nghiệm hiện đại của Ueda và cộng sự (2003) chứng minh các hợp chất cardenolide phân lập từ rễ có độc tính mạnh trên các dòng tế bào ung thư HT-1080 và A549. Các nghiên cứu của Jong-Bang Eun (2013) và Đái Thị Xuân Trang (2015) ghi nhận dịch chiết methanol từ thân và lá của loài này có hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis. Về hóa học, các nghiên cứu trước đây của Phạm Thanh Tam (2002), Ueda (2003), Jun Yin (2013), Wanfang Zhu (2018), Nguyễn Đức Tuấn (2007), Nguyễn Thị Hoàng Yến (2009) và Bùi Xuân Hào (2011) đã xác định nhiều khung cấu trúc triterpene (lupeol, alpha-amyrin acetate), cardenolide (periplogenin, digitoxigenin và dẫn xuất glycoside) cùng dẫn xuất phenylpropanoid trong rễ cây.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tác giả triển khai trong phòng thí nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp chiết xuất: Đun hoàn lưu nhiệt độ sôi dung môi methanol để ngấm kiệt hoạt chất từ bột dược liệu thô, sau đó cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm nhằm thu nhận cao tổng. Tiếp tục dùng phương pháp chiết lỏng - lỏng phân bố giữa nước và các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần (n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol) để làm giàu các nhóm chất theo độ phân cực.
  • Phương pháp sắc ký: Sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC) pha thường trên bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 (độ dày 250 µm, Merck, Đức); sắc ký cột cổ điển (CC) sử dụng pha tĩnh silica gel 60 (kích thước hạt 40–63 µm, Merck, Đức); và sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC). Kỹ thuật phát hiện vết sử dụng đèn soi tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, kết hợp thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric (H2SO4) nồng độ 15% hoặc 20% trong nước, nung nóng bản mỏng để quan sát màu sắc đặc trưng của vết chất.
  • Phương pháp phổ học xác định cấu trúc: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 600 MHz) và phổ carbon-13 (13C-NMR, 125 MHz), kết hợp các kỹ thuật phổ hai chiều DEPT, HSQC (tương tác dị hạt nhân qua một liên kết) và HMBC (tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) thực hiện trên máy Bruker Avance tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hà Nội). Dung môi pha mẫu đo phổ là chloroform deuterat hóa (CDCl3).

Nguồn dữ liệu trong nghiên cứu bao gồm số liệu thực nghiệm gốc do tác giả trực tiếp thực hiện (khối lượng cao chiết, tỷ lệ hệ dung môi, giá trị Rf, khối lượng phân đoạn, khối lượng chất tinh khiết) và dữ liệu phổ học đối chiếu từ các tài liệu khoa học quốc tế chính thống (công trình của Umar Mahmooda và cộng sự năm 2003 trên tạp chí Phytochemistry; công trình của Wang X. và cộng sự năm 2014 trên tạp chí Acta Pharmacologica Sinica).

Nội dung chính theo từng chương

Phần Tổng quan (Đặc điểm thực vật, Tính chất dược lý, Nghiên cứu về thành phần hóa học)

Phần tổng quan hệ thống hóa các tài liệu khoa học đã công bố về loài Streptocaulon juventas. Về đặc điểm hình thái, tác giả ghi nhận đây là loài dây leo sống lâu năm, thân dây dài từ 2–5 m, vỏ thân màu nâu đỏ hoặc nâu sẫm mang nhiều lông mịn rụng dần theo thời gian. Lá mọc đối, phiến lá nguyên, đáy hình bầu dục, cuống dài 5–8 cm. Hoa nhỏ màu lục vàng nhạt hoặc nâu nhạt tụ thành xim ở nách lá; quả đại tách đôi hai bên như hình sừng bò, dài 7–11 cm. Về dược tính, tổng quan phân định rõ tác dụng theo y học cổ truyền (bồi bổ, tiêu thũng, giải độc nọc rắn) và y học hiện đại (chống co thắt cơ trơn ruột, nâng cao khả năng cầm cự trước nọc rắn hổ mang, kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư). Về hóa thực vật, tác giả tổng hợp có hệ thống các hợp chất từng được công bố trên thế giới và ở Việt Nam, bao gồm 3 triterpene tự do, 16 cardenolide của Ueda (2003), 6 cardenolide mới của Jun Yin (2013), 13 dẫn xuất steroid của Wanfang Zhu (2018), cùng các dẫn xuất cardenolide phân lập bởi các nhóm nghiên cứu trong nước từ mẫu rễ thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang. Nội dung chương nhấn mạnh rằng toàn bộ các nghiên cứu hóa học nêu trên đều tập trung ở phần rễ, chưa có nghiên cứu chuyên sâu về phần thân dây leo và lá của loài này.

Chương 2. Hóa chất, thiết bị, phương pháp

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm từ khâu chuẩn bị mẫu đến phân tách các hợp chất. Từ 30 kg mẫu bột thô lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng sau khi phơi khô và xay nhỏ, tác giả tiến hành đun hoàn lưu với dung môi methanol ở nhiệt độ 64–65 °C trong 3 lần (mỗi lần 3 giờ). Dịch chiết sau khi cô quay thu hồi dung môi ở áp suất giảm thu được 1,5 kg cao methanol tổng. Phân tán lượng cao này vào nước rồi tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được các phân đoạn cao tương ứng:

Loại cao phân đoạn Khối lượng thu nhận (gam)
Cao n-hexane 285
Cao chloroform 885
Cao ethyl acetate 120
Cao n-butanol 110
Dịch nước còn lại Không xác định khối lượng khô

Từ 885 g cao chloroform, tác giả đưa 3,0 kg silica gel vào cột sắc ký cổ điển cỡ lớn và tiến hành giải ly bằng hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần, thu được 16 phân đoạn gộp lớn. Phân đoạn A (có khối lượng 28,8 g) được lựa chọn để tiếp tục sắc ký cột silica gel, giải ly bằng hệ n-hexane : ethyl acetate với tỉ lệ thay đổi từ 100:0 đến 1:1, cho ra 10 phân đoạn nhỏ từ A1 đến A10:

Ký hiệu phân đoạn Tỷ lệ hệ dung môi giải ly (Hexane : Ethyl acetate) Đặc điểm sắc ký lớp mỏng (TLC) Tình trạng khảo sát
A1 100 : 0 Vết dài Không khảo sát
A2 99 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A3 60 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A4 49 : 1 Nhiều vết tách rõ Tiến hành khảo sát
A5 30 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A6 20 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A7 15 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A8 9 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A9 4 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát
A10 1 : 1 Nhiều vết Chưa khảo sát

Phân đoạn A4 (khối lượng 6 g) thể hiện nhiều vết tách rõ trên bản mỏng nên được chọn để thực hiện sắc ký cột silica gel tiếp theo với hệ hexane : ethyl acetate, thu được 9 phân đoạn phụ từ A4.1 đến A4.9:

Ký hiệu phân đoạn Tỷ lệ dung môi giải ly (H : EA) Khối lượng (gam) Đặc điểm TLC
A4.1 99 : 1 0,5 Vết dài, không khảo sát
A4.2 80 : 1 — Nhiều vết, chưa khảo sát
A4.3 70 : 1 1,4 Nhiều vết, chưa khảo sát
A4.4 60 : 1 — Nhiều vết tách rõ, chọn khảo sát
A4.5 49 : 1 0,6 Nhiều vết, chưa khảo sát
A4.6 30 : 1 — Nhiều vết, chưa khảo sát
A4.7 20 : 1 — Nhiều vết, chưa khảo sát
A4.8 15 : 1 — Nhiều vết, chưa khảo sát
A4.9 9 : 1 0,1 Nhiều vết, chưa khảo sát

Tiến hành sắc ký cột silica gel lặp lại nhiều lần trên phân đoạn A4.4 với hệ dung môi n-hexane : acetone (tỷ lệ 30:1), sau đó kết hợp sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane : isopropanol (tỷ lệ 40:1, khai triển 3 lần liên tiếp), tác giả đã cô lập thành công hai hợp chất sạch ký hiệu là L5 (20 mg) và L7 (6 mg).

Kết quả nghiên cứu (Khảo sát cấu trúc hợp chất L5 và L7)

Phần kết quả tập trung biện luận dữ liệu phổ để xác định cấu trúc hóa học của hai chất đã cô lập:

  • Hợp chất L5: Thu được 20 mg dưới dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong chloroform, không hấp thụ phát hiện dưới đèn tử ngoại, cho một vết tròn màu tím khi phun thuốc thử H2SO4 20% và sấy nóng. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện hai mũi đôi đối xứng của vòng thơm mang hai nhóm thế ở vị trí para tại deltaH 7,43 ppm (d, J = 9,0 Hz) và deltaH 6,80 ppm (d, J = 9,0 Hz). Tín hiệu của hai proton olefin mang cấu hình trans xuất hiện với hằng số ghép spin lớn tại deltaH 7,62 ppm (d, J = 16,0 Hz, H-7) và deltaH 6,28 ppm (d, J = 16,0 Hz, H-8). Phổ còn thể hiện một nhóm oxymethylene (-CH2-O-) tại deltaH 4,18 ppm (t, J = 6,6 Hz, H-1'), một nhóm methyl đầu mạch tại deltaH 0,88 ppm (t, J = 6,6 Hz) và một dải tín hiệu cộng hưởng mạnh của các nhóm methylene mạch dài trong khoảng deltaH 1,25 ppm. Phổ 13C-NMR và HSQC xác nhận sự có mặt của 9 carbon thuộc khung acid coumaric, bao gồm một carbon carbonyl ester tại deltaC 167,5 ppm (C-9), các carbon thơm và carbon olefin. Tương quan HMBC giữa proton H-7 (deltaH 7,62 ppm) với C-9 (deltaC 167,5 ppm) và C-2/6 (deltaC 129,9 ppm), cùng tương quan giữa H-1' của nhóm alcol (deltaH 4,18 ppm) với C-9 (deltaC 167,5 ppm) khẳng định cấu trúc ester giữa acid p-coumaric và một alcol mạch thẳng dài (ước tính khoảng 40 carbon). Cấu trúc đề nghị của L5 là một alkyl trans-p-coumarate, có các tín hiệu phổ tương đồng với hợp chất hydroxyheptacosanyl-trans-p-coumarate trong tài liệu tham khảo của Umar Mahmooda và cộng sự (2003).

  • Hợp chất L7: Thu được 6 mg dưới dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong CDCl3, không hiện vết dưới đèn UV, cho vết đơn màu tím trên sắc ký lớp mỏng khi hiện hình bằng H2SO4 15% nung nóng. Phổ 1H-NMR thể hiện hai proton olefin của nhóm nối đôi đầu mạch exomethylene tại deltaH 4,68 ppm và deltaH 4,57 ppm, một proton methine gắn oxy tại deltaH 4,46 ppm (dd, J = 10,0; 6,0 Hz), cùng 7 nhóm methyl đơn (singlet) trong khoảng deltaH 0,75–1,68 ppm. Phổ 13C-NMR và HSQC ghi nhận tổng cộng 32 carbon đặc trưng cho khung lupane triterpenoid mang nhóm thế: một carbon carbonyl của nhóm acid carboxylic tại deltaC 182,4 ppm (C-28), một carbon carbonyl của nhóm ester acetate tại deltaC 170,8 ppm (C-1'), hai carbon olefin gồm carbon tứ cấp tại deltaC 150,4 ppm (C-20) và carbon methylene olefin tại deltaC 109,7 ppm (C-29), cùng một carbon oxymethine tại deltaC 78,41 ppm (C-3). Phổ tương quan HMBC cho thấy proton H-19 (deltaH 3,00 ppm) tương quan với C-20 (deltaC 150,4 ppm), C-29 (deltaC 109,7 ppm) và C-30 (deltaC 19,4 ppm), khẳng định vị trí nối đôi gắn ở nhánh isopropenyl tại C-19. Proton H-3 (deltaH 4,46 ppm) tương quan với carbon ester C-1' (deltaC 170,8 ppm), xác định nhóm acetoxy gắn tại C-3. So sánh tương thích dữ liệu phổ với công trình của Wang X. và cộng sự (2014), hợp chất L7 được xác định là 3-O-acetylepibetulinic acid (hay 3(alpha)-acetoxylup-20(29)-en-28-oic acid).

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả cụ thể sau:

  1. Từ 30 kg nguyên liệu khô gồm lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng, qua quá trình ngâm chiết hoàn lưu methanol và chiết phân bố lỏng - lỏng, đã điều chế được 4 phân đoạn cao chiết gồm 285 g cao n-hexane, 885 g cao chloroform, 120 g cao ethyl acetate và 110 g cao n-butanol.
  2. Tách thành công từ phân đoạn A (28,8 g) của cao chloroform, thông qua việc phân lập phân đoạn nhỏ A4 (6 g) và phân đoạn phụ A4.4, thu được hai hợp chất sạch ở trạng thái bột vô định hình màu trắng: hợp chất L5 (khối lượng 20 mg) và hợp chất L7 (khối lượng 6 mg).
  3. Sử dụng phối hợp các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR, khóa luận đã làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của L5 là dẫn xuất ester của acid p-coumaric với alcol mạch thẳng dài, và L7 là dẫn xuất triterpenoid khung lupane có tên 3-O-acetylepibetulinic acid.

Các kiến nghị do tác giả đề xuất bao gồm:

  • Tiếp tục tiến hành sắc ký phân lập để khảo sát thành phần hóa học đối với các phân đoạn còn lại của cao chloroform chưa được nghiên cứu (các phân đoạn A1–A3, A5–A10).
  • Mở rộng thử nghiệm một số hoạt tính sinh học (chẳng hạn hoạt tính độc tế bào, kháng viêm hoặc kháng khuẩn) trên hai hợp chất tinh khiết L5 và L7 đã cô lập được.

Về mặt đóng góp khoa học, đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam khảo sát trực tiếp thành phần hóa thực vật trên bộ phận lá và thân dây leo của loài Streptocaulon juventas. Hai hợp chất L5 và L7 lần đầu tiên được ghi nhận sự hiện diện trong lá và thân dây leo của loài thực vật này, bổ sung dữ liệu phổ NMR và bằng chứng cấu trúc thực nghiệm cho ngân hàng dữ liệu hóa thực vật về các loài thuốc dân gian thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có một số hạn chế gắn liền với phạm vi và điều kiện thực nghiệm:

  • Nghiên cứu chỉ mới tập trung xử lý phân đoạn A (chiếm 28,8 g trong tổng số 885 g cao chloroform) và mới tiến hành phân lập sâu trên một phân đoạn nhỏ là A4 (6 g); 9 phân đoạn nhỏ còn lại của phân đoạn A cùng các phân đoạn lớn khác của cao chloroform hoàn toàn chưa được khảo sát.
  • Các phân đoạn cao chiết khác có khối lượng đáng kể như cao n-hexane (285 g), cao ethyl acetate (120 g) và cao n-butanol (110 g) chưa được đưa vào quy trình cô lập hoạt chất.
  • Khóa luận dừng lại ở mức độ xác định cấu trúc hóa học của hai chất, chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro trên các tế bào hay chủng vi sinh vật kiểm nghiệm do giới hạn về khối lượng chất thu được và thời gian thực hiện đề tài.

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung khai thác các phân đoạn sắc ký còn lại của cao chloroform và các phân đoạn cao n-hexane, ethyl acetate; đồng thời tối ưu hóa quy trình phân lập để thu nhận khối lượng lớn hơn các hợp chất L5, L7 nhằm phục vụ các phép thử nghiệm sinh học định lượng.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này hữu ích cho các nhóm đối tượng nghiên cứu sau:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa học hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên, Dược học và Hóa dược: Tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký cột cổ điển silica gel phân đoạn liên tiếp, và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC).
  • Các nhà nghiên cứu dược liệu học và thực vật học: Khóa luận cung cấp tập hợp dữ liệu quy chiếu chi tiết về độ dịch chuyển hóa học (chemical shift delta), hình dạng mũi phổ và hằng số ghép spin (J) trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC của khung dẫn xuất p-coumarate mạch dài và triterpene lupane (3-O-acetylepibetulinic acid).
  • Phần đáng tham khảo nhất trong khóa luận là Chương 2 (các bảng thông số phân tách phân đoạn sắc ký silica gel và dung môi giải ly) và phần biện luận phổ tương quan 2D NMR trong Chương Kết quả nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

1. Khối lượng nguyên liệu thô ban đầu và hiệu suất thu nhận các phân đoạn cao chiết là bao nhiêu? Nghiên cứu sử dụng 30 kg bột thô lá và thân dây leo khô của cây Hà thủ ô trắng. Sau khi chiết hoàn lưu nhiệt với dung môi methanol, tác giả thu được 1,5 kg cao methanol tổng. Quá trình chiết lỏng - lỏng phân bố thu được 285 g cao n-hexane, 885 g cao chloroform, 120 g cao ethyl acetate và 110 g cao n-butanol.

2. Hợp chất L5 và L7 được cô lập từ phân đoạn nào và khối lượng thu được là bao nhiêu? Cả hai hợp chất đều được cô lập từ phân đoạn phụ A4.4, thuộc phân đoạn nhỏ A4 (nặng 6 g), nằm trong phân đoạn A (nặng 28,8 g) của cao chloroform. Khối lượng tinh khiết thu nhận được là 20 mg đối với hợp chất L5 và 6 mg đối với hợp chất L7.

3. Tác giả sử dụng hệ dung môi nào để tinh chế hai hợp chất L5 và L7 ở giai đoạn cuối? Tác giả đã kết hợp sắc ký cột silica gel nhiều lần giải ly bằng hệ n-hexane : acetone theo tỷ lệ thể tích 30:1, sau đó dùng sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC) với hệ dung môi n-hexane : isopropanol tỷ lệ 40:1, khai triển bản mỏng 3 lần liên tiếp để thu được L5 và L7 ở dạng tinh khiết.

4. Dữ liệu phổ nào chứng minh hợp chất L7 có khung cấu trúc triterpenoid lupane? Phổ 13C-NMR và HSQC xác nhận L7 có 32 carbon với 7 nhóm methyl đơn, các nhóm methylene và methine đặc trưng của khung lupane. Đáng chú ý, sự hiện diện của liên kết đôi exocyclic đầu mạch thể hiện qua tín hiệu carbon bậc bốn C-20 tại deltaC 150,4 ppm và carbon methylene C-29 tại deltaC 109,7 ppm (cùng hai tín hiệu proton olefin tương ứng tại deltaH 4,68 ppm và 4,57 ppm trên phổ 1H-NMR), kết hợp với tương quan HMBC giữa proton H-19 (deltaH 3,00 ppm) với C-20, C-29 và nhóm methyl C-30 (deltaC 19,4 ppm) là bằng chứng cấu trúc của nhánh isopropenyl gắn vào vòng 5 cạnh của khung lupane.

5. Vị trí nhóm chức ester trên hợp chất L5 được xác định bằng tương quan phổ nào? Trên phổ HMBC của hợp chất L5, proton olefin H-7 (deltaH 7,62 ppm) và proton oxymethylene H-1' của mạch alcol (deltaH 4,18 ppm) đều cho tương quan dị hạt nhân rõ rệt với carbon carbonyl ester C-9 tại deltaC 167,5 ppm. Tương quan này chứng minh mạch alcol dài được gắn trực tiếp vào đơn vị acid p-coumaric qua cầu nối ester tại vị trí carbon C-9.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Bùi Mai Tiến Thịnh đã thực hiện thành công việc khảo sát hóa thực vật trên phân đoạn A của cao chloroform chiết xuất từ lá và thân dây leo cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas). Bằng các phương pháp sắc ký pha thường kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D NMR), nghiên cứu đã cô lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh của hai hợp chất hữu cơ sạch là một alkyl trans-p-coumarate (L5, 20 mg) và 3-O-acetylepibetulinic acid (L7, 6 mg). Đây là các dẫn xuất hóa học lần đầu tiên được phát hiện và công bố trên bộ phận lá và thân dây leo của loài thảo dược này tại Việt Nam, đặt nền móng thực nghiệm cho các định hướng phân lập mở rộng và thử nghiệm hoạt tính sinh học tiếp theo.