Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là loài thực vật nhiệt đới và liên nhiệt đới phân bố phổ biến tại Việt Nam. Trong kinh nghiệm dân gian, loài cây này được sử dụng làm vị thuốc trị các bệnh về đường ruột, tiêu chảy, kiết lỵ, viêm phế quản, hen suyễn, làm thông sữa hoặc điều trị mụn nhọt ngoài da. Trên thế giới, các công trình dược lý hiện đại ghi nhận các phân đoạn chiết xuất từ cỏ sữa lá lớn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus (bao gồm HIV-1, HIV-2), chống oxy hóa và ức chế phản ứng viêm.
Mặc dù có nguồn dược tính và thành phần tự nhiên phong phú (chứa alkaloid, flavonoid, polyphenol, sterol, triterpenoid), nguồn dược liệu cỏ sữa lá lớn tại khu vực phía Nam Việt Nam, đặc biệt là địa bàn tỉnh Đồng Nai, vẫn chưa được khảo sát chuyên sâu và có hệ thống về mặt hóa học hợp chất thiên nhiên. Xuất phát từ bối cảnh thực tiễn đó, đề tài "Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate của cây cỏ sữa lá lớn Euphorbia hirta L. họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)" được thực hiện nhằm phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp có trong phân đoạn chiết ethyl acetate của mẫu cây thu hái tại địa phương này.
Khóa luận xác định các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:
- Thu hái, làm sạch, phơi sấy, xay nhỏ mẫu nguyên liệu thực vật và điều chế cao chiết tổng bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi ethanol.
- Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân bố cao tổng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (petroleum ether, ethyl acetate) để thu các phân đoạn cao tương ứng.
- Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (silica gel pha thuận) kết hợp sắc ký bản mỏng (TLC) để chia nhỏ phân đoạn cao ethyl acetate và cô lập các hợp chất hữu cơ ở trạng thái tinh khiết.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng việc phân tích các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR và 2D-NMR) kết hợp đối chiếu với các tài liệu tham khảo đã công bố.
Đối tượng nghiên cứu là toàn bộ cây cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tự nhiên tại tỉnh Đồng Nai. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào phân đoạn cao chiết ethyl acetate (cao phân cực trung bình), được thực hiện trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học niên khóa 2010 - 2014 tại Phòng thí nghiệm Hóa học hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng phân loại thực vật học, lý thuyết hóa học hợp chất thiên nhiên và các quy chuẩn phân tích phổ cấu trúc hữu cơ:
- Đặc điểm thực vật học và hoạt tính sinh học: Euphorbia hirta L. là cây thân thảo sống hằng năm, cao khoảng 15–40 cm, toàn thân có lông ráp màu vàng và chứa nhựa mủ trắng đục. Cây có lá mọc đối, phiến lá hình mũi mác, mép khía răng cưa nhỏ, cụm hoa hình chén ở nách lá, quả nang nhỏ nứt thành 3 mảnh vỏ. Các công trình khoa học quốc tế chỉ ra chiết xuất từ loài này có khả năng chống oxy hóa tương đương trà xanh và trà đen nhờ sự hiện diện của các dẫn xuất flavonoid (như quercetin), đồng thời các tannin có hoạt tính kháng mạnh các chủng virus HIV-1, HIV-2 và $\text{SIV}_{\text{mac251}}$.
- Tổng quan hóa học: Các nghiên cứu trước đây trên thế giới đã ghi nhận trong cây cỏ sữa lá lớn có nhiều nhóm chất: triterpene (taraxerol, friedelin, $\beta$-amyrin, cycloartenol), polyphenol và acid hữu cơ (gallic acid, ellagic acid, caffeic acid, shikimic acid), flavonoid và flavonoid glycoside (quercitrin, myricitrin), kaurane diterpenoid và các dẫn xuất butanol rhamnoside.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các giai đoạn:
- Xử lý nguyên liệu và chiết xuất: 12 kg bột cây khô được ngâm dầm hồi lưu nhiều lần trong ethanol 96° ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được lọc, gom lại và đuổi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không Heidolph để thu cao tổng.
- Chiết phân bố lỏng - lỏng: Cao tổng được hòa tan và chiết phân bố lần lượt với petroleum ether (PE) và ethyl acetate (EA) để thu nhận các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau.
- Sắc ký cột (Column Chromatography - CC): Sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thuận (kích thước hạt 230 - 400 Mesh, hãng HIMEDIA - Ấn Độ). Quá trình giải ly được thực hiện với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: petroleum ether : ethyl acetate (PE:EA) và chloroform : methanol (C:M) theo các tỷ lệ thể tích xác định.
- Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC): Kiểm tra độ tinh khiết và nhóm gộp các phân đoạn bằng bản mỏng tráng sẵn nhôm Kieselgel $60\text{ F}_{254}$ (kích thước $20 \times 20\text{ cm}$, Merck). Thuốc thử hiện hình là dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ 20%}$ trong nước, phát hiện vết chất bằng cách sấy hoặc hơ nóng.
- Phân tích phổ cấu trúc:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) được đo trên thiết bị Bruker DRX500 (tần số 500 MHz cho proton và 125 MHz cho carbon) tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội). Dung môi đo phổ là acetone-$d_6$ hoặc DMSO-$d_6$.
- Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo tại Phòng Phân tích Trung tâm 1, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng nghiên cứu:
- Mô tả thực vật học: Cung cấp thông tin định danh khoa học của Euphorbia hirta Linn., các tên gọi dân gian (cỏ sữa lá lớn, cỏ hen, cỏ rắn, cỏ lông mèo, vú sữa đất, thiên căn thảo) và hình thái giải phẫu của rễ, thân, lá, hoa, quả.
- Nghiên cứu dược tính và ứng dụng y học cổ truyền: Tổng hợp các đơn thuốc dân gian dùng cỏ sữa lá lớn chữa ho hen, kiết lỵ (phối hợp với hoàng đằng trong chế phẩm Codanzit), nứt nẻ môi, tiêu chảy và chứng thiếu sữa ở phụ nữ sau sinh. Tác giả trình bày các dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính chống co thắt phế quản trong hen suyễn, hoạt tính dọn gốc tự do chống oxy hóa của các hợp chất phenolic, và tác dụng ức chế chọn lọc protein iNOS kháng viêm trên tế bào RAW 264.7.
- Lịch sử nghiên cứu thành phần hóa học: Trình bày niên biểu phân lập các hợp chất từ cỏ sữa lá lớn từ năm 1966 đến năm 2013, bao gồm triterpenoid (taraxerol, friedelin, cycloartenol, euphorbol), các dẫn xuất galloyl glucose ($1,2,3,4,6\text{-penta-}O\text{-galloyl-}\beta\text{-D-glucose}$), các ankan ($n\text{-heptacosane}$, $n\text{-nonacosane}$), dẫn xuất diterpenoid ent-kaurane, và hợp chất megastigmane glucoside (hirtionoside A).
Chương 2: Thực nghiệm
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình xử lý 12 kg bột cây cỏ sữa lá lớn thu hái tại Đồng Nai (mẫu do TS. Phạm Văn Ngọt, Bộ môn Thực vật học, Trường ĐH Sư phạm TP.HCM giám định tên khoa học). Bột cây sau khi ngâm dầm trong cồn $96^\circ$ và cô quay thu hồi dung môi đã cho 635 gam cao tổng ethanol. Tiến hành chiết lỏng - lỏng phân bố thu được 60,4 gam cao petroleum ether và 335,27 gam cao ethyl acetate.
Quá trình chia tách cao ethyl acetate (335,27 g) bằng sắc ký cột silica gel trải qua nhiều bước nối tiếp:
| Ký hiệu bước sắc ký |
Khối lượng mẫu nạp cột |
Hệ dung môi giải ly |
Kết quả phân đoạn / Sản phẩm cô lập |
| Cột sơ bộ cao EA |
335,27 g |
PE:EA (tỷ lệ tăng dần) |
Thu 5 phân đoạn lớn: EA.1 (60,057 g), EA.2 (54,502 g), EA.3 (50,811 g), EA.4 (103,501 g), EA.5 (20,011 g) |
| Cột phân đoạn EA.1 |
60,057 g |
PE:EA (5:5) |
Thu 3 phân đoạn nhỏ: EA.1.1 (29,126 g), EA.1.2 (6,456 g), EA.1.3 |
| Cột phân đoạn EA.1.1 |
29,126 g |
PE:EA (5:5) và (2:8) |
Thu 5 phân đoạn: EA.1.1.1 đến EA.1.1.5 (trong đó EA.1.1.4: 5,020 g) |
| Cột phân đoạn EA.1.1.4 |
5,020 g |
C:M (10:1) và (9:1) |
Thu các phân đoạn nhỏ (trong đó EA.1.1.4.3: 273 mg) |
| Cột phân đoạn EA.1.1.4.3 |
273 mg |
C:M (9:1) |
Cô lập được 4 mg hợp chất EH5 ($R_f = 0,28$ trong hệ C:M 8:2) |
| Cột phân đoạn EA.2 |
54,502 g |
PE:EA (3:7) |
Thu các phân đoạn nhỏ: EA.2.1 (18,260 g), EA.2.2 (6,485 g), EA.2.3 (15,742 g) |
| Cột phân đoạn EA.2.1 |
18,260 g |
PE:EA (3:7) và (2:8) |
Thu 4 phân đoạn nhỏ: EA.2.1.1 đến EA.2.1.4 (trong đó EA.2.1.3: 2,742 g) |
| Cột phân đoạn EA.2.1.3 |
2,742 g |
C:M (9:1) |
Thu 3 phân đoạn nhỏ: EA.2.1.3.1 (498 mg), EA.2.1.3.2 (183 mg), EA.2.1.3.3 (892 mg) |
| Cột phân đoạn EA.2.1.3.1 |
498 mg |
C:M (8:1) |
Cô lập được 8 mg hợp chất EH2 ($R_f = 0,30$ trong hệ C:M 8:2) |
Chương 3: Kết quả - Thảo luận
Chương 3 biện luận chi tiết cấu trúc hóa học của 2 hợp chất cô lập được dựa trên các dữ liệu phổ nghiệm thực nghiệm:
1. Cấu trúc hóa học của hợp chất EH5 (4 mg)
Hợp chất EH5 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng.
- Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz, acetone-}d_6$) chỉ xuất hiện duy nhất 1 mũi đơn tại $\delta_{\text{H}}\text{ 7,14 ppm (2H, s)}$, tương ứng với 2 proton có vị trí đối xứng trên vòng thơm benzene.
- Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\text{ MHz, acetone-}d_6$) kết hợp phổ DEPT cho thấy 5 tín hiệu carbon: 1 carbon carbonyl của nhóm carboxylic acid tại $\delta_{\text{C}}\text{ 167,6 ppm}$ (-COOH); 1 tín hiệu nhóm CH thơm tại $\delta_{\text{C}}\text{ 110,1 ppm}$ (tương ứng 2 carbon tương đương C-2 và C-6); và 3 carbon thơm tứ cấp tại $\delta_{\text{C}}\text{ 146,0 ppm}$ (2 carbon C-3, C-5 mang nhóm -OH), $\delta_{\text{C}}\text{ 138,6 ppm}$ (C-4 mang nhóm -OH) và $\delta_{\text{C}}\text{ 122,1 ppm}$ (C-1 gắn nhóm -COOH).
- Kết luận: Dữ liệu phổ nghiệm xác định EH5 là gallic acid (acid 3,4,5-trihydroxybenzoic).
2. Cấu trúc hóa học của hợp chất EH2 (8 mg)
Hợp chất EH2 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng, cho vết tròn rõ màu cam trên bản mỏng TLC khi hiện hình bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ 20%}$ và hơ nóng ($R_f = 0,30$, hệ dung môi C:M 8:2).
- Phổ FT-IR ghi nhận các vân hấp thụ đặc trưng: dải rộng tù $2500 - 3600\text{ cm}^{-1}$ (dao động hóa trị của nhóm -OH liên kết hydro), mũi $1658,84\text{ cm}^{-1}$ (nhóm carbonyl $\text{C=O}$ liên hợp), $1604,83$ và $1504,53\text{ cm}^{-1}$ (liên kết $\text{C=C}$ vòng thơm), cùng mũi $1458,23\text{ cm}^{-1}$ (dao động biến dạng của nhóm $-\text{CH}_3$).
- Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz, DMSO-}d_6$) thể hiện khung flavonoid aglycone với 5 proton thơm: vòng A gồm 2 proton ghép cặp meta tại $\delta_{\text{H}}\text{ 6,21 ppm (1H, d, } J = 1,5\text{ Hz, H-8)}$ và $\delta_{\text{H}}\text{ 6,39 ppm (1H, d, } J = 2,0\text{ Hz, H-6)}$; vòng B gồm hệ 3 proton ghép cặp kiểu ABX tại $\delta_{\text{H}}\text{ 7,30 ppm (1H, d, } J = 2,0\text{ Hz, H-2')}$, $\delta_{\text{H}}\text{ 6,87 ppm (1H, d, } J = 8,5\text{ Hz, H-5')}$ và $\delta_{\text{H}}\text{ 7,25 ppm (1H, dd, } J = 8,5\text{ và } 2,0\text{ Hz, H-6')}$. Mũi đơn tại $\delta_{\text{H}}\text{ 12,65 ppm (1H, s)}$ đặc trưng cho nhóm $5\text{-OH}$ tạo liên kết hydro nội phân tử với nhóm carbonyl tại C-4.
- Phần đường được xác định là $\alpha\text{-L-rhamnopyranose}$ nhờ tín hiệu proton anomer tại $\delta_{\text{H}}\text{ 5,26 ppm (1H, br s, H-1'')}$, nhóm methyl tại $\delta_{\text{H}}\text{ 0,82 ppm (3H, d, } J = 6,0\text{ Hz, H-6'')}$, cùng các tín hiệu proton khác của vòng đường phân bố từ $3,15$ đến $3,98\text{ ppm}$.
- Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và DEPT thể hiện đủ 21 tín hiệu carbon, bao gồm 1 nhóm $-\text{CH}3$ ($\delta{\text{C}}\text{ 17,4 ppm}$), 10 nhóm $=\text{CH}-$ ($\delta_{\text{C}}\text{ 70,0; 70,3; 70,5; 71,2; 93,6; 98,6; 115,4; 115,6; 120,7; 121,1 ppm}$) và 10 carbon tứ cấp (trong đó có carbon carbonyl $\text{C=O}$ tại $\delta_{\text{C}}\text{ 177,7 ppm}$).
- Phổ 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC) khẳng định sự liên kết giữa phân tử đường và khung aglycone: tương quan HMBC từ proton anomer $\text{H-1''}$ ($\delta_{\text{H}}\text{ 5,26 ppm}$) đến carbon tứ cấp C-3 ($\delta_{\text{C}}\text{ 134,2 ppm}$) chứng minh gốc đường rhamnose liên kết cộng hóa trị tại vị trí C-3 của aglycone quercetin.
- Kết luận: EH2 được xác định là quercetin-3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside (quercitrin).
Bảng đối chiếu số liệu phổ $^{13}\text{C-NMR}$ của hợp chất EH2 với tài liệu tham khảo:
| Vị trí Carbon |
$\delta_{\text{C}}$ thực nghiệm EH2 (DMSO-$d_6$, ppm) |
$\delta_{\text{C}}$ tài liệu [14] (DMSO-$d_6$, ppm) |
| 2 |
157,2 |
157,3 |
| 3 |
134,2 |
134,2 |
| 4 |
177,7 |
177,8 |
| 5 |
161,3 |
161,3 |
| 6 |
98,6 |
98,7 |
| 7 |
164,2 |
164,2 |
| 8 |
93,6 |
93,6 |
| 9 |
156,4 |
156,4 |
| 10 |
104,1 |
104,1 |
| 1' |
120,7 |
120,8 |
| 2' |
115,6 |
115,7 |
| 3' |
145,2 |
145,2 |
| 4' |
148,4 |
148,4 |
| 5' |
115,4 |
115,5 |
| 6' |
121,1 |
120,8 |
| 1'' |
102,0 |
102,1 |
| 2'' |
70,5 |
70,6 |
| 3'' |
70,3 |
70,4 |
| 4'' |
71,2 |
71,2 |
| 5'' |
70,0 |
70,1 |
| 6'' |
17,4 |
17,5 |
Chương 4: Kết luận - Đề xuất
Chương 4 đúc kết các kết quả đạt được và nêu kiến nghị khoa học:
- Đã chiết tách và điều chế thành công cao tổng ethanol cùng hai phân đoạn cao petroleum ether và cao ethyl acetate từ 12 kg dược liệu cỏ sữa lá lớn tỉnh Đồng Nai.
- Sử dụng sắc ký cột silica gel đã phân lập được 2 hợp chất hữu cơ từ cao ethyl acetate: gallic acid (EH5, khối lượng 4 mg) và quercitrin (EH2, khối lượng 8 mg).
- Đề xuất mở rộng nghiên cứu sang phân đoạn cao kém phân cực (petroleum ether) và tiếp tục phân tách các phân đoạn còn lại của cao ethyl acetate nhằm hoàn thiện bức tranh hóa học của loài cây này.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm cụ thể và đóng góp học thuật sau:
- Kết quả định lượng và phân lập:
- Xử lý thành công 12 kg nguyên liệu thực vật thô, điều chế được 635 g cao tổng ethanol (hiệu suất đạt ~5,29% theo khối lượng khô).
- Thu nhận 60,4 g cao petroleum ether và 335,27 g cao ethyl acetate bằng phương pháp phân bố lỏng - lỏng.
- Tách tinh khiết 4 mg hợp chất polyphenol EH5 (gallic acid) từ phân đoạn EA.1 và 8 mg hợp chất flavonoid glycoside EH2 (quercitrin) từ phân đoạn EA.2.
- Đóng góp về mặt dữ liệu phổ học: Xác lập hệ thống dữ liệu phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT) và 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC) đồng bộ ở tần số cao (500 MHz) cho quercitrin và gallic acid. Việc quy kết tín hiệu carbon và proton tương quan được chứng minh chặt chẽ, có độ tương thích cao với tài liệu quốc tế.
- Đóng góp về nguồn dược liệu địa phương: Công trình cung cấp minh chứng hóa học thực nghiệm khẳng định cây cỏ sữa lá lớn thu hái tại tỉnh Đồng Nai chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng (acid gallic và quercitrin). Đây là cơ sở khoa học giải thích cho các tác dụng dược lý dân gian như chống viêm phế quản, kháng khuẩn đường ruột và chống oxy hóa của loài cây này tại Việt Nam.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế được ghi nhận trong văn bản: Do giới hạn về mặt thời gian thực hiện khóa luận cử nhân, nghiên cứu mới chỉ tập trung phân tách một nhánh nhỏ trong phân đoạn cao ethyl acetate (cụ thể là các tiểu phân đoạn của EA.1 và EA.2). Phân đoạn cao petroleum ether (60,4 g) cùng các phân đoạn lớn khác của cao ethyl acetate (EA.3 với 50,811 g; EA.4 với 103,501 g; EA.5 với 20,011 g) và các phân đoạn phụ nhiều vết mờ vẫn chưa được khảo sát. Ngoài ra, khóa luận chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp trên các chất tinh khiết cô lập được.
- Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Tiến hành sắc ký cột phân lập hoạt chất trên toàn bộ lượng cao petroleum ether và các phân đoạn lớn EA.3, EA.4, EA.5 còn lưu trữ.
- Đánh giá hoạt tính sinh học thực nghiệm (in vitro) đối với các phân đoạn cao chiết và các hợp chất tinh khiết thu được (như hoạt tính kháng khuẩn đường ruột, ức chế vi khuẩn lỵ hoặc khả năng quét gốc tự do).
Giá trị tham khảo
Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:
- Sinh viên, học viên chuyên ngành Hóa Hữu cơ, Hóa Dược và Hóa Hợp chất thiên nhiên: Cung cấp quy trình thực nghiệm mẫu mực về kỹ thuật ngâm dầm, chiết phân bố lỏng - lỏng quy mô phòng thí nghiệm (từ 12 kg dược liệu), cùng phương pháp lựa chọn gradient dung môi giải ly cho sắc ký cột silica gel (hệ PE:EA và Chloroform:Methanol).
- Người nghiên cứu về kiểm nghiệm dược liệu và thực vật học: Cung cấp thông số nhận diện sắc ký bản mỏng ($R_f$, hệ dung môi giải ly, chất hiện hình $\text{H}_2\text{SO}_4\text{ 20%}$) và bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chi tiết của quercitrin và acid gallic, phục vụ công tác tra cứu, so sánh và kiểm nghiệm nguyên liệu cỏ sữa lá lớn.
Câu hỏi thường gặp
1. Nguồn mẫu cây cỏ sữa lá lớn trong khóa luận được thu hái ở đâu và định danh khoa học như thế nào?
Mẫu cây cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) được thu hái tại tỉnh Đồng Nai. Mẫu thực vật sau đó được phân loại và định danh khoa học chính xác bởi TS. Phạm Văn Ngọt thuộc Bộ môn Thực vật học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh trước khi đưa vào phơi sấy và chiết xuất.
2. Từ 12 kg bột cây khô, quy trình chiết xuất thu được bao nhiêu gam cao tổng và các cao phân đoạn?
Quá trình ngâm dầm 12 kg bột cây khô trong dung môi ethanol $96^\circ$ và cô quay đuổi dung môi thu được 635 gam cao tổng ethanol. Tiếp tục chiết phân bố lỏng - lỏng lượng cao tổng này đã phân lập được 60,4 gam cao petroleum ether (kém phân cực) và 335,27 gam cao ethyl acetate (phân cực trung bình).
3. Hợp chất EH5 được xác định cấu trúc là chất gì và dựa trên những đặc điểm phổ NMR then chốt nào?
Hợp chất EH5 (4 mg) là chất rắn màu trắng được xác định là gallic acid (acid 3,4,5-trihydroxybenzoic). Cấu trúc này được chứng minh qua phổ $^1\text{H-NMR}$ chỉ có 1 tín hiệu mũi đơn tại $\delta_{\text{H}}\text{ 7,14 ppm (2H, s)}$ của hai proton thơm đối xứng trên vòng benzene; và phổ $^{13}\text{C-NMR}$/DEPT hiển thị 5 tín hiệu carbon đặc trưng gồm carbon acid carboxylic ($\delta_{\text{C}}\text{ 167,6 ppm}$), 2 nhóm CH thơm tương đương ($\delta_{\text{C}}\text{ 110,1 ppm}$), cùng các carbon tứ cấp gắn oxy ($\delta_{\text{C}}\text{ 146,0 ppm}$ và $138,6\text{ ppm}$) và gắn nhóm carboxyl ($\delta_{\text{C}}\text{ 122,1 ppm}$).
4. Bằng chứng phổ 2D-NMR nào khẳng định gốc đường rhamnose liên kết tại vị trí C-3 trên khung aglycone của hợp chất EH2?
Trên phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC) của hợp chất EH2, proton anomer của phân tử đường $\alpha\text{-L-rhamnopyranose}$ tại $\delta_{\text{H}}\text{ 5,26 ppm (1H, br s, H-1'')}$ cho tương quan trực tiếp với carbon tứ cấp C-3 tại $\delta_{\text{C}}\text{ 134,2 ppm}$ trên khung flavonoid. Tương quan này chứng minh gốc đường rhamnose được gắn qua liên kết glycoside tại vị trí C-3 của aglycone quercetin, khẳng định hợp chất là quercetin-3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside (quercitrin).
5. Khóa luận còn những phân đoạn chiết xuất nào chưa được nghiên cứu thành phần hóa học?
Do giới hạn về thời gian, tác giả chưa tiến hành khảo sát thành phần hóa học của toàn bộ 60,4 g cao petroleum ether. Đồng thời, đối với cao ethyl acetate, nghiên cứu mới chỉ phân lập được chất ở một số nhánh của phân đoạn EA.1 và EA.2; các phân đoạn lớn khác gồm EA.3 (50,811 g), EA.4 (103,501 g), EA.5 (20,011 g) cùng nhiều phân đoạn phụ vẫn chưa được sắc ký phân tách triệt để.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ngô Văn Khuê đã thực hiện thành công quy trình chiết xuất từ 12 kg dược liệu cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái tại tỉnh Đồng Nai và chia tách có định hướng phân đoạn cao ethyl acetate. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel kết hợp các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (IR, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC), đề tài đã phân lập và xác định hoàn chỉnh cấu trúc hóa học của hai hợp chất thứ cấp là gallic acid (4 mg) và quercitrin (8 mg). Kết quả thực nghiệm này đóng góp dữ liệu khoa học tin cậy vào việc chuẩn hóa thành phần hóa học của nguồn dược liệu cỏ sữa lá lớn tại Việt Nam, đồng thời mở ra định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo trên các phân đoạn cao chiết còn lại.
