Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá propionibacterium acnes của cao chiết từ cây trứng cá muntingia calabura l

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes từ cao chiết cây trứng cá Muntingia calabura.

• Tác giả: Lê Phượng Hiệp
• Người hướng dẫn: Ths. Dương Thị Bích
• Trường học: Đại học Tây Đô
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes từ cao chiết cây trứng cá Muntingia calabura
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM KẾT
• TÓM TẮT NỘI DUNG
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ
• 2.2. Phân loại bệnh trứng cá
• 2.3. Cơ chế gây bệnh trứng cá
• 2.4. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay
• 2.5. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES
• 2.6. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes
• 2.7. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ
• 2.7.1. Nguồn gốc cây Trứng cá
• 2.7.2. Phân loại cây trứng cá
• 2.7.3. Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá
• 2.7.4. Tác dụng dược lý cây Trứng cá
• 2.8. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 2.8.1. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới
• 2.8.2. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
• 3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
• 3.2.1. Nguyên vật liệu
• 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
• 3.2.3. Hóa chất và môi trường
• 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu
• 3.3.2. Phương pháp chọn mẫu
• 3.3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
• 3.5. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Propionibacterium acnes
• 4.2. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá
• 4.3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes
• 4.4. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá
• 4.5. Phân lập và định danh vi khuẩn
• 4.6. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây trứng cá
• 4.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes
• 4.8. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Tổng hợp số liệu thí nghiệm
• Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Khả năng ức chế vi khuẩn

Nghiên cứu tập trung vào khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura) đối với vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes. Các bộ phận của cây như lá, vỏ thân, quả chín và quả non được chiết xuất bằng ethanol 96%. Kết quả cho thấy tất cả các loại cao chiết đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn P. acnes, trong đó cao chiết từ lá thể hiện hiệu quả cao nhất với vòng vô khuẩn đạt 23 ± 1,732 mm ở nồng độ 200 mg/ml.

1.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch được sử dụng để đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết. Vi khuẩn P. acnes 134N được nuôi cấy và phân lập từ phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô. Các mẫu cao chiết được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau (200 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml) để xác định hiệu quả ức chế.

1.2. Kết quả và đánh giá

Kết quả cho thấy cao chiết từ lá Trứng cá có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất với giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) là 10 mg/ml. Điều này khẳng định tiềm năng của cao chiết từ lá Trứng cá trong việc phát triển các sản phẩm chăm sóc da và điều trị mụn trứng cá.

II. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Cao chiết từ lá Trứng cá được phân tích định tính các hợp chất sinh học, bao gồm flavonoid, saponin và tanin. Các hợp chất này được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa, góp phần vào hiệu quả ức chế vi khuẩn P. acnes.

2.1. Định tính hợp chất

Phương pháp định tính sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng để xác định sự hiện diện của flavonoid, saponin và tanin trong cao chiết. Kết quả cho thấy các hợp chất này có mặt với hàm lượng đáng kể, đặc biệt là flavonoid, được biết đến với khả năng ức chế vi khuẩn và giảm viêm.

2.2. Ứng dụng thực tiễn

Những phát hiện này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc sử dụng cây thuốc như Muntingia calabura để phát triển các sản phẩm chăm sóc da tự nhiên, đặc biệt là trong điều trị mụn trứng cá mà không gây tác dụng phụ như các loại thuốc tổng hợp.

III. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng

Nghiên cứu này góp phần vào việc tìm kiếm các giải pháp thay thế từ cây thuốc để điều trị mụn trứng cá, đặc biệt trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Cây Trứng cá, với nguồn gốc tự nhiên và dễ thu hái, là một ứng cử viên tiềm năng cho các nghiên cứu sâu hơn.

3.1. Nghiên cứu trong nước và quốc tế

Các nghiên cứu trước đây về Muntingia calabura đã chứng minh khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của loại cây này. Tuy nhiên, nghiên cứu này là một trong những nghiên cứu đầu tiên tập trung vào khả năng ức chế Propionibacterium acnes, mở ra hướng ứng dụng mới trong lĩnh vực chăm sóc da.

3.2. Giá trị thực tiễn

Kết quả nghiên cứu không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao, đặc biệt trong việc phát triển các sản phẩm từ cao chiết cây Trứng cá để điều trị mụn trứng cá một cách an toàn và hiệu quả.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh trứng cá (acne vulgaris) là một bệnh lý da liễu mạn tính phổ biến ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt trong giai đoạn dậy thì. Theo các số liệu dịch tễ học được tác giả trích dẫn, có khoảng 80% thanh niên Việt Nam từng mắc bệnh trứng cá ở các mức độ thương tổn khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997). Bệnh thường khu trú tại các vùng da tập trung nhiều tuyến bã nhờn như mặt, ngực và lưng. Mặc dù không đe dọa trực tiếp đến tính mạng, bệnh trứng cá gây ảnh hưởng tiêu cực đến tâm lý, thẩm mỹ, dẫn đến tâm lý lo âu và giảm sút sự tự tin trong giao tiếp xã hội (Mallon et al., 1999).

Cơ chế bệnh sinh của mụn trứng cá phức tạp, chịu sự chi phối của nhiều yếu tố: sự tăng tiết chất nhờn do kích thích nội tiết tố, rối loạn sừng hóa cổ nang lông, phản ứng viêm và sự tăng sinh của vi sinh vật tại chỗ. Trong đó, vi khuẩn Propionibacterium acnes được xác định là tác nhân vi sinh vật đóng vai trò quan trọng nhất trong việc kích hoạt phản ứng viêm và hình thành nhân mụn (Jappe, 2002). Tại Bệnh viện Da Liễu Thành phố Hồ Chí Minh, kết quả khảo sát trên 87 bệnh nhân ghi nhận có 42 trường hợp (chiếm 48,3%) phân lập được vi khuẩn P. acnes (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013).

Trong phác đồ điều trị quy ước hiện nay, các liệu pháp hóa dược và kháng sinh (như clindamycin, erythromycin, tetracyclin, benzoyl peroxid hay retinoid đường bôi và đường uống) thường được chỉ định. Tuy nhiên, việc điều trị kéo dài thường kèm theo nhiều tác dụng không mong muốn như kích ứng da, khô da, bong tróc, sạm da hoặc nguy cơ quái thai nghiêm trọng đối với dẫn chất vitamin A acid (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Đồng thời, tình trạng vi khuẩn P. acnes kháng thuốc kháng sinh đang gia tăng đáng kể trên toàn cầu và tại Việt Nam (tỷ lệ đề kháng clindamycin lên tới 88,1% và trimethoprim/sulfamethoxazol lên tới 95,2% theo khảo sát năm 2013 của Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng). Do đó, xu hướng nghiên cứu và phát triển các chế phẩm điều trị có nguồn gốc thảo dược tự nhiên nhằm tìm kiếm hoạt chất kháng khuẩn an toàn, sẵn có và giảm thiểu tình trạng kháng thuốc đang nhận được nhiều sự quan tâm.

Cây Trứng cá (Muntingia calabura L., họ Muntingiaceae, còn gọi là Mật sâm) là loài thực vật thân gỗ nhỏ phổ biến tại khu vực Nam Mỹ và Đông Nam Á. Tại Việt Nam, cây mọc hoang hoặc được trồng làm cây che bóng mát ven đường, có sinh khối lớn, dễ thu hái và chi phí thấp. Các công bố hóa thực vật quốc tế cho thấy các bộ phận của cây Trứng cá chứa hàm lượng cao các hợp chất polyphenol, flavonoid, saponin và tanin, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu ứng dụng dược học của loài cây này còn hạn chế, đặc biệt là đánh giá đối kháng trực tiếp trên chủng vi khuẩn gây bệnh trứng cá.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai nội dung:

1. Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).
2. Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ cây Trứng cá cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng thực vật: Mẫu lá, vỏ thân, quả non và quả chín của cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).
• Đối tượng vi sinh vật: Chủng vi khuẩn Propionibacterium acnes mã số 134N (được phân lập từ nghiên cứu đề kháng kháng sinh của Phạm Thị Tường Vy năm 2017 và lưu trữ tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh, Trường Đại học Tây Đô).
• Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại phường Thường Thạnh, quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ vào tháng 12 năm 2016. Toàn bộ các thực nghiệm chiết xuất, kiểm nghiệm và thử nghiệm vi sinh được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh và Phòng thí nghiệm Dược liệu thuộc Khoa Dược - Điều Dưỡng, Trường Đại học Tây Đô.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 12 năm 2016 đến tháng 04 năm 2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở lý thuyết vi sinh vật học y học, dược học cổ truyền kết hợp hóa học hợp chất thiên nhiên và phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro:

• Khung lý thuyết bệnh sinh và vi sinh vật học: Luận văn tổng hợp cơ chế gây bệnh của P. acnes thuộc họ Propionibacteriaceae. Đây là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, Gram dương, hình que, không sinh bào tử, có khả năng tiết enzyme lipase phân cắt chất béo trung tính (triglyceride) trong bã nhờn thành các acid béo tự do. Các acid béo này kích thích phản ứng viêm, thu hút bạch cầu đa nhân trung tính giải phóng enzyme thủy phân lysosome gây vỡ nang lông. Vi khuẩn này có các đặc tính sinh hóa đặc trưng gồm phản ứng catalase dương tính, sinh indol, khử nitrat và dịch hóa gelatin.
• Khung lý thuyết hóa thực vật và dược lý học: Cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) thuộc chi đơn loài Muntingia. Các nghiên cứu của Zakaria (2006, 2007, 2010), Mahmood (2014) và Vijayanand (2015) đã chứng minh dịch chiết lá, vỏ và quả của loài này chứa các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao (như quercetin, catechin, kaempferol, acid gallic, flavanone). Khung tham chiếu kiểm nghiệm dược liệu tuân theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (DĐVN IV) về giới hạn độ ẩm đối với dược liệu khô (không quá 13%) và cao đặc (không quá 20%).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm cụ thể gồm:

• Phương pháp chiết xuất dược liệu: Áp dụng phương pháp chiết nóng đun hồi lưu sử dụng dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ 65 - 70°C. Lá và vỏ thân được sấy khô ở 60°C trong 6 giờ đến khối lượng không đổi, xay thành bột thô, làm ẩm 30 phút rồi chiết với tỷ lệ dung môi 1:20 (w/v) trong 3 giờ, lặp lại 3 lần. Quả non và quả chín tươi được rửa sạch, xay nhuyễn và chiết với tỷ lệ dung môi 1:10 (w/v) trong 3 giờ, lặp lại 3 lần. Toàn bộ dịch chiết được lọc qua bông, gộp dịch chiết và cô thu hồi dung môi trên bếp cách thủy để thu cao đặc toàn phần.
• Phương pháp xác định chỉ tiêu lý - hóa của dược liệu: Đo độ ẩm nguyên liệu khô bằng phương pháp sấy đối chứng ở 105°C và cân độ ẩm hồng ngoại. Tính toán hiệu suất chiết xuất cao toàn phần theo tỷ lệ phần trăm khối lượng cao thu được so với khối lượng mẫu ban đầu.
• Phương pháp nuôi cấy và định danh vi khuẩn: Chủng P. acnes 134N từ ống bảo quản ở -40°C trong môi trường BHI bổ sung 20% glycerol được hoạt hóa trong môi trường TYEG (Trypticase - Yeast extract - Heart extract - Glycerol) lỏng, ủ ở 37°C từ 5 - 7 ngày. Phân lập trên môi trường thạch TYEG agar có bổ sung 0,002% bromocresol purple trong điều kiện kỵ khí. Kiểm tra đặc điểm hình thái và sinh hóa bằng phương pháp nhuộm Gram, thử nghiệm catalase với dung dịch H2O2 3%, thử nghiệm sinh indol bằng thuốc thử Kovac's trên môi trường TSB lỏng, thử nghiệm phản nitrat hóa trong môi trường pepton bổ sung KNO3, và thử nghiệm làm dịch hóa gelatin.
• Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion). Huyền phù vi khuẩn P. acnes sau 48 giờ nuôi cấy được chuẩn hóa về nồng độ 10^8 CFU/ml (tương đương chuẩn độ đục 0,5 McFarland), trải đều 50 µl lên bề mặt thạch TSB agar. Đục các giếng thạch đường kính 6 mm. Bơm 30 µl dung dịch cao chiết các bộ phận ở các nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml và 50 mg/ml (pha trong dimethyl sulfoxide - DMSO). Đối chứng dương sử dụng đĩa kháng sinh Levofloxacin 5 µg/ml; đối chứng âm là dung môi DMSO. Các đĩa thạch được giữ ở nhiệt độ phòng 30 phút để hoạt chất khuếch tán, sau đó ủ kỵ khí ở 37°C trong 48 giờ. Đo đường kính vòng vô khuẩn theo công thức: ĐK (mm) = D - d (trong đó D là đường kính vòng sáng, d là đường kính giếng thạch 6 mm). Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Khảo sát trên cao chiết có hoạt tính mạnh nhất ở dãy nồng độ pha loãng giảm dần: 40 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml và 5 mg/ml bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Giá trị MIC được ghi nhận tại nồng độ thấp nhất vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn.
• Phương pháp định tính sơ bộ nhóm hoạt chất: Dùng các phản ứng hóa học màu và tạo tủa đặc trưng trên cao chiết lá: phản ứng Cyanidin (cao chiết + methanol + bột Mg + HCl đậm đặc) để nhận diện Flavonoid; thử nghiệm tạo bọt bền trong nước ấm để nhận diện Saponin; phản ứng tạo tủa màu xanh đen với thuốc thử FeCl3 10% và dung dịch NaCl để nhận diện Tanin.
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm SPSS Statistics 20, phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) ở độ tin cậy 95% (p < 0,05) và so sánh các giá trị trung bình bằng phép kiểm Duncan.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng bệnh trứng cá tại Việt Nam, tác động tiêu cực của bệnh lên tâm lý người mắc, và vai trò của chủng Propionibacterium acnes. Tác giả nêu rõ hạn chế của các thuốc hóa dược hiện hành (tác dụng phụ gây kích ứng da, quái thai, và tỷ lệ kháng kháng sinh cao) và đặt vấn đề khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) - một nguồn thực vật giàu polyphenol, dễ tiếp cận nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ tại Đồng bằng sông Cửu Long. Chương mở đầu xác định 2 mục tiêu cụ thể và phương hướng giải quyết bằng thực nghiệm in vitro.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp các tài liệu khoa học liên quan đến bốn nội dung lớn:

• Tổng quan về bệnh mụn trứng cá: Lịch sử thuật ngữ, phân loại thương tổn (thể không viêm gồm mụn đầu đen, mụn đầu trắng; thể viêm gồm sẩn, mụn mủ, mụn nang) theo Hayashi (2008) và Phạm Hoàng Khâm (2011). Trình bày cơ chế bệnh sinh gồm bốn khâu liên hoàn và các phác đồ điều trị phổ biến cùng cơ chế tác động của benzoyl peroxid, retinoid, isotretinoin, kháng sinh bôi/uống.
• Vi khuẩn Propionibacterium acnes: Hệ thống phân loại học, đặc điểm vi sinh vật học, hình thái, cấu trúc thành tế bào (type I, II, III). Phân tích chi tiết các sản phẩm ngoại bào và độc lực của vi khuẩn gồm lipase, phospholipase C, protease, hyaluronidase, acid phosphatase, bacteriocin, histamin và tryptamin tham gia vào quá trình phá hủy biểu mô nang lông và gây viêm.
• Cây Trứng cá (Muntingia calabura L.): Nguồn gốc xuất xứ từ Nam Mỹ, đặc điểm hình thái thực vật học (cành mọc ngang, phiến lá bất đối xứng có lông, hoa trắng 5 cánh, quả mọng chứa nhiều hạt nhỏ li ti). Tổng hợp các nhóm hoạt chất hóa học đã được phân lập từ lá, vỏ thân và quả (dẫn xuất flavonoid, steroid, acid phenolic). Các nghiên cứu dược lý học về độc tính cấp đường uống (liều an toàn lên tới 2000 - 5000 mg/kg trên chuột), hoạt tính độc tế bào ung thư, hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ tim mạch và hạ đường huyết.
• Tình hình nghiên cứu cao chiết cây Trứng cá trong và ngoài nước: Tổng kết các công trình quốc tế của Zakaria et al. (2006, 2007, 2010, 2011) về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá trên Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli. Đánh giá thực trạng nghiên cứu trong nước khi cây Trứng cá phần lớn chỉ được nhìn nhận dưới góc độ sinh thái, che bóng mát đô thị, thiếu các công trình nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh học y dược.

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 mô tả địa điểm thực hiện (Phòng thí nghiệm Vi sinh và Dược liệu - Trường Đại học Tây Đô), thời gian nghiên cứu (tháng 12/2016 đến tháng 04/2017) và toàn bộ hệ thống trang thiết bị thí nghiệm (tủ cấy kỵ khí, tủ sấy, kính hiển vi Olympus CX-21, cân phân tích Shimadzu, hệ thống đun hồi lưu). Nội dung phương pháp trình bày chi tiết quy trình xử lý nguyên liệu thực vật, quy trình chiết xuất cao đặc bằng ethanol 96%, quy trình nuôi cấy - phân lập và các thử nghiệm sinh hóa kiểm tra chủng P. acnes 134N. Chi tiết hóa thiết kế thí nghiệm khuếch tán giếng thạch, cách bố trí lô đối chứng (Levofloxacin và DMSO), công thức tính đường kính vòng vô khuẩn, phương pháp xác định MIC và các phản ứng định tính hóa thực vật kèm các giải pháp khắc phục sai số thực nghiệm.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được qua các bước nghiên cứu:

• Kết quả chiết xuất và xác định độ ẩm, hiệu suất chiết: Đánh giá độ ẩm của nguyên liệu thô và cao chiết, so sánh hiệu suất thu hồi cao giữa 4 bộ phận thực vật.
• Kết quả định danh vi khuẩn P. acnes 134N: Mô tả hình thái khuẩn lạc trên môi trường TYEG agar bổ sung bromocresol purple (khuẩn lạc nhỏ 0,8 - 1,3 mm, màu vàng đục, mô cao, làm đổi màu chỉ thị từ tím sang vàng do sinh acid propionic). Tế bào hình que ngắn, bắt màu tím Gram (+). Các phản ứng sinh hóa cho kết quả: catalase (+), sinh indol (+), phản nitrat hóa (+), và dịch hóa gelatin (+), khẳng định độ thuần khiết và tính chính xác của chủng vi khuẩn thử nghiệm.
• Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes: Phân tích số liệu kích thước vòng vô khuẩn của 4 loại cao ở ba mức nồng độ (50, 100, 200 mg/ml). Chứng minh hoạt tính ức chế vi khuẩn của cao chiết tỷ lệ thuận với nồng độ khảo sát; trong đó cao lá thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất ở tất cả các nồng độ.
• Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Trình bày số liệu vòng kháng khuẩn của cao lá ở các nồng độ 40, 20, 10, 5 mg/ml, từ đó xác định ngưỡng MIC là 10 mg/ml.
• Kết quả định tính hóa thực vật: Trình bày hiện tượng chuyển màu và tạo tủa của các phản ứng hóa học, xác nhận sự có mặt của flavonoid, saponin và tanin trong cao chiết lá.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Tác giả đúc kết lại các phát hiện thực nghiệm cốt lõi của khóa luận về hiệu suất chiết, hoạt tính kháng khuẩn của các bộ phận cây Trứng cá, giá trị MIC của cao lá và các nhóm hoạt chất sinh học được định tính. Đồng thời, đưa ra các đề xuất nghiên cứu tiếp nối về việc chiết phân đoạn, tinh sạch hoạt chất và phát triển công thức bào chế ứng dụng.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và phân tích đầy đủ các số liệu thực nghiệm khoa học, được tổng hợp qua các bảng số liệu sau:

Bảng 1: Kết quả kiểm tra độ ẩm nguyên liệu và cao chiết cây Trứng cá

Bộ phận cây Trứng cá	Độ ẩm nguyên liệu khô (%)	Độ ẩm cao chiết (%)	Trạng thái thể chất cao
Lá	12,80	17,38	Cao đặc
Vỏ thân	13,00	15,00	Cao đặc
Quả chín	-	19,05	Cao đặc
Quả non	-	18,82	Cao đặc

Ghi chú: Độ ẩm nguyên liệu khô của lá và vỏ thân đều đạt tiêu chuẩn DĐVN IV (< 13%). Độ ẩm của cả 4 loại cao chiết đều dưới 20%, đáp ứng quy định về thể chất cao đặc theo Dược điển.

Bảng 2: Kết quả khối lượng và hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá bằng ethanol 96%

Loại bộ phận	Khối lượng mẫu ban đầu (g)	Khối lượng cao thu được (g)	Hiệu suất chiết (%)
Lá (khô)	207,75	90,04	43,34
Vỏ thân (khô)	212,65	70,74	33,27
Quả chín (tươi)	300,00	102,16	34,05
Quả non (tươi)	300,00	74,45	24,82

Ghi chú: Cao chiết lá Trứng cá đạt hiệu suất chiết xuất cao nhất (43,34%), tiếp theo là quả chín (34,05%), vỏ thân (33,27%) và thấp nhất là quả non (24,82%).

Bảng 3: Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes 134N của các loại cao chiết (phương pháp khuếch tán giếng thạch)

Loại cao chiết	Đường kính vòng vô khuẩn (mm) ở các nồng độ thử nghiệm			Đối chứng dương (Levofloxacin 5 µg/ml)	Đối chứng âm (DMSO)
	50 mg/ml	100 mg/ml	200 mg/ml
Vỏ thân	10,33 ± 0,577ᵃ	11,67 ± 1,155ᵃ	16,67 ± 2,309ᵃ	0	0
Quả chín	11,00 ± 0,000ᵃ	13,33 ± 1,528ᵃ	20,00 ± 1,000ᵃ	0	0
Quả non	11,67 ± 0,577ᵇ	18,00 ± 1,000ᵇ	20,67 ± 1,155ᵇ	8,67 ± 0,577ᵇ	0
Lá	16,33 ± 2,082ᶜ	19,00 ± 0,000ᵇ	23,00 ± 1,732ᵇ	8,67 ± 0,577ᵇ	0
Mức ý nghĩa (p)	0,032	0,000	0,010	0,000	-

Ghi chú: Số liệu là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột, các giá trị có chữ cái theo sau giống nhau thì không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Đối chứng âm DMSO hoàn toàn không tạo vòng vô khuẩn (0 mm).

Bảng 4: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao lá Trứng cá trên vi khuẩn P. acnes 134N

Nồng độ cao chiết lá (mg/ml)	Đường kính vòng vô khuẩn trung bình (mm)	Đánh giá hoạt tính
40	11 ± 1	Dương tính (+)
20	9 ± 1	Dương tính (+)
10	6 ± 0	Dương tính (+) (Ngưỡng MIC)
5	0	Âm tính (-)

Ghi chú: Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá đối với dòng vi khuẩn P. acnes 134N được xác định chính xác là 10 mg/ml.

Bảng 5: Kết quả định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết lá Trứng cá

Tên nhóm hợp chất	Phương pháp thực nghiệm	Hiện tượng quan sát	Kết luận
Flavonoid	1 g cao + 2 ml methanol + bột Mg + 0,5 ml HCl đậm đặc (phản ứng Cyanidin)	Dung dịch chuyển sang màu đỏ	Dương tính (+)
Saponin	5 g cao + 5 ml nước cất, đun ấm, lắc mạnh	Xuất hiện cột bọt bền	Dương tính (+)
Tanin	1 g cao + 20 ml nước cất + vài giọt dung dịch NaCl và FeCl3 10%	Xuất hiện kết tủa màu xanh đen	Dương tính (+)

Các giải pháp và đóng góp khoa học chính của tác giả:

• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có hệ thống khẳng định cả 4 bộ phận của cây Trứng cá đều có khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes 134N. Trong đó, cao lá thể hiện hiệu quả kháng khuẩn vượt trội so với vỏ thân, quả chín, quả non và có đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn đĩa kháng sinh đối chứng Levofloxacin ở các nồng độ khảo sát.
• Xác định được thông số định lượng cụ thể: nồng độ ức chế tối thiểu MIC của cao lá là 10 mg/ml, đồng thời xác lập hiệu suất chiết xuất cao toàn phần của lá bằng ethanol 96% đạt 43,34%.
• Chứng minh thành phần hóa thực vật trong cao lá Trứng cá có chứa các nhóm hoạt chất sinh học quan trọng gồm flavonoid, saponin và tanin. Đây là tiền đề khoa học khẳng định lá Trứng cá là nguồn dược liệu tự nhiên tiềm năng, giá thành rẻ, sẵn có tại địa phương để tiếp tục nghiên cứu các chế phẩm điều trị bệnh trứng cá thay thế hoặc hỗ trợ giảm liều kháng sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trong điều kiện phòng thí nghiệm; chưa tiến hành khảo sát trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) hoặc thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh.
• Đối tượng thử nghiệm vi sinh mới chỉ thực hiện trên một chủng vi khuẩn duy nhất được lưu trữ tại phòng thí nghiệm (Propionibacterium acnes 134N), chưa mở rộng khảo sát trên nhiều chủng phân lập tươi từ các bệnh nhân da liễu khác nhau để đánh giá phổ tác dụng và tính đại diện.
• Phương pháp chiết xuất nóng đun hồi lưu ở nhiệt độ 65 - 70°C trong thời gian kéo dài có thể gây biến tính hoặc suy giảm hàm lượng một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp kém bền với nhiệt độ.
• Nghiên cứu mới thực hiện định tính sơ bộ sự hiện diện của các nhóm chất (flavonoid, saponin, tanin) bằng phản ứng hóa học màu và tủa, chưa tiến hành định lượng hàm lượng tổng và chưa phân lập, nhận dạng cấu trúc các hoạt chất tinh khiết đơn lẻ chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính kháng khuẩn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

• Tiến hành chiết phân đoạn cao toàn phần từ lá Trứng cá với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (như n-hexan, chloroform, ethyl acetat, nước) để định vị và thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn P. acnes mạnh nhất.
• Ứng dụng các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, HPLC) để phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết có hoạt tính sinh học từ lá Trứng cá.
• Đánh giá độc tính trên tế bào da, độc tính bán trường diễn và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn trên các mô hình bệnh học in vivo.
• Nghiên cứu thiết kế và xây dựng công thức bào chế dạng thuốc dùng ngoài da (như gel bôi trị mụn, kem hoặc dung dịch rửa) chứa cao chiết lá Trứng cá, đồng thời đánh giá độ ổn định và sinh khả dụng của chế phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp này có giá trị tham khảo chuyên môn thiết thực cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Dược học, Vi sinh vật học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Công nghệ sinh học và Y học cổ truyền đang thực hiện các đề tài về sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của thực vật hoặc phát triển thuốc điều trị da liễu.
• Các nội dung có giá trị tham khảo cụ thể:
  • Quy trình chiết xuất dược liệu bằng phương pháp đun hồi lưu và các bước chuẩn hóa kiểm nghiệm độ ẩm, hiệu suất chiết theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
  • Quy trình phân lập, nuôi cấy, phục hồi và hệ thống các phản ứng sinh hóa chuẩn thức để định danh chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc Propionibacterium acnes trên môi trường chuyên biệt TYEG bổ sung bromocresol purple.
  • Thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên vi khuẩn kỵ khí.
  • Cơ sở dữ liệu và danh mục tài liệu tham khảo phong phú về thành phần hóa thực vật, tác dụng dược lý của cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) cũng như tổng quan cơ chế bệnh sinh của bệnh mụn trứng cá.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi khuẩn Propionibacterium acnes sử dụng trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu và được định danh bằng các tiêu chí sinh hóa nào? Chủng vi khuẩn được sử dụng mang mã số Propionibacterium acnes 134N, có nguồn gốc từ đề tài nghiên cứu về tình hình đề kháng kháng sinh của tác giả Phạm Thị Tường Vy (2017), được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm Vi sinh - Trường Đại học Tây Đô. Chủng được khẳng định danh tính thông qua các đặc điểm: tạo khuẩn lạc nhỏ (0,8 - 1,3 mm), màu vàng đục, mô cao, làm môi trường thạch TYEG bổ sung bromocresol purple chuyển từ tím sang vàng (do sinh acid propionic); tế bào hình que ngắn, Gram dương; cho kết quả dương tính với phản ứng catalase, thử nghiệm sinh indol bằng thuốc thử Kovac's, phản ứng phản nitrat hóa và làm dịch hóa gelatin.

2. Hiệu suất chiết xuất cao toàn phần từ các bộ phận của cây Trứng cá chênh lệch như thế nào? Khi chiết xuất bằng phương pháp đun hồi lưu với dung môi ethanol 96%, hiệu suất chiết cao toàn phần có sự khác biệt rõ rệt giữa các bộ phận: lá Trứng cá đạt hiệu suất cao nhất với 43,34% (thu được 90,04 g cao từ 207,75 g bột lá khô); tiếp theo là quả chín tươi đạt 34,05% (thu được 102,16 g cao từ 300 g quả); vỏ thân khô đạt 33,27% (thu được 70,74 g cao từ 212,65 g mẫu); và quả non tươi có hiệu suất thấp nhất đạt 24,82% (thu được 74,45 g cao từ 300 g mẫu).

3. Khả năng kháng vi khuẩn P. acnes của cao lá Trứng cá thể hiện như thế nào so với các bộ phận khác và đối chứng? Ở cả ba mức nồng độ thử nghiệm (50, 100 và 200 mg/ml), cao lá đều tạo ra kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất và có ý nghĩa thống kê: ở 50 mg/ml đạt 16,33 ± 2,082 mm (trong khi vỏ thân là 10,33 mm, quả chín là 11,00 mm, quả non là 11,67 mm); ở 100 mg/ml đạt 19,00 ± 0,000 mm; và ở 200 mg/ml đạt 23,00 ± 1,732 mm. Vòng ức chế của cao lá ở các nồng độ này đều lớn hơn vòng vô khuẩn của kháng sinh đối chứng dương Levofloxacin 5 µg/ml (đạt 8,67 ± 0,577 mm), trong khi đối chứng âm DMSO không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn (0 mm).

4. Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá đối với vi khuẩn P. acnes 134N là bao nhiêu? Thông qua phương pháp khuếch tán giếng thạch ở các dải nồng độ pha loãng 40 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml và 5 mg/ml, kết quả ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn tương ứng lần lượt là 11 ± 1 mm, 9 ± 1 mm, 6 ± 0 mm và 0 mm (mất hoạt tính tại 5 mg/ml). Do đó, nồng độ 10 mg/ml được xác định là giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá trên chủng vi khuẩn thử nghiệm.

5. Cao chiết lá Trứng cá cho phản ứng dương tính với những nhóm hợp chất hóa thực vật nào? Các phép thử định tính hóa thực vật trên dịch chiết ethanol của lá Trứng cá cho kết quả dương tính với ba nhóm hợp chất tự nhiên: nhóm Flavonoid (dung dịch xuất hiện màu đỏ qua phản ứng Cyanidin với bột Mg và acid hydrocloric đậm đặc), nhóm Saponin (tạo cột bọt bền khi lắc mạnh dịch chiết pha trong nước ấm), và nhóm Tanin (tạo kết tủa màu xanh đen đặc trưng khi phản ứng với dung dịch sắt(III) clorid 10% và natri clorid).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Phượng Hiệp đã tiến hành khảo sát thực nghiệm có hệ thống về khả năng ức chế vi khuẩn kỵ khí gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes 134N của cao chiết ethanol từ 4 bộ phận cây Trứng cá (Muntingia calabura L.). Kết quả thực nghiệm khẳng định cao chiết từ lá có hiệu suất chiết cao nhất (43,34%) và hoạt tính kháng khuẩn vượt trội nhất với đường kính vòng vô khuẩn đạt 23 mm ở nồng độ 200 mg/ml cùng giá trị MIC được xác lập là 10 mg/ml. Phép thử hóa thực vật đã xác nhận sự hiện diện của các nhóm hoạt chất flavonoid, saponin và tanin trong cao lá, qua đó chứng minh tiềm năng khoa học thực tiễn của lá cây Trứng cá như một nguồn nguyên liệu thảo dược tự nhiên triển vọng cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm da liễu trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh trứng cá là bệnh lý về da thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt là giai đoạn dậy thì, có khoảng 80 % thanh niên Việt Nam bị bệnh trứng cá với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997). Bệnh trứng cá thường xuất hiện vùng da mặt, lưng và ngực. Tuy ít ảnh hưởng sức khoẻ nhưng ảnh hưởng khá lớn đến tâm lý, thẩm mỹ và giao tiếp xã hội của bệnh nhân. Nghiên cứu ở thanh thiếu niên bị bệnh trứng cá cho thấy mức độ lo lắng, ngại giao tiếp cao hơn so với người bệnh động kinh hay hen suyễn (Mallon et al.

Có nhiều nguyên nhân gây bệnh trứng cá như mất cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, do căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm (Park et al. acnes được xem là một trong các nguyên nhân chính gây bệnh trứng cá (Jappe, 2002). Tại bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh khảo sát 87 trường hợp bệnh nhân trứng cá có 42 trường hợp (chiếm 48,3 %) phân lập được vi khuẩn P. Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da, lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003).

Vì vậy việc tiếp cận các liệu pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ biến trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt Nam quan tâm. Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác dụng phụ so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược liệu có sẵn là rất cần thiết. Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa cao. Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc dân gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông Nam Á.

Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có khả năng kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic (Chenwitheesuk et al. Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây Trứng cá như flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005)) có khả năng chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn. Mặt khác cây Trứng cá là loại cây ven đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông Nam Á (Chin, 1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm. 1 Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau: 1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) 2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ Bệnh trứng cá được mô tả sớm nhất trong các bài viết Hy Lạp cổ đại của bác sĩ Byzantine Aetius Amidenus. Từ “acne” xuất phát từ acme trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “điểm” hoặc “tại chỗ”, acme viết sai thành acne và được sử dụng đến ngày nay (Humgara et al. Bệnh trứng cá là bệnh về da phổ biến nhất đặc biệt ở lứa tuổi thanh thiếu niên.