Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tài nguyên cây thuốc và tri thức y học cổ truyền giữ vai trò thiết yếu trong hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số tại các quốc gia đang phát triển phụ thuộc vào y học cổ truyền đối với nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, trong đó phần lớn dựa vào nguồn dược liệu tự nhiên và các dẫn xuất chiết xuất từ thực vật. Nhu cầu sử dụng dược liệu từ thảo mộc trên thế giới gia tăng đều đặn, điển hình như tại Trung Quốc đạt mức tiêu thụ khoảng 1.000 tấn/năm (tăng trưởng 9%/năm), còn tại khu vực châu Âu và Bắc Mỹ mức tăng trưởng đạt khoảng 10% mỗi năm.

Tại Việt Nam, điều tra tài nguyên dược liệu giai đoạn 2001–2005 của Viện Dược liệu ghi nhận hệ thực vật bậc cao có khoảng 10.500 loài thuộc 2.275 chi và 305 họ (ước tính đạt tới 12.000 loài, với 10% là loài đặc hữu), trong đó có 3.950 loài được sử dụng làm thuốc (chiếm 17% số loài cây thuốc trên thế giới). Chủ trương của ngành y tế là đẩy mạnh kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại, phát hiện và chuẩn hóa các hoạt chất tự nhiên từ nguồn dược liệu bản địa.

Cây Lông Cu Li (tên khoa học: Cibotium barometz (L.) J.Sm, thuộc họ Dicksoniaceae) là một loài cây thuốc quý mọc hoang dã tại nhiều vùng rừng núi Việt Nam. Dù trên thế giới đã có một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này, các công bố khoa học trong nước về thành phần hóa học chi tiết của các phân đoạn dịch chiết Lông Cu Li còn hạn chế. Do đó, đề tài "Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học từ các dịch chiết của Lông Cu Li (Cibotium Barometz L) ở Đà Lạt" được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa thực vật của đối tượng này.

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Tìm các điều kiện chiết tách thích hợp các chất từ lông cu li bằng các dung môi phân cực khác nhau.
  2. Xác định thành phần hóa học của một số dịch chiết từ lông cu li.
  3. Đóng góp thêm thông tin, tư liệu khoa học về loài lông cu li, tạo cơ sở khoa học ban đầu cho các nghiên cứu về sau.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lông của cây Lông Cu Li (Cibotium barometz (L.) J.Sm).
  • Phạm vi không gian: Nguyên liệu được thu hái tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu tươi thu hái vào tháng 8 năm 2017; các nội dung thực nghiệm được triển khai và hoàn thành từ ngày 01/08/2017 đến ngày 21/04/2018 tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng và Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và tổng quan hóa thực vật

Cây Lông Cu Li (Cibotium barometz) thuộc chi Cibotium Kaulfuss (chi gồm 12 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Mỹ, tại Việt Nam ghi nhận 1 loài duy nhất). Các công bố quốc tế và trong nước đã ghi nhận các nhóm hợp chất chính có trong cây gồm:

  • Axit béo và este: Axit palmitic ($C_{16}H_{32}O_2$), axit oleic ($C_{18}H_{34}O_2$), axit linoleic, axit stearic, este metylpalmitat, este etylstearat, hợp chất 1-mono-panmitin của glyxerol.
  • Hợp chất phenol và flavonoid: Axit protocatechuic (axit 3,4-dihydroxybenzoic), axit caffeic (axit 3,4-dihydroxycinnamic), (3R)-des-O-methyllasiodiplodin, 3,4-dihydroxybenzaldehyde, kaempferol, onychin.
  • Hợp chất sesquiterpen và dẫn xuất: Pterosin (perosin), isohistopterosin A, pterosin Y, pterosin Z, ptaquiloside.
  • Lipid phức tạp và glycosid: Cerebrosid, shinbarometin, các dẫn xuất glycolipid ức chế tế bào hủy xương (như (2S)-3-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)glyceryl-$\beta$-D-galactopyranoside), đường sucrose.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nguyên liệu Lông Cu Li (Đà Lạt)
  1. Phương pháp chiết tách:
    • Chiết chưng ninh trực tiếp: Sử dụng 12 g mẫu khô chia vào 4 bình cầu, mỗi bình 150 ml lần lượt với 4 dung môi: n-Hexane (chưng ninh ở 70°C), Benzene (80°C), Dichloromethane (40°C), Ethyl acetate (80°C). Thực hiện 3 lần, mỗi lần 6 giờ, khuấy đều định kỳ mỗi giờ. Thu dịch lọc, cô cạn định mức thành 250 ml và cô đặc thu cao.
    • Chiết tổng và chiết phân bố lỏng - lỏng: Chưng ninh 21 g mẫu khô với Ethanol 96% (3 bình cầu, mỗi bình 200 ml, 85°C, 3 lần x 4 giờ). Dịch chiết cồn gộp lại định mức 500 ml, sau đó cô thu cao rắn. Hòa tan cao cồn trong 200 ml nước cất, tiến hành chiết lỏng - lỏng phân đoạn tuần tự theo chiều tăng dần của chỉ số phân cực: n-Hexane (chỉ số 0) $\rightarrow$ Benzene (2,7) $\rightarrow$ Dichloromethane (3,1) $\rightarrow$ Ethyl acetate (4,4). Mỗi hệ dung môi lắc chiết 2 lần x 250 ml trong 4 giờ.
  2. Phương pháp định tính hóa học cổ điển: Khảo sát sự hiện diện của 7 nhóm hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng chỉ thị màu và kết tủa đặc trưng:
    • Alkaloid: Thuốc thử Mayer (tủa trắng) và thuốc thử Wagner (tủa nâu/màu da cam).
    • Flavonoid: Phản ứng với $H_2SO_4$ đậm đặc đun cách thủy (màu đỏ/hồng) và dung dịch NaOH 1%/ethanol (đỏ đậm/đỏ tím).
    • Steroid / Terpenoid: Phản ứng Salkowski (hòa tan trong chloroform, thêm $H_2SO_4$ đậm đặc quan sát màu đỏ đậm/xanh tím).
    • Glycoside: Phản ứng Keller-Kilian (thuốc thử $Fe_2(SO_4)_3$ 5% trong axit axetic loãng + $H_2SO_4$ đặc) hoặc phản ứng Phenol - $H_2SO_4$ đặc.
    • Chất béo: Phản ứng với $H_2SO_4$ 50% trong methanol/ethanol (màu nâu đen hoặc đỏ tía).
    • Hợp chất Phenol: Thuốc thử Bortrager (dung dịch KOH 50%/methanol tạo màu đỏ, tím hoặc xanh lục).
    • Sesquiterpen lacton: Thuốc thử Tollen (tạo gương bạc hoặc tủa đen Ag) và $H_2SO_4$ đậm đặc (chuyển đỏ nâu).
  3. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: Sử dụng máy quang phổ UV-VIS Lambda 25 quét phổ hấp thụ phân tử dịch chiết Ethanol tổng trong dải bước sóng 200 nm – 800 nm, sau đó đo mật độ quang của các phân đoạn dung môi tại bước sóng hấp thụ đặc trưng ($\lambda = 425\text{ nm}$).
  4. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Thực hiện trên thiết bị GC-MS 2010 QP PLUS để phân tích, tách và định danh các cấu tử hóa học trong các phân đoạn dịch chiết phân bố (n-Hexane, Benzene, Dichloromethane, Ethyl acetate) dựa vào thời gian lưu sắc ký khí và phân mảnh ion của phổ khối.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu về cây Lông Cu Li (Cibotium barometz (L.) J.Sm):

  • Đặc điểm thực vật học và phân bố: Cây có thân yếu cao 2,5–3 m, lá lớn dài tới 3 m, cuống lá màu nâu phủ dày vẩy lông vàng bóng ở gốc; lá lông chim bậc hai thuôn hẹp, túi bào tử 1–4 nằm ở mỗi bên gân giữa bậc 3. Phân bố tự nhiên tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Nhật Bản và khắp các vùng đồi núi ẩm tại Việt Nam (Lào Cai, Hà Giang, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng, Tây Ninh, Phú Quốc).
  • Kinh nghiệm y học cổ truyền: Bộ phận thân rễ (cẩu tích) có vị đắng ngọt, tính ấm, tác dụng bổ can thận, mạnh gân cốt, trừ phong thấp, trị đau lưng mỏi gối, tiểu đêm, di tinh, bạch đới; lông vàng dùng đắp cầm máu ngoài da. Chương này dẫn chứng các bài thuốc cổ truyền như bài thuốc chữa phong thấp tê bì, rượu bổ thận tráng dương, bài thuốc trị can thận suy nhược.
  • Các nghiên cứu dược lý và hóa học hiện đại: Tổng hợp các công trình quốc tế và trong nước về hoạt tính của Onitin chống co thắt; chiết xuất phân đoạn ức chế hủy cốt bào chống loãng xương ở chuột OVX; hoạt tính chống oxy hóa của axit protocatechuic mạnh hơn Trolox; khả năng ức chế protease $3CL^{\text{pro}}$ của SARS-CoV ($IC_{50} = 39\text{--}44\text{ }\mu\text{g/ml}$); pterosin chống đái tháo đường và béo phì; cùng các nghiên cứu cấu trúc axit béo, phenol, sesquiterpene, ptaquiloside và cerebrosid.

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về quy trình chuẩn bị thực nghiệm, hệ thống hóa chất và thiết bị:

  • Danh mục 16 loại hóa chất phân tích đạt chuẩn tinh khiết TCCS (n-Hexane, Benzene, Dichloromethane, Ethyl acetate, Ethanol 96%, Methanol, $H_2SO_4$, $HCl$, $NaOH$, $AgNO_3$, $AlCl_3$, $NH_4OH$, Vanillin, $CH_3COOH$, Formol 36%, $Na_2SO_4$).
  • Thiết bị phân tích: Máy quang phổ UV-VIS Lambda 25 (ĐH Sư phạm Đà Nẵng) và máy GC-MS 2010 QP PLUS (Trung tâm kiểm nghiệm Thuế).
  • Quy trình chiết mẫu: Chi tiết hóa sơ đồ chiết chưng ninh trực tiếp 4 dung môi (khảo sát thể tích và cô thu cao rắn) và sơ đồ chiết tổng bằng Ethanol 96% kết hợp chiết phân bố lỏng - lỏng 4 phân đoạn n-Hexane, Benzene, Dichloromethane, Ethyl acetate.
  • Quy trình thao tác 7 phép thử định tính nhóm chức hóa học và nguyên lý đo phổ UV-VIS, GC-MS.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chiết tách và phân tích:

  • Khảo sát quá trình chiết trực tiếp: Tổng thể tích dịch chiết qua 3 lần chiết chưng ninh với 150 ml dung môi lần lượt là n-Hexane (220 ml), Benzene (204 ml), Dichloromethane (193 ml) và Ethyl acetate (237 ml). Khối lượng cao rắn thu được phân bố tương đối đồng đều giữa các dung môi.
  • Kết quả định tính nhóm chức trong các phân đoạn chiết trực tiếp:
    • Dịch chiết n-Hexane: Âm tính với alkaloid, flavonoid, glycosid, chất béo; dương tính rõ rệt với steroid, phenol (thuốc thử Bortrager tạo trầm hiện đỏ) và sesquiterpen lacton (thuốc thử Tollen tạo kết tủa đen Ag, $H_2SO_4$ đặc cho màu đỏ nâu +++).
    • Dịch chiết Dichloromethane: Âm tính với alkaloid, flavonoid, glycosid, chất béo, phenol; dương tính với steroid và sesquiterpen lacton (Tollen tạo tủa đen, $H_2SO_4$ đặc cho màu đỏ nâu +++).
    • Dịch chiết Benzene: Dương tính với alkaloid (thuốc thử Wagner cho kết tủa nâu đỏ tan sau 2 phút), steroid và glycosid (thuốc thử Phenol - $H_2SO_4$ tạo tủa xanh nhạt); âm tính với flavonoid.
    • Dịch chiết Ethyl acetate: Khảo sát các phản ứng định tính phân đoạn tương ứng.
  • Khảo sát phổ UV-VIS: Phổ hấp thụ của dịch chiết cồn tổng thể hiện các cực đại hấp thụ ở vùng tử ngoại và khả kiến. Phép đo mật độ quang tại bước sóng 425 nm phản ánh mức độ phân bố của các hợp chất mang nhóm mang màu trong từng phân đoạn dịch chiết.
  • Kết quả chiết phân bố từ cao Ethanol và phân tích GC-MS: Tách thành công các phân đoạn n-Hexane, Benzene, Dichloromethane, Ethyl acetate. Phổ GC-MS nhận diện được nhiều cấu tử hữu cơ bay hơi và bán bay hơi trong các phân đoạn dịch chiết, trong đó có các hydrocarbon mạch thẳng dài ($n$-dodecane, tetradecane) cùng các dẫn xuất ester và hợp chất phenol.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định tính các nhóm hợp chất hóa học

Dung môi chiết Alkaloid Flavonoid Steroid Glycosid Chất béo Phenol Sesquiterpen lacton
n-Hexane (-) (-) (+) (-) (-) (+) (+++)
Dichloromethane (-) (-) (+) (-) (-) (-) (+++)
Benzene (+) (-) (+) (+) Chưa rõ (-) Chưa rõ
Ethyl acetate (-) Khảo sát (+) Khảo sát (-) (+) (+)

(Ghi chú: (+) Dương tính; (-) Âm tính; (+++) Dương tính mạnh).

Kết quả chiết tách và định danh hóa lý

  • Xác định được điều kiện chiết tách thích hợp: Chiết chưng ninh với Ethanol 96% ở 85°C (3 lần x 4 giờ) cho hiệu suất thu hồi cao tổng tốt nhất; quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng tuần tự bằng n-Hexane, Benzene, Dichloromethane và Ethyl acetate tách hiệu quả các nhóm chất theo thang độ phân cực từ 0 đến 4,4.
  • Khảo sát quang phổ UV-VIS xác định vùng hấp thụ quang đặc trưng của dịch chiết cồn trong dải 200–800 nm và định lượng sơ bộ mật độ quang tại $\lambda = 425\text{ nm}$.
  • Bằng phương pháp GC-MS, bước đầu định danh được các cấu tử có trong các phân đoạn dịch chiết phân bố từ cao cồn, chứng minh sự hiện diện của các alkane mạch thẳng ($n$-dodecane, tetradecane), các dẫn xuất este và các hợp chất hữu cơ đặc trưng của loài Lông Cu Li thu hái tại Đà Lạt.

Đóng góp của đề tài

  • Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm ban đầu có hệ thống về quy trình chiết tách phân đoạn và thành phần hóa thực vật của mẫu Lông Cu Li (Cibotium barometz) sinh trưởng tại khu vực Đà Lạt, Lâm Đồng.
  • Thiết lập phương pháp tiếp cận kết hợp giữa định tính hóa học cổ điển và các phương pháp hóa lý hiện đại (UV-VIS, GC-MS) trong đánh giá dược liệu thô.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Mẫu thực vật nghiên cứu chỉ được thu thập tại một địa điểm duy nhất (Đà Lạt, Lâm Đồng) vào một thời điểm trong năm (tháng 8/2017), chưa so sánh biến động thành phần theo mùa và vùng sinh thái.
  • Đề tài tập trung chủ yếu vào khảo sát định tính hóa học và định danh sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) các hợp chất dễ bay hơi/kém phân cực; chưa tiến hành cô lập, phân lập các đơn chất tinh khiết bằng sắc ký cột.
  • Chưa thực hiện xác định cấu trúc phân tử bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) hay phổ hồng ngoại (FT-IR) đối với các chất phân lập, và chưa thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp (in vitro / in vivo) trên các phân đoạn dịch chiết thu được.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô chiết tách trên cột sắc ký pha thường/pha đảo để phân lập các hợp chất đơn lẻ từ các phân đoạn giàu hoạt tính (đặc biệt là phân đoạn sesquiterpen lacton và phenol).
  • Ứng dụng phổ NMR ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR) và HR-MS để giải đoán cấu trúc chi tiết các hợp chất tinh khiết.
  • Thử nghiệm sàng lọc hoạt tính dược lý thực nghiệm (chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế enzyme) của các phân đoạn dịch chiết từ nguồn Lông Cu Li Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Hóa học (Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên), Dược học, Công nghệ Hóa học và Hóa Dược:

  • Tham khảo phương pháp chiết phân đoạn: Quy trình chiết chưng ninh và chiết phân bố lỏng - lỏng nhiều cấp từ cao tổng ethanol bằng hệ 4 dung môi phân cực tăng dần.
  • Tham khảo quy trình thử nghiệm định tính: Các bước pha chế thuốc thử (Mayer, Wagner, Bortrager, Tollen, Keller-Kilian, Salkowski) và kỹ thuật nhận biết nhóm chức hoạt chất tự nhiên.
  • Tư liệu học thuật: Cung cấp thông tin tổng quan về thực vật học, bài thuốc cổ truyền và hóa thực vật của chi Cibotium tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu Lông Cu Li dùng trong khóa luận được thu hái tại địa phương nào và vào thời gian nào? Mẫu Lông Cu Li tươi được thu hái tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 8 năm 2017, sau đó được làm sạch rễ con, cạo lông, thái lát và phơi sấy khô để làm nguyên liệu nghiên cứu.

2. Quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng từ dịch chiết Ethanol tổng sử dụng những dung môi nào và theo thứ tự ra sao? Sau khi cô cao Ethanol tổng và hòa tan lại trong 200 ml nước cất, quá trình chiết lỏng - lỏng được tiến hành tuần tự theo độ phân cực tăng dần của 4 dung môi: n-Hexane (độ phân cực 0) $\rightarrow$ Benzene (độ phân cực 2,7) $\rightarrow$ Dichloromethane (độ phân cực 3,1) $\rightarrow$ Ethyl acetate (độ phân cực 4,4).

3. Phép thử định tính sesquiterpen lacton trong dịch chiết được thực hiện bằng thuốc thử nào và cho hiện tượng gì? Phép thử được thực hiện bằng thuốc thử Tollen và dung dịch $H_2SO_4$ đậm đặc. Phản ứng dương tính khi mẫu thử với thuốc thử Tollen xuất hiện kết tủa đen bạc (Ag) bền vững, và với $H_2SO_4$ đậm đặc dung dịch chuyển sang màu đỏ nâu (mức độ +++ ở dịch chiết n-Hexane và Dichloromethane).

4. Khóa luận sử dụng các thiết bị quang phổ và sắc ký nào để phân tích dịch chiết? Khóa luận sử dụng máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS Lambda 25 (quét dải 200–800 nm và đo mật độ quang tại 425 nm) tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, và thiết bị sắc ký khí kết hợp khối phổ GC-MS 2010 QP PLUS tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế.

5. Trong dịch chiết n-Hexane, những nhóm hoạt chất sinh học nào cho phản ứng dương tính khi định tính? Trong dịch chiết n-Hexane, các phản ứng định tính cho kết quả dương tính với nhóm chức Steroid, hợp chất Phenol (tạo trầm hiện đỏ với thuốc thử Bortrager) và Sesquiterpen lacton (kết tủa đen Ag với thuốc thử Tollen và màu đỏ nâu với $H_2SO_4$ đặc); các nhóm alkaloid, flavonoid, glycosid và chất béo cho kết quả âm tính.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Như Thủy đã xây dựng thành công quy trình chiết tách phân đoạn từ Lông Cu Li (Cibotium barometz L.) thu hái tại Đà Lạt bằng phương pháp chưng ninh cồn và chiết lỏng - lỏng tuần tự qua 4 dung môi hữu cơ. Nghiên cứu đã xác định sơ bộ sự hiện diện của các nhóm hoạt chất sinh học chính gồm steroid, sesquiterpen lacton, phenol, alkaloid và glycosid qua hệ thống phản ứng màu định tính cổ điển. Đồng thời, việc ứng dụng quang phổ UV-VIS và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) bước đầu định danh được các hợp chất hydrocarbon mạch thẳng và este trong các phân đoạn dịch chiết, đóng góp tư liệu thực nghiệm hữu ích cho hướng nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên từ nguồn dược liệu Việt Nam.