Luận văn thạc sĩ vnua giám sát sự lưu hành các chủng virus cúm ah5n1 h5n6 h7n9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh nghệ an thừa thiên huế và ứng dụng kỹ thuật realtime rt pcr trong chẩn đoán bệnh

Nghiên cứu giám sát virus cúm AH5N1, H5N6, H7N9 tại chợ gia cầm Nghệ An, Thừa Thiên Huế và ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán.

• Tác giả: Đặng Văn Hạnh
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Hồng Ngân
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Giám sát sự lưu hành các chủng virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế và ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR trong chẩn đoán bệnh
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Trích Yếu Luận Văn
• 1.2. Tính cấp thiết
• 1.3. Mục tiêu đề tài
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.5. Tổng quan tài liệu
• 1.5.1. Khái niệm về bệnh cúm gia cầm
• 1.5.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm
• 1.5.3. Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới
• 1.5.4. Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam
• 1.5.4.1. VIRUS học bệnh cúm gia cầm
• 1.5.4.1.1. Cấu trúc của virus cúm gia cầm
• 1.5.4.1.2. Đặc điểm cấu trúc hệ gen cúm gia cầm
• 1.5.4.1.3. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch
• 1.5.4.1.4. Độc lực của virus
• 1.5.4.1.5. Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus
• 1.5.4.1.6. Sức đề kháng của virus
• 1.5.4.2. Truyền nhiễm học
• 1.5.4.2.1. Động vật cảm nhiễm
• 1.5.4.2.2. Con đường truyền lây
• 1.5.5. Triệu chứng và bệnh tích
• 1.5.6. Các phương pháp chẩn đoán
• 1.5.6.1. Chẩn đoán dịch tễ học
• 1.5.6.2. Chẩn đoán lâm sàng
• 1.5.6.3. Chẩn đoán virus học
• 1.5.6.4. Chẩn đoán huyết thanh học
• 1.5.7. Phòng bệnh
• 1.5.7.1. Phòng bệnh bằng vệ sinh
• 1.5.7.2. Phòng bệnh bằng vắc xin
• 1.5.8. Hiểu biết về kỹ thuật REALTIME RT-PCR
• 1.5.8.1. Thế nào là phản ứng Realtime RT-PCR
• 1.5.8.2. Cơ chế hoạt động của Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang
• 1.6. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.6.1. Nội dung, địa điểm nghiên cứu
• 1.6.2. Vật liệu nghiên cứu
• 1.6.3. Các loại dụng cụ, hóa chất
• 1.6.4. Phương pháp nghiên cứu
• 1.6.4.1. Phương pháp lấy mẫu
• 1.6.4.2. Phương pháp tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR
• 1.6.4.3. Phương pháp thu thập số liệu
• 1.6.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.7. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
• 1.7.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016
• 1.7.1.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Nghệ An từ năm 2012 - 2016
• 1.7.1.2. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016
• 1.7.2. Kết quả tiêm phòng Vaccine cúm gia cầm tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016
• 1.7.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016
• 1.7.3.1. Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016
• 1.7.3.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016
• 1.7.4. Đặc điểm dịch tễ cúm gia cầm tại tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016
• 1.7.5. Kết quả giám sát cúm gia cầm tại chợ Vinh tỉnh Nghệ An và chợ Nọ Thừa Thiên Huế năm 2016
• 1.7.5.1. Kết quả xét nghiệm tại 2 chợ được giám sát năm 2016
• 1.7.5.2. Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian giám sát tại chợ Vinh và chợ Nọ năm 2016
• 1.7.5.3. Tỷ lệ nhiễm chủng cúm A/H5N1 và H5N6 theo loại mẫu tại chợ Vinh Nghệ An và chợ Nọ Thừa Thiên Huế năm 2016
• 1.7.5.4. Diễn biến sự lưu hành các gen M, H5, N1, N6 trong các năm giám sát
• 1.7.6. Ứng dụng kỹ thuật realtime rt-pcr trong chẩn đoán bệnh
• 1.8. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về giám sát virus cúm A H5N1 H5N6 H7N9 tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế

Virus cúm gia cầm A/H5N1, H5N6, H7N9 là những mối đe dọa nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng. Việc giám sát sự lưu hành của các chủng virus này tại các chợ gia cầm là rất cần thiết để phát hiện sớm và ngăn chặn dịch bệnh. Nghiên cứu này tập trung vào hai tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế, nơi có nhiều chợ gia cầm lớn.

1.1. Tình hình dịch cúm gia cầm tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế

Tình hình dịch cúm gia cầm tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế đã có những diễn biến phức tạp trong những năm qua. Các chủng virus như A/H5N1, H5N6 đã được phát hiện, gây ra nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi.

1.2. Mục tiêu của việc giám sát virus cúm

Mục tiêu chính của việc giám sát virus cúm là phát hiện sớm sự lưu hành của các chủng virus, từ đó đề xuất các biện pháp phòng chống dịch bệnh hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong giám sát virus cúm gia cầm

Việc giám sát virus cúm gia cầm tại các chợ gia cầm gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện vệ sinh kém, việc kiểm soát nguồn gốc gia cầm chưa chặt chẽ, và sự thiếu hụt về kỹ thuật giám sát là những vấn đề cần được giải quyết.

2.1. Nguy cơ lây nhiễm virus từ gia cầm sang người

Nguy cơ lây nhiễm virus cúm từ gia cầm sang người là rất cao, đặc biệt là tại các chợ gia cầm nơi có sự tập trung đông đúc của gia cầm sống.

2.2. Thiếu hụt về kỹ thuật giám sát

Nhiều cơ sở thú y chưa được trang bị đầy đủ các kỹ thuật giám sát hiện đại, dẫn đến việc phát hiện virus không kịp thời.

III. Phương pháp giám sát virus cúm A H5N1 H5N6 H7N9 hiệu quả

Để giám sát hiệu quả virus cúm gia cầm, cần áp dụng các phương pháp hiện đại như kỹ thuật Realtime RT-PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện virus nhanh chóng và chính xác.

3.1. Kỹ thuật Realtime RT PCR trong chẩn đoán

Kỹ thuật Realtime RT-PCR là một trong những phương pháp tiên tiến nhất hiện nay, giúp phát hiện nhanh chóng sự hiện diện của virus cúm trong mẫu bệnh phẩm.

3.2. Quy trình lấy mẫu và phân tích

Quy trình lấy mẫu cần được thực hiện nghiêm ngặt, bao gồm việc thu thập mẫu từ gia cầm sống và môi trường tại các chợ gia cầm.

IV. Kết quả giám sát virus cúm tại chợ gia cầm Nghệ An và Thừa Thiên Huế

Kết quả giám sát cho thấy tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, H5N6 tại các chợ gia cầm là đáng lo ngại. Cụ thể, tỷ lệ lưu hành virus A tại chợ Vinh là 23,61%, trong khi tại chợ Nọ là 20,83%.

4.1. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A H5N1 và H5N6

Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 tại chợ Vinh là 6,94%, trong khi tỷ lệ nhiễm H5N6 là 2,78%. Điều này cho thấy sự hiện diện của các chủng virus nguy hiểm.

4.2. Diễn biến dịch cúm gia cầm qua các năm

Diễn biến dịch cúm gia cầm tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế cho thấy sự gia tăng đáng kể trong các năm gần đây, cần có các biện pháp can thiệp kịp thời.

V. Ứng dụng thực tiễn của kết quả giám sát virus cúm

Kết quả giám sát không chỉ giúp cảnh báo sớm về dịch cúm gia cầm mà còn cung cấp dữ liệu quan trọng cho các cơ quan chức năng trong việc xây dựng chính sách phòng chống dịch bệnh.

5.1. Đề xuất biện pháp phòng chống dịch bệnh

Dựa trên kết quả giám sát, các biện pháp phòng chống dịch bệnh cần được đề xuất và thực hiện một cách đồng bộ và hiệu quả.

5.2. Nâng cao năng lực cho cơ sở thú y

Cần nâng cao năng lực cho các cơ sở thú y trong việc giám sát và chẩn đoán virus cúm gia cầm, từ đó đảm bảo an toàn cho ngành chăn nuôi.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai trong giám sát virus cúm

Việc giám sát virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 tại các chợ gia cầm là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và ngành chăn nuôi. Cần tiếp tục nghiên cứu và áp dụng các công nghệ mới trong giám sát.

6.1. Tương lai của giám sát virus cúm gia cầm

Tương lai của giám sát virus cúm gia cầm sẽ phụ thuộc vào việc áp dụng công nghệ mới và sự hợp tác giữa các cơ quan chức năng.

6.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức

Nâng cao nhận thức của cộng đồng về nguy cơ lây nhiễm virus cúm gia cầm là rất quan trọng trong việc phòng chống dịch bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch cúm gia cầm là một trong những mối đe dọa sinh học nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng trên phạm vi toàn cầu. Tại Việt Nam, kể từ đợt bùng phát đầu tiên vào cuối năm 2003 làm tiêu hủy hơn 56,88 triệu con gia cầm (chiếm 16,71% tổng đàn cả nước), dịch bệnh do virus cúm typ A đã gây ra những tổn thất kinh tế nặng nề và đe dọa trực tiếp tính mạng con người với 62 ca tử vong trên 124 ca nhiễm cúm A/H5N1 (tỷ lệ tử vong lên tới 50%). Bên cạnh chủng H5N1 cổ điển, sự xuất hiện của các biến chủng độc lực cao mới như A/H5N6 từ năm 2014 và nguy cơ xâm nhiễm của chủng A/H7N9 từ các quốc gia láng giềng đã đặt ra thách thức nghiêm trọng cho công tác phòng chống dịch tễ.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm của luận văn bắt nguồn từ thực trạng buôn bán gia cầm sống tại các chợ truyền thống – nơi tập trung nguồn gia cầm từ nhiều địa phương nhưng hầu như không được kiểm soát nguồn gốc và điều kiện vệ sinh thú y. Đây chính là môi trường lý tưởng để mầm bệnh lưu trữ, tái tổ hợp và khuếch đại virus ra cộng đồng. Mục tiêu cụ thể của đề tài là xác định tỷ lệ lưu hành của các chủng virus cúm A/H5N1, H5N6 và H7N9 tại Chợ Vinh (tỉnh Nghệ An) và Chợ Nọ (tỉnh Thừa Thiên Huế), đồng thời ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR nhằm chuẩn hóa quy trình chẩn đoán nhanh, nâng cao năng lực giám sát dịch bệnh cho cán bộ thú y cơ sở.

Phạm vi nghiên cứu được tiến hành trên đàn gia cầm sống và môi trường kinh doanh tại hai tỉnh trọng điểm miền Trung trong thời gian từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 11 năm 2016, kết hợp điều tra hồi cứu dịch tễ giai đoạn 2012–2016. Luận văn mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi cung cấp nguồn dữ liệu dịch tễ thực địa cập nhật trên địa bàn có tổng đàn lớn (khoảng 18,5 triệu con tại Nghệ An và 2 triệu con tại Thừa Thiên Huế), hỗ trợ đắc lực cho các cơ quan quản lý trong việc dự báo và ban hành chính sách thú y kịp thời.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết virus học phân tử và dịch tễ học truyền nhiễm thú y:

• Lý thuyết phân loại và cấu trúc virus Orthomyxoviridae: Virus cúm gia cầm thuộc nhóm virus cúm A có hệ gen gồm 8 phân đoạn RNA sợi đơn âm, mã hóa cho 11 loại protein chức năng. Hai kháng nguyên bề mặt quan trọng nhất là Hemagglutinin (với 16 phân typ từ H1 đến H16) quyết định khả năng gắn vào thụ thể tế bào chủ và Neuraminidase (với 9 phân typ từ N1 đến N9) chịu trách nhiệm giải phóng hạt virus trưởng thành.
• Cơ chế biến đổi kháng nguyên: Bao gồm hiện tượng đột biến điểm (antigenic drift) xảy ra thường xuyên tạo ra các chủng mới thích ứng trên vật chủ, và hiện tượng tái tổ hợp di truyền (antigenic shift) xảy ra khi hai hay nhiều phân typ virus cùng xâm nhiễm vào một tế bào, tạo ra biến chủng hoàn toàn mới có nguy cơ gây đại dịch.
• Khái niệm độc lực sinh học: Phân định rõ giữa cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI) với chỉ số gây bệnh tiêm tĩnh mạch IVPI từ 1,2 trở lên (gây tỷ lệ chết 100% trong vòng 48 giờ) và cúm gia cầm thể độc lực thấp (LPAI).
• Nguyên lý phát hiện phân tử qua chu kỳ ngưỡng (Ct value): Cơ chế giải phóng tín hiệu huỳnh quang từ đầu phát (reporter) tách rời chất hấp phụ (quencher) của mẫu dò Taqman probe trong quá trình khuếch đại gen đích, xác định mẫu dương tính với giá trị Ct từ 35 trở xuống.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thứ cấp thu thập qua phương pháp điều tra hồi cứu về tình hình tổng đàn, tiêm phòng vắc xin và diễn biến dịch cúm giai đoạn 2012–2016 từ Cục Thống kê, Chi cục Thú y tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế và Cơ quan Thú y vùng III. Dữ liệu sơ cấp là kết quả xét nghiệm mẫu bệnh phẩm thực địa năm 2016.
• Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Nghiên cứu thực hiện chọn mẫu có chủ đích tại 2 chợ buôn bán gia cầm sống quy mô lớn là Chợ Vinh (Nghệ An) và Chợ Nọ (Thừa Thiên Huế). Quá trình lấy mẫu chia làm 4 đợt (tháng 1, tháng 2, tháng 6 và tháng 7 năm 2016). Tổng cỡ mẫu thu thập là 144 mẫu gộp (được tổng hợp từ 720 mẫu đơn lẻ), bao gồm 48 mẫu swab hầu họng gà sống, 48 mẫu swab hầu họng vịt sống và 48 mẫu môi trường (phân tươi, nước thải, nước uống và chất thải lồng nhốt). Phương pháp gộp 5 mẫu đơn từ cùng một hộ kinh doanh thành 1 mẫu xét nghiệm giúp tăng tối đa xác suất bắt gặp mầm bệnh và tối ưu hóa chi phí giám sát.
• Phương pháp phân tích phòng thí nghiệm và lý do lựa chọn: Áp dụng quy trình chiết tách RNA tự động bằng kít TACO và phản ứng khuếch đại Realtime RT-PCR một bước (One-Step qRT-PCR) với các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho gen Matrix (M), H5, H7, N1, N6, N9 do FAO cung cấp. Chu trình nhiệt được thiết lập: phiên mã ngược ở 50°C trong 30 phút, kích hoạt ban đầu ở 95°C trong 15 phút, tiếp nối bởi 40 chu kỳ PCR (95°C trong 10 giây và 58°C trong 50 giây). Phương pháp này được lựa chọn vì tính ưu việt vượt trội về độ nhạy, độ đặc hiệu tuyệt đối, kiểm soát hoàn toàn nguy cơ ngoại nhiễm và rút ngắn thời gian chẩn đoán chỉ còn vài giờ so với phương pháp phân lập trên trứng gà ấp mất tối thiểu 72 giờ. Dữ liệu được tổng hợp và phân tích tỷ lệ nhiễm bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Tỷ lệ lưu hành chung của virus cúm typ A: Kết quả xét nghiệm tại Chợ Vinh (Nghệ An) ghi nhận tỷ lệ dương tính với gen Matrix của virus cúm A là 23,61% (17/72 mẫu gộp). Tại Chợ Nọ (Thừa Thiên Huế), tỷ lệ lưu hành virus cúm A đạt 20,83% (15/72 mẫu gộp). Điều này cho thấy mầm bệnh cúm A hiện diện thường trực với tỷ lệ trên 20% tại cả hai chợ đầu mối.
• Sự phân bố của các phân typ độc lực cao: Tại Chợ Vinh, chủng virus cúm A/H5N1 chiếm tỷ lệ 6,94% (5/72 mẫu) và chủng A/H5N6 chiếm 2,78% (2/72 mẫu). Tại Chợ Nọ, chủng A/H5N1 được phát hiện với tỷ lệ 1,39% (1/72 mẫu), trong khi chủng H5N6 chưa được tìm thấy (0%). Đáng chú ý, chủng virus cúm nguy hiểm A/H7N9 hoàn toàn âm tính (0%) ở toàn bộ 144 mẫu giám sát tại cả hai địa phương.
• Biến động dịch tễ theo thời gian lấy mẫu: Tỷ lệ nhiễm virus có sự dao động rõ rệt giữa các thời điểm. Chủng H5N1 xuất hiện tập trung vào các tháng 1, 2 và tháng 7 với cùng tỷ lệ nhiễm 5,55%. Trong khi đó, chủng H5N6 chỉ xuất hiện vào các tháng đầu năm (tháng 1 và tháng 2) cùng với tỷ lệ 2,78%, hoàn toàn vắng mặt trong các đợt giám sát mùa hè (tháng 6 và tháng 7).
• Tỷ lệ nhiễm theo loại mẫu vật: Chủng H5N1 được tìm thấy trên cả 3 nhóm mẫu xét nghiệm gồm swab hầu họng gà sống, vịt sống và mẫu môi trường. Riêng chủng H5N6 chỉ được phân lập trên mẫu swab hầu họng gà sống và vịt sống với cùng tỷ lệ 2,08%, chưa phát hiện thấy trong các mẫu bệnh phẩm môi trường chợ.

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt về tỷ lệ lưu hành virus giữa hai địa bàn phản ánh rõ đặc điểm chăn nuôi và giao thương dịch tễ học. Nghệ An có quy mô tổng đàn gia cầm lớn gấp hơn 9 lần Thừa Thiên Huế (khoảng 18,5 triệu con so với 2 triệu con) cùng hệ thống giao thông huyết mạch phức tạp (Quốc lộ 1A, Quốc lộ 7 qua Lào). Hơn nữa, toàn tỉnh Nghệ An có tới 1.972 cơ sở giết mổ nhỏ lẻ (chiếm 98,35% tổng số điểm giết mổ), trong đó tỷ lệ được kiểm soát thú y chỉ đạt 2,24%, kết hợp với tỷ lệ tiêm phòng vắc xin thực tế giai đoạn 2012–2016 chỉ đạt từ 7,38% đến 15,39% (thấp hơn rất nhiều so với yêu cầu bảo hộ 80%). Các yếu tố này giải thích vì sao Chợ Vinh có mức độ lưu hành mầm bệnh và sự đa dạng chủng virus (cả H5N1 và H5N6) cao hơn Chợ Nọ.

Sự bùng phát chủng H5N6 tại Nghệ An hoàn toàn phù hợp với quy luật dịch tễ dịch chuyển của chủng virus này tại Việt Nam sau khi được phát hiện lần đầu năm 2014 tại Hà Tĩnh và Lạng Sơn, cho thấy nguy cơ lan truyền liên vùng rất cao. Đặc biệt, sự phát hiện virus H5N1 trực tiếp trong các mẫu nước thải và lồng nhốt gia cầm đã minh chứng cho khả năng tồn tại dai dẳng của virus trong môi trường ẩm ướt (có thể sống tới 3 tháng trong chất thải), trở thành ổ chứa nguy cơ cao tái nhiễm cho đàn gia cầm mới nhập chợ.

Để làm nổi bật các phát hiện này, dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ cột kép thể hiện tương quan tỷ lệ nhiễm các gen M, H5, N1, N6 giữa 4 đợt giám sát theo mùa, kết hợp bảng ma trận phân bố tỷ lệ dương tính chi tiết theo từng loại bệnh phẩm (gà, vịt, môi trường) nhằm phục vụ công tác báo cáo chuyên môn.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng dịch tễ học thực địa, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp hành động cụ thể:

• Tăng cường kiểm soát và mở rộng độ bao phủ tiêm phòng vắc xin: Chi cục Chăn nuôi và Thú y hai tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế cần tổ chức tiêm phòng định kỳ 2 đợt/năm (vụ xuân và vụ thu), nâng tỷ lệ bảo hộ thực tế từ mức 7,38%–15,39% lên đạt chỉ tiêu tối thiểu 80% tổng đàn gia cầm. Cần lựa chọn đúng chủng loại vắc xin tương thích kháng nguyên với các nhánh virus H5N1 và H5N6 đang lưu hành thực tế.
• Xây dựng mạng lưới giám sát dịch tễ phân tử chủ động: Cơ quan Thú y vùng III phối hợp với các trạm thú y địa phương duy trì lấy mẫu định kỳ 2 tuần/lần tại 100% các chợ đầu mối gia cầm sống trong các tháng cao điểm mùa đông xuân (từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau). Đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR để rút ngắn thời gian chẩn đoán dưới 6 giờ, phát hiện sớm các nguy cơ biến chủng xâm nhập.
• Quy hoạch và chuẩn hóa điều kiện vệ sinh thú y tại các chợ và cơ sở giết mổ: Ủy ban nhân dân các cấp chỉ đạo rà soát, từng bước xóa bỏ 1.972 cơ sở giết mổ thủ công nhỏ lẻ không đảm bảo vệ sinh, phấn đấu đưa trên 50% lượng gia cầm vào giết mổ tại các cơ sở tập trung trước năm 2020. Ban quản lý chợ phải thực hiện tiêu độc khử trùng định kỳ tối thiểu 1 lần/tuần bằng hóa chất sát trùng chuyên dụng trên toàn bộ khu vực buôn bán, nhốt giữ và thu gom nước thải.
• Tuyên truyền nâng cao an toàn sinh học và năng lực chẩn đoán cơ sở: Tổ chức các lớp tập huấn kỹ thuật hàng năm cho 100% cán bộ thú y cấp xã về quy trình lấy mẫu swab vô trùng, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4°C và vận chuyển an toàn sinh học trong vòng 24 giờ về phòng kiểm nghiệm. Đẩy mạnh tuyên truyền cho người kinh doanh và người tiêu dùng tuyệt đối không buôn bán, tiêu thụ gia cầm không rõ nguồn gốc xuất xứ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị ứng dụng thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Cơ quan quản lý nhà nước và hệ thống thú y các cấp: Cục Thú y, Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế cùng Cơ quan Thú y vùng III có thể khai thác trực tiếp bộ số liệu thực địa để xây dựng bản đồ dịch tễ, hoạch định chính sách phân bổ nguồn kinh phí dự phòng và chỉ đạo chiến dịch tiêm phòng vắc xin đạt tỷ lệ bảo hộ trên 80%.
• Các nhà khoa học, chuyên gia dịch tễ và sinh học phân tử: Cung cấp tài liệu tham khảo giá trị về thiết kế mồi, mẫu dò Taqman probe chuẩn FAO, cùng quy trình vận hành tối ưu hóa phản ứng Realtime RT-PCR trong việc định danh chính xác các phân đoạn gen M, H5, H7, N1, N6, N9 trên 144 mẫu bệnh phẩm phức tạp.
• Ban quản lý chợ truyền thống và các cơ sở kinh doanh, giết mổ gia cầm: Nắm bắt rõ mức độ ô nhiễm mầm bệnh trong môi trường nước thải và phân gia cầm để áp dụng nghiêm ngặt quy trình vệ sinh tiêu độc định kỳ 1 tuần/lần, ngăn chặn nguy cơ lây nhiễm chéo cho người trực tiếp tiếp xúc.
• Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Thú y, Chăn nuôi, Y tế công cộng: Tài liệu học thuật chuẩn mực hướng dẫn phương pháp kết hợp giữa điều tra dịch tễ hồi cứu trên quần thể lớn (khoảng 18,5 triệu con gia cầm) với kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử hiện đại phục vụ nghiên cứu các bệnh truyền lây nguy hiểm giữa động vật và người.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao nghiên cứu lại tập trung giám sát virus cúm tại các chợ buôn bán gia cầm sống?
  Chợ gia cầm sống là nơi tập trung các nguồn gia cầm từ nhiều vùng chăn nuôi nhỏ lẻ mà không qua kiểm dịch xuất xứ. Kết quả nghiên cứu xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A tại Chợ Vinh là 23,61% và Chợ Nọ là 20,83%, chứng minh chợ là ổ chứa khuếch đại mầm bệnh nguy hiểm nhất trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ.

• Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật Realtime RT-PCR trong đề tài so với phương pháp truyền thống là gì?
  Kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman probe cho phép khuếch đại và phát hiện trực tiếp phân đoạn RNA đặc hiệu của virus với độ nhạy cao tại chu kỳ ngưỡng Ct từ 35 trở xuống. Phương pháp này rút ngắn thời gian chẩn đoán chỉ còn khoảng 4 đến 6 giờ, nhanh hơn rất nhiều so với thời gian 72 giờ của phương pháp phân lập virus truyền thống trên phôi trứng gà.

• Chủng virus cúm A/H7N9 có xuất hiện tại các điểm giám sát thực tế hay không?
  Trong toàn bộ 144 mẫu gộp xét nghiệm tại Chợ Vinh và Chợ Nọ qua 4 đợt năm 2016, tỷ lệ phát hiện chủng cúm A/H7N9 là 0%. Tuy nhiên, công tác giám sát chủ động vẫn phải duy trì liên tục do chủng này đã gây ra hơn 683 ca mắc trên người tại Trung Quốc và có nguy cơ xâm nhập biên giới rất cao.

• Yếu tố nào khiến tỷ lệ nhiễm virus cúm gia cầm thường tăng cao vào các tháng đầu năm?
  Số liệu nghiên cứu chỉ ra chủng H5N1 và H5N6 đạt tỷ lệ phát hiện từ 2,78% đến 5,55% trong tháng 1 và tháng 2. Nguyên nhân do điều kiện thời tiết mùa đông xuân lạnh ẩm làm giảm sức đề kháng của gia cầm, đồng thời nhu cầu vận chuyển, buôn bán gia cầm tăng đột biến phục vụ dịp Tết khiến mật độ tiếp xúc và lây truyền tăng mạnh.

• Sự xuất hiện của virus cúm trong mẫu môi trường chợ cảnh báo điều gì về mặt dịch tễ?
  Nghiên cứu phát hiện chủng H5N1 hiện diện trực tiếp trong nước thải và chất thải lồng nhốt tại chợ. Điều này chứng minh virus có khả năng tồn tại độc lập ngoài môi trường tự nhiên lên tới 3 tháng trong chất thải, tạo nguồn truyền lây gián tiếp nguy hiểm cho cả người giết mổ lẫn người tiêu dùng dù gia cầm chưa biểu hiện triệu chứng lâm sàng.

Kết luận

• Đánh giá toàn diện thực trạng chăn nuôi và dịch tễ cúm gia cầm giai đoạn 2012–2016 tại Nghệ An (tổng đàn khoảng 18,5 triệu con) và Thừa Thiên Huế (khoảng 2 triệu con), chỉ ra tỷ lệ tiêm phòng vắc xin còn rất thấp, dao động từ 7,38% đến 15,39% tại Nghệ An.
• Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A ở mức cao tại các chợ gia cầm sống, đạt 23,61% tại Chợ Vinh và 20,83% tại Chợ Nọ, trong đó ghi nhận sự hiện diện của chủng độc lực cao H5N1 (6,94% tại Chợ Vinh, 1,39% tại Chợ Nọ) và H5N6 (2,78% tại Chợ Vinh).
• Khẳng định tính an toàn bước đầu khi chưa phát hiện sự lưu hành của chủng virus cúm nguy hiểm A/H7N9 (tỷ lệ 0%) tại hai địa phương khảo sát trong năm 2016.
• Ứng dụng và chuẩn hóa thành công quy trình Realtime RT-PCR một bước trong việc phát hiện nhanh, định danh chính xác các phân đoạn gen M, H5, N1, N6 từ mẫu swab gia cầm và môi trường.
• Đề xuất hệ thống giải pháp đồng bộ nhằm nâng tỷ lệ tiêm phòng đạt ngưỡng bảo hộ 80%, siết chặt kiểm soát 1.972 cơ sở giết mổ nhỏ lẻ và duy trì giám sát dịch tễ phân tử chủ động.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử thực địa chuẩn xác, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho công tác cảnh báo sớm dịch bệnh động vật lây sang người. Các địa phương cần khẩn trương đưa quy trình giám sát Realtime RT-PCR vào kế hoạch kiểm soát dịch bệnh thường niên giai đoạn tiếp theo. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và cơ quan chuyên môn quan tâm có thể tiếp cận toàn văn công trình để ứng dụng quy trình chẩn đoán chuyên sâu và khai thác dữ liệu dịch tễ chi tiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG VĂN HẠNH GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CÁC CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1, H5N6, H7N9 TẠI MỘT SỐ CHỢ BUÔN BÁN GIA CẦM SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN CÁC TỈNH NGHỆ AN, THỪA THIÊN HUẾ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Phạm Hồng Ngân NHÀ XUẤT BÁN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Văn Hạnh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Phạm Hồng Ngân đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ công chức, viên chức Cơ quan Thú y vùng III đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Văn Hạnh ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.

vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Trích Yếu Luận Văn. ix Thesis Abstract.

Tính cấp thiết. Mục tiêu đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Ý nghĩa khoa học.

Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu. Khái niệm về bệnh cúm gia cầm. Lịch sử bệnh cúm gia cầm.

Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới. Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam. VIRUS học bệnh cúm gia cầm. cấu trúc của virus cúm gia cầm.

Đặc điểm cấu trúc hệ gen cúm gia cầm. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch. Độc lực của virus. Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus.

Sức đề kháng của virus. Truyền nhiễm học. Động vật cảm nhiễm. Con đường truyền lây.

22 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Triệu chứng và bệnh tích. Các phương pháp chẩn đoán. Chẩn đoán dịch tễ học.

Chẩn đoán lâm sàng. Chẩn đoán virus học. Chẩn đoán huyết thanh học. Phòng bệnh.

Phòng bệnh bằng vệ sinh. Phòng bệnh bằng vắc xin. Hiểu biết về kỹ thuật REALTIME RT-PCR. Thế nào là phản ứng Realtime RT-PCR.

Cơ chế hoạt động của Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang. Nội dung vàphương pháp nghiên cứu. Nội dung, địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Các loại dụng cụ, hóa chất. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp lấy mẫu. Phương pháp tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR.

Phương pháp thu thập số liệu. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả nghiên cứu và thảo luận. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại tỉnh nghệ an và thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016.

Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Nghệ An từ năm 2012 - 2016. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016. 36 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kết quả tiêm phòng Vaccine cúm gia cầm tại nghệ an và thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016.

Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh nghệ an và thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016. Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016. Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016. Đăc điểm dịch tễ cúm gia cầm tại tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016.

Kết quả giám sát cúm gia cầm tại chợ vinh tỉnh nghệ an và chợ nọ thừa thiên huế năm 2016. Kết quả xét nghiệm tại 2 chợ được giám sát năm 2016. Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian giám sát tại chợ Vinh và chợ Nọ năm 2016. Tỷ lệ nhiễm chủng cúm A/H5N1 và H5N6 theo loại mẫu tại chợ Vinh Nghệ An và chợ Nọ Thừa Thiên Huế năm 2016.

Diễn biến sự lưu hành các gen M, H5, N1, N6 trong các năm giám sát. Ứng dụng kỹ thuật realtime rt-pcr trong chẩn đoán bệnh. Kết luận và kiến nghị. 59 Tài liệu tham khảo.

64 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BNN và PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Ct Chu kì ngưỡng (Cycle of threshold) DA Dalton DNA Axit deoxiribonucleic FAO Tổ chức Lương thựcvà Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) HA Hemagglutinin HI Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination – Inhibition) HPAI Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza) LPAI Cúm gia cầm thể độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza) MA Matrix NA Neuraminidase NP Nucleoprotein OIE Tổ chức Thú Y thế giới (World Organnisation for Animal Health) RNA Axit ribonucleic RNP Ribonucleoprotein RT - PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Cúm gia cầm H5N1 trên người trên thế giới. Cặp mồi phát hiện virus Cúm gia cầm. Công thức tổ hợp phản ứng Realtime RT-PCR.

Tổng đàn gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016. Tổng đàn gia cầm tỉnh Thừa thiên Huế từ năm 2012 - 2016. Kết quả tiêm phòng vaccine tại 2 tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ 2012 đến vụ xuân 2016. Dịch cúm gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 đến tháng 6/2016.

Dịch cúm gia cầm tại Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 6/2016. Dịch cúm gia cầm theo tháng tại Nghệ An từ năm 2012 - 2016. Dịch cúm gia cầm theo loài trên địa bàn tỉnh Nghệ An từ 2012 - 2016. Kết quả giám sát tại chợ Vinh và chợ Nọ năm 2016.

Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian tại 2 chợ giám sát năm 2016. Tỷ lệ nhiễm H5N1 và H5N6 theo loại mẫu tại 2 chợ được giám sát. Tỷ lệ dương tính các gen M, H5, N1, N6 trong các năm giám sát. Số lượng mẫu được xét nghiệm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại Trạm chẩn đoán xét nghiệm - Cơ quan Thú y vùng III.

57 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Khu vực có trường hợp nhiễm cúm gia cầm. Cúm gia cầm năm 2015 tại Việt Nam. Hình thái và cấu trúc virus cúm gia cầm.

Các hệ gen virus cúm. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên virus cúm A ở tế bào chủ. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe.

Tỷ lệ tiêm phòng vaccine tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế. Diễn biến cúm gia cầm tại Nghệ An từ năm 2012 - 6/2016. Diễn biến cúm gia cầm theo thời gian tại Nghệ An. Sự phân bố các ổ dịch trên địa bàn tỉnh Nghệ Antừ năm 2012 - 2016.

Biến động tỷ lệ loài mắc bệnh. Tỷ lệ nhiễm cúm tại 2 chợ qua đợt giám sát. Tỷ lệ nhiễm H5N1 và H5N6 tại 2 chợ theo thời gian. Tỷ lệ lưu hành chủng virus H5N1 và H5N6 theo loại mẫu.

54 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đặng Văn Hạnh Tên Luận văn: Giám sát sự lưu hành các chủng virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế và ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR trong chẩn đoán bệnh. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1. Mục đích nghiên cứu - Phát hiện sự lưu hành virus cúm H5N1, H5N6 và H7N9 tại chợ Vinh, tỉnh NghệAn và chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế, để từ đó giúp các ban, ngành của địa phương có cái nhìn tổng quan về sự thay đổi tỷ lệ lưu hành các chủng nhằm cảnh báo sớm dịch cúm gia cầm và đề xuất các biện pháp phòng chống dịch cho phù hợp. - Nâng cao năng lực cho thú y cơ sở các kỹ thuật trong lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm.

Nội dung và Phương pháp nghiên cứu 2. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu Đối tượng: Virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 trên đàn gia cầm sống tại chợ Vinh, tỉnh Nghệ An và chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế. Địa điểm: Tại 2 chợ buôn bán gia cầm gồm Chợ Vinh, phường Hồng Sơn, thành phố Vinh,tỉnh Nghệ An và chợ Nọ, xã Phú Dương, huyện Phú Vang,tỉnh Thừa Thiên Huế. Mẫu xét nghiệm tại Cơ quan Thú y vùng III.

Thời gian: Bắt đầu từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 11 năm 2016. Vật liệu nghiên cứu - Các mẫu swab hầu họng gà sống, vịt sống, môi trường được lấy từ 2 chợ trên. - Các loại hóa chất và dụng cụ được sử dụng tại phòng thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu -Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Nghệ An, Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016.

- Kết quả tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại 2 tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016. -Diễn biến cúm gia cầm tại 2 tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ 2012 - 2016.