Đặc Điểm Đột Biến Gen Globin Của Các Bệnh Nhân Thalassemia Tại Bệnh Viện Trung Ương Thái Nguyên

Luận văn thạc sĩ y tế nghiên cứu hay đặc điểm đột biến gen globin của các bệnh nhân thalassemia tại bệnh viện trung ương thái nguyên, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Nguyễn Thu Phương
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Thị Thu Hương
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh
• Đề tài: Đặc Điểm Đột Biến Gen Globin Của Các Bệnh Nhân Thalassemia Tại Bệnh Viện Trung Ương Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 3. NỘI DUNG THỰC HIỆN
• 3.1. Sàng lọc, phát hiện, phân loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA
• 3.2. Ứng dụng quy trình phát hiện đột biến gen globin
• 3.3. Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên
• 4. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược về hemoglobin
• 1.1.1. Chuỗi globin thường
• 1.1.2. Các loại hemoglobin sinh lý
• 1.2. Khái niệm, phân loại bệnh thalassemia
• 1.3. Sinh lý bệnh thalassemia
• 1.4. Cơ chế di truyền
• 1.5. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia
• 1.5.1. Gen globin và các đột biến
• 1.5.2. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen
• 1.5.2.1. Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR)
• 1.5.2.2. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification – MLPA)
• 1.5.2.3. Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease - RE)
• 1.5.2.4. Kỹ thuật khuếch đại alen đặc hiệu ARMS-PCR
• 1.5.2.5. Phương pháp lai ngược (Reverse Dot Blot)
• 1.5.2.6. Kỹ thuật lai phân tử (Reversehybridization - kit Strip Assay)
• 1.5.2.7. Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger
• 5. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và bệnh phẩm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu
• 2.4. Quy trình kỹ thuật nghiên cứu
• 2.5. Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu và điện di huyết sắc tố
• 2.6. Tách chiết DNA
• 2.7. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm DNA
• 2.8. Thiết kế mồi
• 2.9. Quy trình multiplex PCR xác định đột biến gen thalassemia
• 2.10. Phân tích số liệu
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 6. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết DNA
• 3.2. Kết quả quy trình multiplex-PCR
• 3.3. Đặc điểm đột biến gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên
• KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đột Biến Gen Globin Ở Bệnh Nhân Thalassemia

Đột biến gen globin là nguyên nhân chính gây ra bệnh thalassemia, một loại bệnh thiếu máu di truyền phổ biến. Tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên, nghiên cứu về đặc điểm đột biến gen globin đã được thực hiện nhằm hiểu rõ hơn về tình trạng bệnh nhân thalassemia. Việc phát hiện và phân loại các đột biến gen này không chỉ giúp chẩn đoán chính xác mà còn hỗ trợ trong việc điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân.

1.1. Định Nghĩa Và Phân Loại Bệnh Thalassemia

Bệnh thalassemia được chia thành hai loại chính: α-thalassemia và β-thalassemia. Mỗi loại có các đặc điểm di truyền và triệu chứng lâm sàng khác nhau. Việc hiểu rõ về các loại này giúp trong việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.2. Tình Trạng Đột Biến Gen Globin Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, có nhiều loại đột biến gen globin đã được xác định, với tần suất cao ở các vùng miền núi. Việc nghiên cứu tình trạng này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả cho bệnh nhân.

II. Vấn Đề Chẩn Đoán Đột Biến Gen Globin Ở Bệnh Nhân Thalassemia

Chẩn đoán bệnh thalassemia thường gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng của các đột biến gen globin. Các phương pháp truyền thống như xét nghiệm huyết học không đủ để phát hiện tất cả các thể bệnh. Do đó, cần áp dụng các kỹ thuật hiện đại hơn để nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

2.1. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Bệnh Thalassemia

Nhiều bệnh nhân không được chẩn đoán đúng do thiếu các xét nghiệm gen. Điều này dẫn đến việc điều trị không hiệu quả và ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

2.2. Cần Thiết Phải Nâng Cao Kỹ Thuật Chẩn Đoán

Việc áp dụng các kỹ thuật như Multiplex-PCR giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến gen globin, từ đó cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân thalassemia.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đột Biến Gen Globin Tại Bệnh Viện Trung Ương Thái Nguyên

Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên với mục tiêu xác định các đột biến gen globin phổ biến ở bệnh nhân thalassemia. Phương pháp Multiplex-PCR được sử dụng để phát hiện các đột biến này, giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

3.1. Quy Trình Tách Chiết DNA Từ Mẫu Máu

Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu được thực hiện theo các bước chuẩn hóa, đảm bảo chất lượng DNA phục vụ cho các xét nghiệm gen sau này.

3.2. Ứng Dụng Kỹ Thuật Multiplex PCR

Kỹ thuật Multiplex-PCR cho phép phát hiện nhiều loại đột biến gen trong một lần xét nghiệm, tiết kiệm thời gian và chi phí cho bệnh nhân.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đột Biến Gen Globin Ở Bệnh Nhân Thalassemia

Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều loại đột biến gen globin khác nhau ở bệnh nhân thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên. Những phát hiện này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về bệnh mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

4.1. Đặc Điểm Đột Biến Gen Ở Bệnh Nhân

Các đột biến gen globin phổ biến được xác định bao gồm Cd41/42, Cd71/72 và IVS1-1. Những đột biến này có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe của bệnh nhân.

4.2. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Trong Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ được áp dụng trong việc tư vấn di truyền và điều trị cho bệnh nhân thalassemia, giúp nâng cao chất lượng cuộc sống cho họ.

V. Kết Luận Về Đột Biến Gen Globin Và Tương Lai Nghiên Cứu

Đột biến gen globin là một vấn đề nghiêm trọng trong bệnh thalassemia. Nghiên cứu tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên đã cung cấp những thông tin quý giá về tình trạng bệnh nhân. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Đột Biến Gen

Nghiên cứu về đột biến gen globin không chỉ giúp chẩn đoán chính xác mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh thalassemia.

5.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Cần phát triển các kỹ thuật mới và nâng cao khả năng tiếp cận dịch vụ y tế cho bệnh nhân thalassemia, đặc biệt là ở các vùng miền núi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thalassemia là hội chứng tan máu bẩm sinh di truyền lặn phổ biến hàng đầu trên thế giới với hơn 500 dạng đột biến gen globin đã được ghi nhận. Tại Việt Nam, tỷ lệ mang gen bệnh trong cộng đồng có sự phân bố phức tạp theo từng khu vực địa lý và dân tộc, đặc biệt tăng cao ở mức 10% đến 30% tại các tỉnh miền núi Đông Bắc. Hằng năm, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên tiếp nhận khoảng 300 đến 500 lượt bệnh nhân mắc Thalassemia thể nặng đến điều trị truyền máu và thải sắt định kỳ. Đây là áp lực rất lớn đối với hệ thống y tế công cộng cũng như chất lượng dân số trong khu vực.

Thách thức lớn nhất trong thực tiễn lâm sàng là các phương pháp xét nghiệm huyết học truyền thống như tổng phân tích tế bào máu hay điện di huyết sắc tố chỉ đóng vai trò định hướng sàng lọc. Những kỹ thuật này không thể xác định chính xác các trường hợp người lành mang gen dị hợp tử thể ẩn hoặc phục vụ chẩn đoán tiền làm tổ và chẩn đoán trước sinh. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, nghiên cứu được triển khai nhằm ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử Multiplex Polymerase Chain Reaction (Multiplex-PCR) để sàng lọc và xác định các dạng đột biến gen globin phổ biến trên 58 bệnh nhân Thalassemia điều trị tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên trong giai đoạn từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 1 năm 2018. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học phân tử có giá trị thực tiễn cao, hỗ trợ đắc lực cho công tác tư vấn tiền hôn nhân, sàng lọc trước sinh và giảm thiểu tối đa tỷ lệ trẻ sinh ra mắc bệnh thể nặng tại 6 tỉnh miền núi phía Bắc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng di truyền học phân tử người và cơ chế di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường của hội chứng Thalassemia. Cấu trúc phân tử Hemoglobin (Hb) bình thường ở người trưởng thành (HbA) chiếm khoảng 95%, cấu tạo bởi 2 chuỗi alpha-globin (141 acid amin) mã hóa bởi cụm gen trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) và 2 chuỗi beta-globin (146 acid amin) mã hóa bởi cụm gen trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) có kích thước 60 kb.

Sự suy giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng tổng hợp chuỗi globin dẫn đến mất cân bằng tỷ lệ chuỗi alpha/beta. Chuỗi globin dư thừa tự kết tủa tạo thành các hạt vùi nội bào phá hủy màng hồng cầu ngay trong tủy xương, gây nên hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả và thiếu máu huyết tán mạn tính. Đột biến gen beta-globin (HBB) được phân chia thành dạng beta0 (mất hoàn toàn chức năng như Cd17, Cd41/42) và beta+ (giảm chức năng như nt-28, IVS2-654) cùng các biến thể cấu trúc như Cd26 tạo Hemoglobin E (HbE). Đột biến gen alpha-globin (HBA1, HBA2) chủ yếu là các đột biến mất đoạn lớn (alpha0 như đột biến kiểu Đông Nam Á --SEA, --THAI, --FIL) hoặc mất đoạn nhỏ (alpha+ như -alpha3.7, -alpha4.2) và đột biến điểm không mất đoạn như Hb Constant Spring.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng thiết kế mô tả cắt ngang trên cỡ mẫu gồm 58 bệnh nhân đã có chẩn đoán xác định Thalassemia trên lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên. Phương pháp chọn mẫu thuận tiện được áp dụng để thu thập toàn bộ các trường hợp đủ tiêu chuẩn trong thời gian từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018. Bệnh phẩm là 3 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA lấy trước khi truyền máu.

Quy trình phân tích gồm 3 giai đoạn:

• Sàng lọc huyết học: Sử dụng máy phân tích tự động 18 thông số Celltac F để đánh giá chỉ số thể tích trung bình hồng cầu (MCV < 80 fL) và lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH < 27 pg), kết hợp hệ thống điện di mao quản Minicap (Sebia) xác định thành phần tỷ lệ các phân đoạn Hb.
• Tách chiết DNA: Sử dụng kit tách cột silica thương mại của hãng QIAGEN (Đức). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được kiểm tra nghiêm ngặt qua phổ hấp thụ quang học NanoDrop với tỷ số OD260/OD280 đạt chuẩn từ 1,8 đến 2,0 và nồng độ luôn đạt trên 200 ng/µL.
• Phân tích đột biến gen: Áng dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR chia thành 3 hệ thống phản ứng (beta 1, beta 2, beta 3) phát hiện 9 đột biến beta-globin phổ biến và kỹ thuật Gap-PCR đa mồi phát hiện 5 đột biến mất đoạn alpha-globin (--SEA, --THAI, --FIL, -alpha3.2, -alpha3.7). Các trường hợp nghi ngờ mang đột biến hiếm được kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger.

Việc lựa chọn hệ thống Multiplex ARMS-PCR và Gap-PCR là giải pháp tối ưu nhờ khả năng phát hiện đồng thời nhiều alen trong một phản ứng, rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn 4 đến 6 giờ, tiết kiệm đáng kể hóa chất và chi phí so với kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hoặc kit lai phân tử Strip Assay thương mại đắt tiền.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích di truyền trên 58 bệnh nhân đã xác định được 43 trường hợp mang đột biến gen beta-globin (tổng số 86 alen) và 15 trường hợp mang đột biến gen alpha-globin (tổng số 30 alen):

• Đối với beta-thalassemia: 100% bệnh nhân (43/43 ca) đều phát hiện được ít nhất một đột biến trên panel thử nghiệm. Kiểu gen dị hợp tử kép chiếm tỷ lệ cao nhất với 60,5% (26 ca), trong đó có 16 ca phối hợp với đột biến HbE (chiếm 37,2%). Kiểu gen đồng hợp tử chiếm 27,9% (12 ca) và dị hợp tử đơn chiếm 11,6% (5 ca).
• Phân bố alen beta đột biến: Alen Cd41/42 (-TTCT) chiếm ưu thế tuyệt đối với 37,1% (32/86 alen), tiếp theo là Cd17 (A>T) chiếm 22,1% (19/86 alen) và Cd26 (HbE) chiếm 19,8% (17/86 alen). Đột biến Cd71/72 (+A) chiếm 7,0% (6 alen), các đột biến IVS1-1, IVS2-654 và nt-28 chiếm tỷ lệ nhỏ. Phương pháp giải trình tự Sanger đã phát hiện thêm 1 trường hợp mang đột biến hiếm Cd-90 ngoài panel thường quy.
• Đối với alpha-thalassemia: Trong 15 bệnh nhân, đột biến mất đoạn --SEA chiếm tỷ lệ áp đảo với 66,6% ở thể dị hợp tử đơn (10 ca) và 26,7% ở thể dị hợp tử kép --SEA/-alpha3.7 tạo nên kiểu hình bệnh HbH (4 ca). Đột biến mất đoạn nhỏ -alpha3.7 đơn thuần chiếm 6,7% (1 ca). Alen --SEA xuất hiện với tần số 14/30 alen khảo sát.
• Mối tương quan kiểu gen và huyết đồ: Các kiểu gen đồng hợp tử beta0/beta0 thể hiện mức độ thiếu máu rất nặng với số lượng hồng cầu (RBC) giảm mạnh còn 2,3 ± 0,7 x 10^12/L và huyết sắc tố (Hb) chỉ đạt 55,5 ± 16,8 g/L. Ngược lại, nhóm dị hợp tử đơn beta có nồng độ Hb duy trì ở mức 81,8 ± 13,5 g/L và MCV đạt 74,9 ± 9,9 fL.

Thảo luận kết quả

Cơ chế bệnh sinh phân tử giải thích rõ ràng mức độ biểu hiện lâm sàng. Các đột biến dịch khung như Cd41/42 (-TTCT) hoặc đột biến vô nghĩa tạo codon kết thúc sớm như Cd17 (AAG>TAG) làm gián đoạn hoàn toàn quá trình dịch mã, dẫn đến kiểu hình beta0 không tạo ra chuỗi beta-globin. Khi kết hợp đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép với Cd26 (HbE), lượng chuỗi alpha tự do dư thừa rất lớn làm hồng cầu bị phá hủy ồ ạt, dẫn đến tình trạng thiếu máu trầm trọng, gan lách to và biến dạng xương sọ mặt.

So sánh với các nghiên cứu trong nước, tần số alen Cd41/42 (37,1%) và Cd17 (22,1%) tại Thái Nguyên có nét tương đồng với các báo cáo tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương (lần lượt là 35% và 25%). Tuy nhiên, điểm đặc thù là nghiên cứu này hoàn toàn không ghi nhận đột biến Cd95 (+A). Đây là đột biến vốn phổ biến ở người Kinh nhưng hầu như vắng mặt ở các nhóm dân tộc thiểu số vùng núi phía Bắc như Tày, Nùng, Dao.

Về alpha-thalassemia, tỷ lệ đột biến --SEA chiếm đa số phù hợp với đặc điểm dịch tễ Đông Nam Á (tại Hà Nội là 58,8%), khác biệt hoàn toàn với quần thể Malaysia (chỉ 0,5%) hay Trung Quốc (1,36%). Các trường hợp mang gen dị hợp tử --SEA/alpha-alpha có chỉ số MCV và MCH giảm nhưng điện di Hb hoàn toàn bình thường, rất dễ bị bỏ sót nếu không làm xét nghiệm sinh học phân tử. Về mặt trình bày dữ liệu, các biến thiên huyết học theo từng tổ hợp gen có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ cột phân bố tần số alen và biểu đồ hộp biểu diễn tương quan giữa chỉ số Hb, MCV đối với từng nhóm đột biến.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm kiểm soát hiệu quả và tiến tới đẩy lùi bệnh Thalassemia tại khu vực Đông Bắc, nghiên cứu đưa ra 4 khuyến nghị trọng tâm:

1. Chuẩn hóa và nâng cấp hệ sinh thái xét nghiệm phân tử: Bổ sung các cặp mồi phát hiện đột biến hiếm như Cd-90, -28 và các đột biến điểm alpha như Hb Constant Spring vào panel xét nghiệm Multiplex ARMS-PCR thường quy. Mục tiêu nâng độ nhạy phát hiện đột biến đạt trên 98% trong vòng 12 tháng tới, do Khoa Di truyền - Miễn dịch phân tử Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên chủ trì thực hiện.
2. Thiết lập mạng lưới sàng lọc trước sinh và tiền hôn nhân: Triển khai quy trình sàng lọc 2 bước (bước 1: tổng phân tích tế bào máu với ngưỡng MCV < 80 fL, MCH < 27 pg; bước 2: phân tích gen) cho tối thiểu 80% cặp đôi chuẩn bị kết hôn và thai phụ tại 6 tỉnh miền núi Đông Bắc trong giai đoạn 2020-2025, do Sở Y tế các địa phương phối hợp với Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên quản lý.
3. Mở rộng quy mô nghiên cứu dịch tễ học di truyền: Tăng cỡ mẫu khảo sát từ 58 ca lên 500 đến 1.000 mẫu trong thời gian 24 tháng nhằm lập bản đồ phân bố alen chi tiết theo từng phân nhóm dân tộc (Tày, Nùng, H'Mông, Sán Dìu), do Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên phối hợp các viện nghiên cứu chuyên ngành thực hiện.
4. Đào tạo nhân lực và truyền thông giáo dục sức khỏe: Tổ chức các khóa tập huấn định kỳ hằng quý về tư vấn di truyền cho 100% cán bộ y tế tuyến huyện và xã, phấn đấu giảm 50% tỷ lệ trẻ sinh ra mắc Thalassemia thể nặng trong vòng 5 năm tới thông qua can thiệp chẩn đoán trước sinh kịp thời.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho 4 nhóm đối tượng:

• Bác sĩ huyết học và chuyên viên xét nghiệm di truyền: Tiếp cận quy trình kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR 3 bước được chuẩn hóa, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định từ 4-6 giờ và ứng dụng trực tiếp vào việc đọc kết quả gel điện di đột biến tại phòng xét nghiệm.
• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học, Y sinh học: Tham khảo phương pháp thiết kế mồi chuyên biệt, quy trình tách chiết DNA đạt tỷ số OD 1,8-2,0 bằng cột sắc ký và các mô hình xử lý thống kê y học bằng SPSS 20 trong nghiên cứu đột biến gen.
• Cán bộ quản lý y tế và chuyên gia y tế công cộng: Khai thác dữ liệu dịch tễ học về tỷ lệ mang gen 10% đến 30% tại vùng Đông Bắc để xây dựng chính sách phân bổ nguồn lực y tế, dự trù ngân sách truyền máu và thải sắt cho hàng trăm bệnh nhân thể nặng mỗi năm.
• Bác sĩ sản khoa và chuyên viên tư vấn di truyền: Sử dụng các dữ liệu về tương quan kiểu gen - kiểu hình để dự báo nguy cơ thai nhi mắc thể phù thai do đồng hợp tử --SEA/--SEA hoặc thể thiếu máu nặng do kết hợp Cd41/42 với HbE, từ đó hỗ trợ các cặp vợ chồng đưa ra quyết định sinh sản an toàn.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR có ưu điểm gì vượt trội so với các phương pháp chẩn đoán khác? Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến điểm đã biết trong cùng một phản ứng khuếch đại DNA. Thời gian thực hiện chỉ mất 4 đến 6 giờ với chi phí hóa chất thấp hơn nhiều so với giải trình tự gen Sanger hay bộ kit lai phân tử Strip Assay thương mại đắt tiền, rất phù hợp triển khai thường quy tại các bệnh viện tuyến khu vực.

Tại sao đột biến Cd41/42 và Cd17 lại chiếm tỷ lệ cao nhất trong nghiên cứu? Trong số 86 alen beta được khảo sát, Cd41/42 chiếm 37,1% và Cd17 chiếm 22,1%. Đây là hai dạng đột biến dịch khung và vô nghĩa đặc trưng phổ biến nhất của cụm gen HBB trong quần thể người Việt Nam và khu vực Đông Nam Á, phản ánh nguồn gốc phát sinh di truyền bền vững qua nhiều thế hệ.

Người mang gen dị hợp tử alpha Thalassemia thể SEA có biểu hiện lâm sàng như thế nào? Người mang gen dị hợp tử --SEA/alpha-alpha (chiếm 66,6% nhóm alpha trong nghiên cứu) là người lành mang gen. Họ hầu như không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt ngoài tình trạng hồng cầu nhỏ nhược sắc (MCV trung bình 80 fL, MCH 25,9 pg), điện di Hb không đổi, nhưng có nguy cơ sinh con bị phù thai tử vong nếu kết hôn với người cùng mang gen.

Tại sao nghiên cứu này không phát hiện đột biến Cd95? Đột biến Cd95 (+A) thường xuất hiện chủ yếu ở quần thể người Kinh tại đồng bằng. Nhóm đối tượng bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên phần lớn thuộc các dân tộc thiểu số vùng núi Đông Bắc (Tày, Nùng), nơi có cơ cấu dịch tễ và phân bố tần số alen gen globin mang tính đặc thù riêng biệt.

Cần xử trí thế nào khi bệnh nhân có biểu hiện thiếu máu nhưng xét nghiệm PCR thông thường không tìm thấy đột biến? Trường hợp bệnh nhân có kiểu hình lâm sàng và huyết đồ bất thường nhưng âm tính với panel PCR thông thường (như ca bệnh phát hiện đột biến Cd-90 trong nghiên cứu), cơ sở y tế cần chuyển mẫu lên tuyến trên để thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen Sanger hoặc kỹ thuật MLPA nhằm xác định các đột biến điểm hiếm gặp hoặc đột biến mất đoạn phức tạp.

Kết luận

• Ứng dụng thành công kỹ thuật sinh học phân tử Multiplex ARMS-PCR và Gap-PCR trong việc chẩn đoán xác định nhanh chóng, chính xác các đột biến gen globin phổ biến trên 58 bệnh nhân Thalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
• Phát hiện 14 kiểu tổ hợp gen beta-thalassemia với 7 loại alen đột biến; trong đó Cd41/42 (-TTCT) chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%), kế tiếp là Cd17 (22,1%) và Cd26/HbE (19,8%), đồng thời ghi nhận đột biến hiếm Cd-90.
• Xác định đột biến mất đoạn lớn --SEA chiếm ưu thế tuyệt đối trong nhóm alpha-thalassemia với 66,6% ở thể dị hợp tử đơn và 26,7% ở thể dị hợp tử kép HbH phối hợp với mất đoạn nhỏ -alpha3.7.
• Khẳng định mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen phân tử và mức độ thiếu máu lâm sàng; các kiểu gen đồng hợp tử beta0/beta0 gây thiếu máu nặng nghiêm trọng (Hb trung bình giảm còn 55,5 ± 16,8 g/L).
• Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để thiết lập các panel mồi sàng lọc đặc thù cho đồng bào các dân tộc thiểu số vùng núi Đông Bắc, phục vụ trực tiếp cho chiến lược sàng lọc tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh giai đoạn 2020-2025.

Các đơn vị y tế chuyên khoa và nhà nghiên cứu quan tâm có thể ứng dụng ngay quy trình Multiplex ARMS-PCR được tối ưu hóa trong luận văn để nâng cao năng lực chẩn đoán phân tử tại chỗ, góp phần giảm gánh nặng bệnh tật và nâng cao chất lượng dân số Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu để bắt đầu phiên mã mARN (Messenger Acid Ribonuleic); bộ ba xen giữa làm gián đoạn quá trình phiên mã; tín hiệu bổ sung đuôi poly (A) vào mARN. Tầm quan trọng của trật tự các nucleotit là yếu tố quyết định loại Hb, bất kỳ sự thay đổi nào như mất, thêm, thay đổi nucleotit trên gen globin đều tạo ra bất thường mARN từ đó gây nên các dạng bất thường của thalassemia ở mức độ sinh học phân tử [29], [30], [31], [32]. Gen β-globin và đột biến gen β-globin Hình 1. Cấu trúc gen β-globin Họ gen β-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) có độ dài 60 kilobases (kb) gồm có 5 gen chức năng, sắp xếp theo trật tự từ trái sang phải là ε / γG / γA / δ / β (hình 1.

Gen β-globin có 626 base pair (bp) tham gia mã hóa nằm trên 3 exon là exon 1 (142 bp), exon 2 (223 bp) và exon 3 (261 bp). Độ dài intron 1 là 130 bp và intron 2 là 850 bp. Gen β-globin có cơ chế điều hòa rất phức tạp, hoạt động ở mức độ đơn gen cũng như toàn bộ cụm gen [30]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 Đột biến gen β-globin bao gồm: β0 -thalassemia là các đột biến làm mất chức năng gen β-globin nên không tổng hợp được chuỗi β-globin, ví dụ như: đột biến làm tạo thành bộ ba kết thúc sớm như Cd17, Cd35,.

β+ -thalassemia là các đột biến làm giảm chức năng gen β-globin nên giảm tổng hợp chuỗi β-globin ở nhiều mức độ khác nhau, ví dụ như đột biến ở vùng khởi động: -28, -88,. Các biến thể Hb là đột biến điểm làm thay đổi một acid amin, dẫn đến tổng hợp nên các biến thể chuỗi β globin khác tạo Hb bất thường như HbE, HbCs, HbS,. Hiện nay đã phát hiện trên 200 đột biến gen β-globin, chủ yếu là đột biến không mất đoạn. Đột biến tại gen β-globin chiếm trên 75% các đột biến trong cụm gen không α-globin.

Các đột biến mang tính đặc trưng và phân bố khác nhau ở các vùng miền, dân tộc [30], [31] Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen β-globin: - Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay thế nucle- otit tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi β-globin so với bình thường, gây β+ -thalassemia, như đột biến: -90 (C > T), -88 (C > T), -28 (A > G) [30], [33]. - Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucle- otit trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA, UAG hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạo sản phẩm β-globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây bệnh β0-thalassemia như Cd17 (AAG > TAG), Cd35 (TAC > TAA)[31], [33]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 10 - Đột biến tại những trình tự tín hiệu nối (splicing signals): Những đột biến ở vị trí cho nối GT hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối exon, do đó không tạo được mARN β-globin nên gây β0 -thalassemia như IVS1- 1 (G > T) [30], [31], [33]. - Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-globin gây bệnh β+ -thalassemia như IVS1-5 (G > T), IVS1-6 ( T > C) [30], [31], [33].

- Đột biến ở trong các exon: các đột biến ở exon luôn tạo ra các bất thường bản sao mARN nên gây ra β+-thalassemia như Cd26 (GAG >AAG) tạo HbE [30], [31], [33]. - Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein. Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí (box) AATAAA sẽ gây β+-thalassemia, như: AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA [30], [31], [33]. - Những đột biến khung đọc xảy ra ở các exon: đột biến thêm vào hoặc mất đi một hoặc vài nucleotit, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc mã di truyền làm thay đổi sản phẩm β-globin, như đột biến: Cd8/9 (+G), Cd41/42 (–TTCT), Cd71/72 (+A) gây β0 -thalassemia [30], [31], [33].

Gen α-globin và đột biến gen α-globin Hình 1. Cấu trúc gen α-globin Họ gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 3 gen chức năng là δ, α1, α2 và 4 gen giả là Ψδ1, Ψα1, Ψα2, θ (hình 1. Gen α1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 11 có chiều dài 840 bp và gen α2 có chiều dài 830 bp. Số lượng chuỗi α- globin được tổng hợp phụ thuộc vào số gen α-globin hoạt động [29].

Mức độ phiên mã của gen α2 gấp 2 đến 3 lần so với gen α1 [31], [34], [35]. Khoảng 40 kb phía trước của cụm gen α globin là một khu vực được gọi là HS-40. Khu vực này có nhiều vị trí nhạy cảm với ADNase và liên quan đến các yếu tố phiên mã. Tính toàn vẹn của HS-40 là rất cần thiết cho sự hoạt động của gen α-globin, nếu bị mất một đoạn trong phần đó có thể làm cả đoạn gen α-globin sau đó không hoạt động được.

Ngoài cấu trúc gen và trình tự của gen α-globin, còn có một số yếu tố phiên mã gen cũng rất quan trọng. Các yếu tố điều hòa hoạt động gen α-globin bằng cách gắn vào promoter gen α-globin và/hoặc với vị trí tương tác protein gắn ADN tại vùng HS-40 hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể (ví dụ như gen ATRX trên nhiễm sắc thể 13) [29]. Vì thế, những trường hợp mất đoạn vùng HS-40 cũng gây ra α-thalassemia, trong khi cả 2 gen α-globin đều còn nguyên vẹn [29], [31]. Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen α-globin: Đột biến gây bệnh α-thalassemia bao gồm đột biến mất đoạn và đột biến điểm.

Đột biến mất đoạn có 2 dạng là đột biến đoạn lớn làm mất cả 2 gen α và đột biến đoạn nhỏ làm mất 1 gen α. Hiện nay đã phát hiện được trên 300 đột biến, trong đó đột biến mất đoạn là chủ yếu (khoảng 90%) [29], [36]. Đột biến α+ -thalassemia: là đột biến làm mất 1 gen α-globin trên 1 nhiễm sắc thể (kiểu gen: -α). Có một số kiểu đột biến α+ -thalassemia, trong đó phổ biến nhất là đột biến mất đoạn 3.

Đột biến α0 -thalassemia: là đột biến mất cả 2 gen α trên 1 nhiễm sắc thể (kiểu gen: --). Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại đột biến mất đoạn 2 gen globin gồm mất 1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn cả 2 gen α hoặc mất cả 2 gen α và gen δ làm mất hoàn toàn quá trình tổng hợp chuỗi α-globin [29].Các đột biến α0 -thalassemia phổ biến ở khu vực Đông Nam Á bao gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 12 --SEA, --THAI, --FIL ởkhuvực Địa Trung Hải là -- MED. Đồng hợp tử các đột biến α0-thalassemia gây Hb Bart’s, dị hợp tử α0 -thalassemia với α+thalassemia gây ra HbH [29], [31]. Đột biến không mất đoạn: là các đột biến tại 1 hoặc vài nucleotit làm tổng hợp ra các biến thể chuỗi α-globin (kiểu gen: αTα hoặc ααT).

Các đột biến điểm chủ yếu ở trong vùng HS-40 và trong gen α1, α2. Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liên quan đến biểu hiện của gen α globin [29]. Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến thay thế T thành C ở bộ 3 kết thúc làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành CAA (mã hóa cho acid amin glutamin) vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã kết thúc tiếp theo trong khung đọc. Kết quả 1 chuỗi α-globin bị kéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử 141 acid amin của chuỗi α-globin ban đầu tạo nên Hb Constant Spring (HbCs), đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (chiếm khoảng 4% các đột biến α-globin) [29], [31].

Ngoài ra, còn có các đột biến khác làm tổng hợp các protein bất thường như đột biến α2 codon 125 (T > C) tạo Hb Quong Sze (Qs), đột biến α2 codon 142 (A > T) tạo Hb Pakse cũng gặp ở người Đông Nam Á [29], [31]. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen Hiện nay có nhiều phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện đột biến gen globin. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau trong phát hiện các loại đột biến, việc lựa chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào các phòng xét nghiệm [25]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR) Nguyên lý kỹ thuật: Kỹ thuật Gap-PCR sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược gắn ở hai bên ranh giới của vùng ADN đứt gãy. Với alen bình thường, khoảng cách giữa 2 mồi quá lớn nên không hình thành được sản phẩm ADN.Với alen có đột biến, khoảng cách này đủ ngắn để 2 mồi tạo nên đoạn ADN sản phẩm. Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn ADN và các băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu. Ưu điểm: Kỹ thuật đơn giản, nhanh, chi phí thấp.

Có thể sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi (Multiplex gap – PCR) để chẩn đoán đồng thời nhiều đột biến. Nhược điểm: Chỉ phát hiện được những đột biến mất đoạn đã biết trước trình tự vùng ADN đứt gãy. Ứng dụng: để chẩn đoán các đột biến mất đoạn α-thalassemia như đột -- SEA, -- THAI, --MED, -- FIL, -α3.2 và một vài mất đoạn β thalassemia nhưδβ-thalassemia, HPFH,. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification – MLPA) Nguyên lý: Kỹ thuật này sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai với phân tử ADN đích đặc hiệu.

Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào phân tử ADN đích, sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang.