Nghiên cứu kỹ thuật ARMS phát hiện đột biến gene 8 globin gây bệnh thalassemia tại Việt Nam

Nghiên cứu kỹ thuật arms phát hiện đột biến gene beta globin gây bệnh beta thalassemia tại Việt Nam, góp phần nâng cao y tế cộng đồng.

• Tác giả: Lê Thị Hảo
• Người hướng dẫn: GS.TS Trương Đình Kiệt
• Trường học: Sở Khoa Học - Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Kỹ Thuật ARMS Phát Hiện Đột Biến Gene 8 Globin Gây Bệnh Thalassemia Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Báo Cáo Kết Quả Đề Tài
• Năm xuất bản: 2003
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở di truyền học phân tử bệnh β thalassemia
• 1.1.1. Các loại Hb và phân loại bệnh lý về Hb
• 1.1.1.1. Nhóm các Hb bất thường
• 1.1.1.2. Nhóm thalassemia
• 1.1.2. Các gen tổng hợp các chuỗi globin
• 1.1.3. Bệnh học phân tử của β thalassemia
• 1.1.3.1. Các đột biến vùng promoter
• 1.1.3.2. Đột biến trong quá trình cắt nối RNA
• 1.1.3.3. Các đột biến tạo ra các mRNA không có chức năng
• 1.1.3.4. Bệnh học phân tử của HbE
• 1.2. Bệnh học β thalassemia
• 1.2.1. Đặc điểm lâm sàng của β thalassemia
• 1.2.1.1. β thalassemia nặng (hay thiếu máu Cooley)
• 1.2.1.2. β thalassemia trung gian
• 1.2.1.3. β thalassemia nhẹ
• 1.2.2. Cơ chế bệnh học của β thalassemia
• 1.2.3. Sự tương tác giữa kiểu gen và các biểu hiện lâm sàng
• 1.2.3.1. Các đột biến β thalassemia
• 1.2.3.2. Sự kết hợp giữa α thalassemia và β thalassemia
• 1.2.3.3. Sự kết hợp giữa β thalassemia và các yếu tố làm tăng HbF
• 1.3. Sự lưu hành các gen β thalassemia trên thế giới
• 1.3.1. Tại vùng Địa Trung Hải
• 1.3.2. Tại lục địa Ấn Độ
• 1.3.3. Khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc
• 1.4. Chẩn đoán β thalassemia bằng các kỹ thuật sinh học phân tử
• 1.4.1. Nguồn DNA
• 1.4.2. Các kỹ thuật phát hiện đột biến dựa trên kỹ thuật PCR
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH BỆNH NHÂN VÀ GIA ĐÌNH
• PHIẾU KHẢO SÁT BỆNH NHÂN

Tóm tắt

I. Thalassemia Việt Nam Tổng Quan và Thách Thức Nghiên Cứu

Thalassemia là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự giảm tổng hợp chuỗi globin, dẫn đến thiếu máu. Tình trạng này làm giảm số lượng chuỗi α hoặc β globin, gây ra Alpha Thalassemia hoặc Beta Thalassemia tương ứng. Tại Việt Nam, các bệnh về huyết sắc tố như Thalassemia và Hb E Thalassemia là những bệnh di truyền thường gặp nhất. Tỷ lệ người mang gene bệnh ở người Kinh dao động từ 1.5% đến 2%, nhưng lại cao hơn đáng kể ở các dân tộc thiểu số như Thái (16%) và Mường (25%). Sự phân bố rộng rãi của các gene bệnh này đã tạo nên gánh nặng bệnh tật đáng kể, đặc biệt là thể kết hợp β/HbE, chiếm phần lớn bệnh nhân cần nhập viện điều trị. Việc điều trị các thể bệnh nặng đòi hỏi truyền máu và chẩn đoán Thalassemia sớm, đặt ra yêu cầu cấp thiết về các phương pháp phát hiện đột biến gene hiệu quả.

1.1. Bệnh Thalassemia Gánh nặng di truyền tại Việt Nam

Bệnh Thalassemia, còn gọi là bệnh tan máu bẩm sinh, là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng tại Việt Nam. Do tỷ lệ người mang gene bệnh cao, đặc biệt ở các nhóm dân tộc thiểu số, gánh nặng về kinh tế và xã hội do bệnh này gây ra là rất lớn. Theo báo cáo của Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM, các bệnh về huyết sắc tố là một trong những bệnh di truyền thường gặp, trong đó Thalassemia chiếm tỷ lệ cao. Sự kết hợp giữa Alpha Thalassemia và Beta Thalassemia, đặc biệt là thể β/HbE, làm tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh và nhu cầu điều trị. Do đó, cần có các biện pháp sàng lọc Thalassemia và chẩn đoán Thalassemia hiệu quả để giảm thiểu gánh nặng bệnh tật.

1.2. Vai trò của chẩn đoán sớm và kỹ thuật sinh học phân tử

Việc chẩn đoán Thalassemia sớm đóng vai trò then chốt trong việc giảm thiểu biến chứng và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Các kỹ thuật sinh học phân tử, như kỹ thuật PCR và giải trình tự gene, đã mở ra những cơ hội mới trong việc phát hiện đột biến gene một cách nhanh chóng và chính xác. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định người mang gene bệnh mà còn cho phép chẩn đoán trước sinh, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh. Việc ứng dụng rộng rãi các kỹ thuật này là cần thiết để giảm thiểu gánh nặng của Thalassemia tại Việt Nam.

II. Kỹ Thuật ARMS PCR Cách Phát Hiện Đột Biến Gene 8 Globin

ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện đột biến gene một cách nhanh chóng và hiệu quả. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu, chỉ khuếch đại trình tự DNA khi có hoặc không có đột biến. Các đoạn mồi ARMS được thiết kế sao cho nucleotide khác biệt giữa các allele (bình thường và đột biến) nằm ở đầu 3' của đoạn mồi. Điều này đảm bảo rằng phản ứng PCR chỉ xảy ra khi đoạn mồi hoàn toàn khớp với trình tự DNA đích. Kỹ thuật ARMS-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, là một công cụ hữu ích trong chẩn đoán Thalassemia và các bệnh di truyền khác. Theo báo cáo, mỗi phản ứng cần cặp mồi, một cặp mồi để làm chứng âm và một cặp mồi bình thường.

2.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ARMS trong xét nghiệm Thalassemia

Kỹ thuật ARMS-PCR hoạt động dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA giữa allele bình thường và allele đột biến. Các đoạn mồi ARMS được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại trình tự DNA khi có sự khớp hoàn toàn với nucleotide ở đầu 3'. Nếu có đột biến, đoạn mồi sẽ không gắn kết hiệu quả, ngăn chặn quá trình khuếch đại. Điều này cho phép phân biệt giữa người mang gene bệnh và người không mang gene bệnh một cách chính xác. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong việc sàng lọc Thalassemia, vì nó có thể phát hiện nhiều đột biến khác nhau trong cùng một phản ứng.

2.2. Ưu điểm của ARMS PCR so với các phương pháp chẩn đoán khác

So với các phương pháp chẩn đoán Thalassemia truyền thống như điện di huyết sắc tố, kỹ thuật ARMS-PCR có nhiều ưu điểm vượt trội. ARMS-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, cho phép phát hiện đột biến gene một cách chính xác hơn. Kỹ thuật này cũng nhanh chóng hơn và có thể được thực hiện với chi phí tương đối thấp, phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Ngoài ra, ARMS-PCR có thể được sử dụng để chẩn đoán trước sinh, giúp các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh đưa ra quyết định informed.

2.3. Tối ưu hóa phản ứng ARMS PCR yếu tố cần thiết để tăng độ chính xác

Để đảm bảo độ chính xác của kỹ thuật ARMS-PCR, cần tối ưu hóa các thông số phản ứng như nồng độ MgCl2, nhiệt độ ủ, nồng độ DNA và chu kỳ PCR. Nồng độ dNTP thấp có thể làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng. Việc thiết kế các đoạn mồi ARMS cũng rất quan trọng, đoạn mồi cần được thiết kế sao cho các nucleotide khác biệt giữa các allele nằm ở đầu 3' của đoạn mồi và chiều dài của đoạn mồi khoảng 20-30 base với hàm lượng GC khoảng 50%. Theo tài liệu, thiết kế đoạn mồi ARMS cần có chiều dài khoảng base và 50% GC, không có nucleotide tương ứng.

III. Ứng Dụng ARMS PCR Tại Việt Nam Kết Quả và Triển Vọng Mới

Việc ứng dụng kỹ thuật ARMS-PCR tại Việt Nam đã mang lại những kết quả khả quan trong việc phát hiện đột biến gene HBB gây bệnh Thalassemia. Các nghiên cứu đã xác định được các đột biến phổ biến nhất trong cộng đồng người Việt, bao gồm các đột biến như FS 41/42, CD 26, CD 71/72 và IVS-I-1 (G>A). Việc xác định các đột biến này cho phép phát triển các bộ kit xét nghiệm Thalassemia đơn giản và hiệu quả, giúp sàng lọc Thalassemia và chẩn đoán trước sinh dễ dàng hơn. Việc triển khai kỹ thuật ARMS-PCR tại các bệnh viện và trung tâm xét nghiệm trên cả nước sẽ góp phần giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do Thalassemia gây ra. Nghiên cứu của Lê Thị Hảo cộng sự đã phát hiện đột biến ở bệnh nhân ở Hồ Chí Minh, với FS 11/42 gặp nhất.

3.1. Xác định đột biến gene phổ biến bằng ARMS PCR ở bệnh nhân Thalassemia Việt Nam

Kỹ thuật ARMS-PCR đã được sử dụng để xác định các đột biến phổ biến trong gene globin ở bệnh nhân Thalassemia tại Việt Nam. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các đột biến FS 41/42, CD 26, CD 71/72 và IVS-I-1 (G>A) là những đột biến thường gặp nhất. Việc xác định các đột biến này cho phép phát triển các xét nghiệm Thalassemia đặc hiệu, giúp phát hiện đột biến gene một cách nhanh chóng và chính xác hơn. Điều này rất quan trọng trong việc sàng lọc Thalassemia ở phụ nữ mang thai và các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh.

3.2. Triển khai ARMS PCR trong sàng lọc và chẩn đoán trước sinh Thalassemia

Việc triển khai kỹ thuật ARMS-PCR trong chương trình sàng lọc Thalassemia và chẩn đoán trước sinh tại Việt Nam là một bước tiến quan trọng. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đột biến gene ở giai đoạn sớm của thai kỳ, giúp các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh đưa ra quyết định informed về việc tiếp tục hay chấm dứt thai kỳ. Điều này góp phần giảm thiểu số lượng trẻ em sinh ra mắc bệnh Thalassemia nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội. Tại các nước Đông Nam Á như Singapore, Malaixia, việc phòng bệnh được tiến hành rộng rãi bằng biện pháp chẩn đoán trước sinh.

3.3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của ARMS PCR trong phát hiện đột biến gene HBB

Độ nhạy của kỹ thuật ARMS là khả năng phát hiện chính xác các trường hợp dương tính. Độ đặc hiệu của kỹ thuật ARMS là khả năng loại trừ chính xác các trường hợp âm tính. Việc đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ARMS-PCR trong việc phát hiện đột biến gene HBB là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ARMS-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện đột biến gene một cách chính xác trong phần lớn các trường hợp. Tuy nhiên, để đảm bảo tính chính xác tối đa, cần thực hiện các kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt và tuân thủ các quy trình chuẩn.

IV. SHPT Xây Dựng Quy Trình Phát Hiện Đột Biến Gene Thalassemia

Xây dựng SHPT (Sinh phẩm thử) phát hiện đột biến gene Thalassemia là một mục tiêu quan trọng trong việc cải thiện khả năng chẩn đoán Thalassemia tại Việt Nam. SHPT giúp phát hiện các đột biến gene HBB đã biết trước đây, góp phần phân tích đột biến dễ dàng hơn. Sử dụng SHPT giúp phát hiện đột biến nhanh hơn giải trình tự gene. SHPT được xây dựng từ các đoạn mồi và các thành phần cần thiết cho phản ứng ARMS-PCR, được chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Việc sử dụng SHPT giúp giảm thiểu sai sót và tăng độ tin cậy của kết quả xét nghiệm, đồng thời giúp các phòng thí nghiệm dễ dàng thực hiện xét nghiệm Thalassemia hơn.

4.1. Vai trò của SHPT trong việc chuẩn hóa quy trình xét nghiệm Thalassemia

SHPT đóng vai trò quan trọng trong việc chuẩn hóa quy trình xét nghiệm Thalassemia. SHPT giúp giảm thiểu sai sót và tăng độ tin cậy của kết quả xét nghiệm bằng cách sử dụng các thành phần đã được chuẩn hóa. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán Thalassemia, vì kết quả xét nghiệm chính xác là rất cần thiết để đưa ra các quyết định điều trị phù hợp. Việc sử dụng SHPT cũng giúp các phòng thí nghiệm dễ dàng thực hiện xét nghiệm Thalassemia hơn, vì họ không cần phải tự chuẩn bị các thành phần cần thiết.

4.2. Ưu điểm của việc sử dụng SHPT so với các phương pháp tự pha chế

Việc sử dụng SHPT có nhiều ưu điểm so với các phương pháp tự pha chế. SHPT giúp giảm thiểu sai sót và tăng độ tin cậy của kết quả xét nghiệm, vì các thành phần đã được chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. SHPT cũng giúp tiết kiệm thời gian và công sức, vì các phòng thí nghiệm không cần phải tự chuẩn bị các thành phần cần thiết. SHPT cũng giúp đảm bảo tính nhất quán của kết quả xét nghiệm giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. SHPT cũng đã được sử dụng nhiều trong việc chẩn đoán bệnh cho các mẫu bệnh phẩm khác nhau.

V. Kết Luận Kỹ Thuật ARMS PCR và Tương Lai Chẩn Đoán Thalassemia

Nghiên cứu kỹ thuật ARMS-PCR trong phát hiện đột biến gene 8 globin gây bệnh Thalassemia tại Việt Nam đã mang lại những kết quả đầy hứa hẹn. Kỹ thuật này cho phép phát hiện đột biến gene một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả, góp phần cải thiện khả năng chẩn đoán Thalassemia và giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do bệnh này gây ra. Việc triển khai kỹ thuật ARMS-PCR trong chương trình sàng lọc Thalassemia và chẩn đoán trước sinh tại Việt Nam là một bước tiến quan trọng, giúp các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh đưa ra quyết định informed. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật chẩn đoán Thalassemia mới, đồng thời tăng cường công tác tư vấn di truyền và nâng cao nhận thức cộng đồng về bệnh Thalassemia.

5.1. Tầm quan trọng của việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển kỹ thuật

Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật chẩn đoán Thalassemia mới là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc phát triển các kỹ thuật nhanh chóng, chính xác và có chi phí thấp, phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu về các đột biến gene mới và các yếu tố di truyền khác liên quan đến bệnh Thalassemia, từ đó phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn. Cần có nghiên cứu sâu hơn về các vấn đề bệnh di truyền khác.

5.2. Nâng cao nhận thức cộng đồng và tư vấn di truyền về bệnh Thalassemia

Nâng cao nhận thức cộng đồng về bệnh Thalassemia và tăng cường công tác tư vấn di truyền là rất quan trọng để giảm thiểu gánh nặng bệnh tật do bệnh này gây ra. Cần tổ chức các chương trình giáo dục sức khỏe để cung cấp thông tin về bệnh Thalassemia, các biện pháp phòng ngừa và các lựa chọn chẩn đoán và điều trị bệnh. Tư vấn di truyền cần được cung cấp cho các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh, giúp họ hiểu rõ về nguy cơ và đưa ra các quyết định informed. Các hoạt động này rất quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe của cộng đồng.

Nội dung chính

Nghiên cứu Xác lập Kỹ thuật ARMS Phát hiện Đột biến Gene $\beta$-Globin Gây Bệnh $\beta$-Thalassemia tại Việt Nam

Tóm tắt nghiên cứu

• Câu hỏi nghiên cứu chính (Research Question): Làm thế nào để tối ưu hóa và xác lập quy trình kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) chuẩn xác, chi phí thấp, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam nhằm phát hiện nhanh các đột biến điểm phổ biến trên gene $\beta$-globin gây bệnh $\beta$-Thalassemia?
• Phương pháp tiếp cận (Methodology Snapshot): Đề tài thực hiện thu thập 207 mẫu máu từ 110 bệnh nhân và người thân (42 gia đình) tại nhiều trung tâm y tế lớn ở Việt Nam. Nghiên cứu triển khai quy trình ly trích DNA tiêu chuẩn, thiết kế các đoạn mồi chuyên biệt (đặc biệt là cặp mồi tự thiết kế cho đột biến CD 95), tối ưu hóa nhiệt độ lai theo hai ngưỡng ($65^\circ\text{C}$ và $60^\circ\text{C}$) kết hợp kiểm soát chứng nội tại. Kết quả được kiểm chứng đối chiếu độc lập bằng kỹ thuật giải trình tự gene tự động tại Bệnh viện Henri Mondor (Cộng hòa Pháp).
• Phát hiện cốt lõi (Key Findings): Xác lập thành công quy trình ARMS-PCR 2 bước phát hiện chính xác 8 đột biến gene $\beta$-globin phổ biến nhất tại Việt Nam (gồm FS 41/42, CD 17, HbE, CD 71/72, CD 95, -28, IVS 1-1, IVS 2-654). Đột biến đặc thù CD 95 (+A) được phát hiện chính xác 100% so với giải trình tự gene. Đề tài cũng đóng gói thành công bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán hoàn chỉnh.
• Ý nghĩa thực tiễn (Implications): Cung cấp công cụ chẩn đoán di truyền phân tử có độ chính xác cao, chi phí hợp lý, tạo tiền đề vững chắc cho công tác sàng lọc người lành mang gene, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh bệnh $\beta$-Thalassemia tại các cơ sở y tế trong nước.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng

Hiện trạng y khoa và gánh nặng bệnh lý

$\beta$-Thalassemia ($\beta$-thal) là bệnh thiếu máu tán huyết di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến hàng đầu thế giới. Bệnh sinh do đột biến trên cụm gene $\beta$-globin nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 11 ($11\text{p}15.5$), dẫn đến việc suy giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng tổng hợp chuỗi polypeptide $\beta$-globin. Hậu quả là sự mất cân bằng giữa chuỗi $\alpha$ và $\beta$-globin, gây tích tụ các chuỗi $\alpha$ tự do tạo thành các thể vùi không hòa tan làm phá hủy hồng cầu non trong tủy xương và hồng cầu trưởng thành ở máu ngoại vi.

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng triệu người trên thế giới mang gene bệnh và mỗi năm có hàng trăm ngàn trẻ sinh ra mắc thể bệnh nặng. Tại Việt Nam, tần số mang gene $\beta$-thal ở người Kinh dao động từ 1,5% – 2%, nhưng ở một số đồng tộc thiểu số (như Thái, Mường), tỷ lệ này có thể lên tới 16% – 25%. Đặc biệt, tần số mang gene biến thể huyết sắc tố HbE (Codon 26 G $\rightarrow$ A) ở người Ê-đê và S'tiêng lên tới 41,9% – 55,9%. Sự kết hợp giữa $\beta$-thal và HbE ($\beta$-thal/HbE) chiếm tới 2/3 tổng số bệnh nhân $\beta$-thal thể nặng, tạo ra gánh nặng điều trị truyền máu và thải sắt suốt đời, tiêu tốn nguồn lực y tế khổng lồ.

       [Đột biến gene β-globin (NST 11)]
       [Giảm/mất chuỗi β-globin]
   [Dư thừa chuỗi α-globin không hòa tan]
         /                          \
[Hồng cầu non chết      [Tan máu ngoại vi dữ dội]
        \                            /
      [Thiếu máu tán huyết mạn tính & Quá tải sắt]

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap)

Mặc dù trên thế giới đã ghi nhận hơn 175 kiểu đột biến gene $\beta$-globin, nhưng các đột biến này mang tính đặc trưng chủng tộc và phân bố địa lý rất rõ rệt. Tại Việt Nam vào đầu những năm 2000, phần lớn các nghiên cứu mới dừng lại ở dịch tễ học, huyết học lâm sàng hoặc phân tích phân tử quy mô nhỏ gửi mẫu ra nước ngoài. Việc chẩn đoán xác định đột biến đòi hỏi trang thiết bị giải trình tự đắt tiền, chưa thể áp dụng rộng rãi tại các bệnh viện tuyến tỉnh và cơ sở lâm sàng trong nước.

Tính cấp thiết và tác động tiềm năng

Nghiên cứu do GS.TS Trương Đình Kiệt cùng cộng sự tại Đại học Y Dược TP.HCM chủ trì là bước đột phá nhằm nội địa hóa kỹ thuật sinh học phân tử. Việc xác lập thành công kỹ thuật ARMS-PCR kèm quy trình sản xuất bộ kit thử nghiệm mở ra khả năng chủ động tầm soát tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh, giúp giảm thiểu tỷ lệ sinh con mắc bệnh thể nặng, nâng cao chất lượng dân số.

---

Phương pháp và tiếp cận nghiên cứu

                   [Chiến lược ARMS-PCR 2 bước]
                   /                           \
    [Bước 1: Sàng lọc 3 đột biến]  [Bước 2: Sàng lọc 5 đột biến còn lại]
     (CD 17, FS 41/42, HbE)         (CD 71/72, CD 95, -28, IVS 1-1, IVS 2-654)
     - Nhiệt độ lai: 65°C           - Nhiệt độ lai: 60°C
                  \                             /

Thiết kế nghiên cứu và thu thập mẫu

Nghiên cứu áp dụng thiết kế mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm phân tích phân tử. Tổng cộng 207 mẫu máu tĩnh mạch chống đông bằng $\text{K}_2\text{EDTA}$ được thu nhận từ 110 bệnh nhân đã được chẩn đoán $\beta$-thalassemia và thân nhân thuộc 42 phả hệ tại 4 trung tâm:

1. Trung tâm Truyền máu và Huyết học TP.HCM.
2. Bệnh viện Nhi Đồng 1 TP.HCM.
3. Bệnh viện Đa khoa tỉnh Gia Lai.
4. Bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh.

Mẫu máu được khảo sát chỉ số huyết học tổng quát trên máy tự động CELL-DYN 3500 (Abbott) và điện di huyết sắc tố bằng máy VARIANT (Bio-Rad) trước khi tiến hành phân tích di truyền.

Quy trình tách chiết DNA và tối ưu hóa phản ứng ARMS-PCR

• Tách chiết DNA: Ứng dụng quy trình ly giải hồng cầu bằng đệm $\text{NH}4\text{Cl}/\text{KHCO}3$, phá hủy màng tế bào bạch cầu bằng SDS và Proteinase K, kết tủa protein bằng $\text{NaCl}$ bão hòa và thu hồi DNA bằng Isopropanol. Nồng độ DNA trung bình đạt $22,\mu\text{g/ml}$ với độ tinh khiết quang phổ chuẩn $\text{OD}{260}/\text{OD}{280} = 1{,}7 - 1{,}8$.
• Nguyên lý ARMS-PCR: Dựa trên cơ chế mồi đặc hiệu alen, trong đó nucleotide tại đầu $3'$ của đoạn mồi được thiết kế khớp chính xác với alen đột biến hoặc alen bình thường. Nếu bắt cặp sai (mismatch), enzyme DNA polymerase không thể kéo dài chuỗi.
• Chiến lược sàng lọc 2 bước phân tầng nhiệt độ:
  • Bước 1 ($65^\circ\text{C}$): Sàng lọc 3 đột biến có tần suất cao nhất gồm CD 17 ($\text{A}\rightarrow\text{T}$), FS 41/42 ($-\text{TTCT}$) và HbE.
  • Bước 2 ($60^\circ\text{C}$): Sàng lọc 5 đột biến tiếp theo gồm CD 71/72 ($+\text{A}$), CD 95 ($+\text{A}$), $-28$ ($\text{A}\rightarrow\text{G}$), IVS 1-1 ($\text{G}\rightarrow\text{A/T}$), IVS 2-654 ($\text{C}\rightarrow\text{T}$).
• Kiểm soát chất lượng (Quality Control): Tất cả các phản ứng PCR đều tích hợp một cặp mồi chứng nội tại (Internal Control, khuếch đại đoạn chứng kích thước 861 bp) để phát hiện hiện tượng âm tính giả do ức chế phản ứng. Đồng thời, mỗi mẻ chạy đều bao gồm mẫu chứng âm, mẫu chứng dương và chứng nước không DNA để loại trừ ngoại nhiễm chéo.

Kiểm định và độ tin cậy

Các mẫu mang đột biến CD 95 ($+\text{A}$) – đột biến được phát hiện bằng cặp mồi do nhóm nghiên cứu tự thiết kế – và các mẫu không xác định được đột biến bằng ARMS đều được giải trình tự trực tiếp hai chiều Exon 1 và Exon 2 bằng bộ kit ABI BigDye Terminator trên hệ thống máy ABI PRISM 377 tại Bệnh viện Henri Mondor (Paris, Pháp).

---

Phát hiện chính

  ==> Độ trùng khớp: 100% giữa ARMS-PCR trong nước và Sequencing quốc tế

1. Tối ưu hóa thành công phổ nhiệt độ lai phân tầng

Nghiên cứu chứng minh rằng việc áp dụng nguyên bản quy trình quốc tế (chạy đồng loạt ở $65^\circ\text{C}$) gây ra tỷ lệ âm tính giả đáng kể đối với một số đột biến tại Việt Nam. Bằng cách phân định 2 dải nhiệt độ lai ($65^\circ\text{C}$ cho 3 đột biến thường gặp và $60^\circ\text{C}$ cho 5 đột biến còn lại), hệ thống phản ứng đạt độ nhạy và độ đặc hiệu tối đa trên gel agarose 2%, loại bỏ hoàn toàn các băng khuếch đại không đặc hiệu.

2. Thiết kế thành công mồi đặc hiệu cho đột biến CD 95 (+A)

Đột biến mất/thêm nucleotid tại Codon 95 (CD 95 $+\text{A}$) là đột biến hiếm gặp trên thế giới nhưng lại có tần suất lưu hành đáng kể tại Việt Nam (chiếm tới gần 9% trong một số khảo sát trước đó). Cặp mồi tự thiết kế cho CD 95 của đề tài hoạt động ổn định, chính xác và được thẩm định đạt độ tương đồng 100% khi giải trình tự gene tại phòng thí nghiệm Bệnh viện Henri Mondor.

3. Tỷ lệ bao phủ chẩn đoán vượt trội

Với danh mục 8 đột biến chọn lọc (gồm 6 đột biến gây kiểu hình mất chuỗi hoàn toàn $\beta^0$ và 2 đột biến giảm chuỗi $\beta^+$), quy trình ARMS-PCR đã nhận diện được trên 90% số allele đột biến ở bệnh nhân $\beta$-thalassemia tại miền Nam Việt Nam. Trong đó, các kiểu đột biến ưu thế chiếm đa số gồm:

• Đột biến dịch khung FS 41/42 (-TTCT) và đột biến vô nghĩa CD 17 (A $\rightarrow$ T).
• Đột biến HbE (Codon 26 G $\rightarrow$ A) trong các ca phối hợp dị hợp tử kép $\beta$-thal/HbE.
• Các đột biến tiếp theo gồm -28 (A $\rightarrow$ G), CD 71/72 (+A), CD 95 (+A), IVS 1-1 (G $\rightarrow$ A/T) và IVS 2-654 (C $\rightarrow$ T).

4. Đơn giản hóa kỹ thuật phát hiện trên nền Agarose thông thường

Thay vì phải dùng hệ thống điện di mao quản hay gel polyacrylamide biến tính (DGGE/CDGE) đắt tiền, quy trình tối ưu chỉ sử dụng gel agarose 2% với thuốc nhuộm Ethidium Bromide tiêu chuẩn, cho phép đọc kết quả rõ ràng dưới ánh sáng tử ngoại (UV transilluminator), rút ngắn thời gian trả kết quả xuống dưới 6 giờ làm việc.

---

Đóng góp khoa học và giá trị ứng dụng

Đóng góp về mặt học thuật và phương pháp luận

• Xây dựng phả hệ phân tử gene $\beta$-globin tại Việt Nam: Làm sáng tỏ bức tranh phân bố allele đột biến trên nhóm đối tượng đa sắc tộc (Kinh, Hoa, Khmer, Tày, Nùng, Thái), khẳng định tính chất đặc trưng chủng tộc của các đột biến huyết sắc tố.
• Cải tiến kỹ thuật sinh học phân tử: Minh chứng tính khả thi của việc thiết kế mồi nội địa hóa cho các đột biến bản địa đặc thù (CD 95), mở ra phương pháp tiếp cận chủ động cho các bệnh di truyền đơn gene khác.

Đóng góp thực tiễn và tác động kinh tế - xã hội

• Thành phẩm hóa dạng kit thử nghiệm: Đề tài đã xây dựng và đóng gói bộ kit sinh học phân tử đồng bộ (Kit ly trích DNA, Kit ARMS-PCR 8 đột biến và Kit điện di) dùng cho 20 mẫu/bộ, bảo quản ổn định ở $-20^\circ\text{C}$ với độ bền thử nghiệm định kỳ mỗi 3 tháng.
• Hiệu quả kinh tế vượt trội: Chi phí xét nghiệm xác định đột biến bằng ARMS-PCR rẻ hơn rất nhiều so với phương pháp giải trình tự gen hoặc chi phí xét nghiệm gửi ra nước ngoài tại thời điểm nghiên cứu. Đặc biệt, chi phí này chỉ bằng một phần rất nhỏ so với chi phí truyền máu và điều trị thải sắt mạn tính suốt đời cho một bệnh nhân thể nặng (ước tính hàng trăm triệu đồng).
• Định hình chính sách sàng lọc trước sinh: Cung cấp cơ sở kỹ thuật vững chắc để ngành y tế triển khai mạng lưới tư vấn tiền hôn nhân, sàng lọc dị hợp tử và chọc ối/sinh thiết gai nhau chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ chồng có nguy cơ cao.

---

Đối tượng quan tâm và hưởng lợi

Nhóm đối tượng	Khía cạnh tiếp cận & Ứng dụng cụ thể
Bác sĩ Huyết học & Sản phụ khoa	Sử dụng kết quả ARMS-PCR để chẩn đoán xác định kiểu gen, tiên lượng mức độ nặng của bệnh trên lâm sàng, thực hiện tư vấn di truyền trước hôn nhân và chỉ định chẩn đoán trước sinh sớm cho thai nhi.
Kỹ thuật viên & Labo Xét nghiệm	Dễ dàng tiếp cận quy trình PCR chuẩn hóa, vận hành trên máy luân nhiệt thông thường mà không cần đầu tư máy giải trình tự thế hệ mới đắt đỏ.
Nhà nghiên cứu Di truyền học	Tham khảo dữ liệu dịch tễ học phân tử, trình tự mồi và các thông số nhiệt động học tối ưu để phát triển thêm các xét nghiệm đa mồi (Multiplex ARMS-PCR) hoặc kỹ thuật Real-time PCR.
Cơ quan Hoạch định Y tế Công cộng	Xây dựng chiến lược quốc gia về phòng chống bệnh Thalassemia, đưa xét nghiệm sàng lọc người mang gene vào danh mục chăm sóc sức khỏe sinh sản định kỳ.

---

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

1. Kỹ thuật ARMS-PCR có ưu điểm gì vượt trội so với các kỹ thuật phát hiện đột biến khác?

ARMS-PCR cho phép phát hiện trực tiếp đột biến điểm hoặc đột biến mất/thêm đoạn nhỏ chỉ qua một bước phản ứng khuếch đại và điện di trên gel agarose thường. Kỹ thuật này phân biệt rõ ràng trạng thái đồng hợp tử, dị hợp tử mà không cần bước cắt enzyme giới hạn (RFLP) hay sử dụng hóa chất độc hại như kỹ thuật DGGE/SSCP.

2. Làm thế nào để đảm bảo kết quả ARMS không bị âm tính giả?

Mỗi phản ứng ARMS luôn được bổ sung một cặp mồi chứng nội tại (khuếch đại một đoạn gene độc lập có kích thước 861 bp). Nếu phản ứng hoạt động bình thường, băng chứng nội tại luôn luôn xuất hiện. Trường hợp không có sản phẩm đột biến và cũng không có băng chứng nội tại, phản ứng bị lỗi và kết quả đó bị hủy bỏ để làm lại.

3. Đột biến CD 95 (+A) có ý nghĩa đặc biệt như thế nào trong nghiên cứu này?

Đột biến CD 95 ($+\text{A}$) là đột biến dịch khung rất hiếm gặp ở các quần thể Địa Trung Hải hoặc Trung Quốc nhưng lại xuất hiện với tỷ lệ cao ở người Việt Nam. Nhóm nghiên cứu đã tự thiết kế thành công đoạn mồi đặc hiệu cho CD 95 và được kiểm chứng chính xác 100% qua giải trình tự tại Pháp, chứng minh năng lực tự chủ công nghệ sinh học phân tử trong nước.

4. Kết quả nghiên cứu có thể mở rộng cho toàn bộ các thể bệnh Thalassemia không?

Quy trình ARMS này tập trung phát hiện 8 kiểu đột biến phổ biến nhất trên gene $\beta$-globin (gây $\beta$-Thalassemia và biến thể HbE). Đối với các thể $\alpha$-Thalassemia (chủ yếu do mất đoạn lớn như $--^{\text{SEA}}$) hoặc các đột biến gene $\beta$-globin cực hiếm, cần kết hợp thêm kỹ thuật Gap-PCR hoặc giải trình tự toàn bộ gene.

5. Ứng dụng thực tiễn lớn nhất của bộ kit ARMS-PCR là gì?

Ứng dụng quan trọng nhất là chẩn đoán trước sinh. Khi xác định được đột biến ở cả cha và mẹ, bác sĩ có thể tách chiết DNA từ mẫu sinh thiết gai nhau (tuần thai 10–12) hoặc dịch ối (tuần thai 16–20) để xác định thai nhi có bị đồng hợp tử/dị hợp tử kép thể nặng hay không, từ đó đưa ra lời khuyên đình chỉ thai kỳ kịp thời.

---

Kết luận

Công trình nghiên cứu "Xác lập kỹ thuật ARMS phát hiện các kiểu đột biến trên gene $\beta$-globin gây bệnh $\beta$-Thalassemia tại Việt Nam" do GS.TS Trương Đình Kiệt làm chủ nhiệm là cột mốc quan trọng trong ứng dụng di truyền học phân tử vào y học lâm sàng nước nhà. Bằng việc tối ưu hóa quy trình ARMS-PCR 2 bước và phát triển thành công bộ kit chẩn đoán 8 đột biến chính yếu, đề tài đã giải quyết trọn vẹn bài toán phát hiện sớm, chính xác với chi phí tối ưu.

Trong tương lai, việc phát triển các biến thể Multiplex ARMS-PCR huỳnh quang hoặc kết hợp công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) sẽ tiếp tục mở rộng năng lực tầm soát. Các trung tâm y tế và phòng xét nghiệm lâm sàng cần đẩy mạnh ứng dụng quy trình này vào chương trình sàng lọc tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh thường quy để loại trừ dần gánh nặng bệnh Thalassemia trong cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đặc trưng bởi sự giảm tổng hợp chuỗi globin gay thiếu máu tán huyết mạn tính. Khi só sự giẩm số lượng chuỗi B globin sẽ gây B thalassemia (B thal), khi cd sy iam sO lugng chudi a sé gay a thalassemia (a thal) [+1]. Thalassemia ùag với các bệnh huyết sắc tế khác tạo nên một nhóm bệnh đơn gen phd a q Biện nhất trên thế giới và có tìn số caoở nhiéu dan te. Thalassemia phin bé dai ty Dia Trung Hai.

qua Trung Can Đông, Nam A tdi Đông Nam Á ¡2§J. Sự di dan gan day da lam cho gen thalassemia phat tin rộng khắp thế giới và làm cho thalassemia wd thanh van dé toan c4u [I1]. Theo Tổ chức Y :ẽ thế giới. trén thế giới có khoảng 269 triệu người mang gen vác bệnh huyết sắc tố và mỗi năm có khoảng 300.000 trẻ bị bệnh huyết ấc tố nặng được sinh ra [40].

mã Tại Việt nam, các bệnh huyết sắc tố là một trong những bệnh di truvễn thường gặp, trong đó chủ vếu là tha, œ tha] và HbE. Tân số mang gen B thal ở người Kinh là !.5-2% và rất cao ở các ¿šz tộc thiểu số như Thái 16%, Mường 25%. Tần số mang sen HbE ở người Kinh là 1-9% nhưng lên đến 41,9% ở người ÈĐê và 55,9% ở người Stiêng (3]. Do sự phân bố rộng rãi của các gen bệnh này ở khắp các điạ phương, các vùng trong cả nước đã tạo ra sự lưu hành rộng rãi của bệnh § thai và 8 thai /HbE, trong đó thể kết hợp f thal /HbE chiếm 2/3 tổng số bệnh nhân B thal và 49% số bệnh nhân thiếu máu tán huyết nặng phẩi nhập Viện Nhi Quốc gia [4, 8, 9, 10].

Việc điểu trị những thể bệnh nặng đồi hỏi phải truyền- máu và thải sắt thường xuyên đã trở thành gánh nặng cho gia đình bệnh nhân và cho xã hội. Tuy việc ghép tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ giới hạn ở một số trường hợp và việc điều trị bệnh vẫn chủ yếu là điểu trị hỗ. trợ bằng truyền máu và thải sắt (1, 2. cho đến nay, việc sàng lọc người mang.

tham vấn di rmuyền và chẩn đoán trước sinh là biện pháp kiểm soát bệnh có hiệu quả nhất [17, 22. Người mang sen có thể dễ dàng phát hiện dựa vìo các chỉ số của hồng cầu và điện di hemoglobin ahung để tiến nà: chăn đoán t xinh thì đồi hồi phải tiến hành việc phân tích DNA (3Ì, 21. Trén lới việc chẩn đoán trước sinh B thal da duge tiến hành rộng rãi dựa trên cơ sở phân tử của bệnh và sự ứng dụng các kỹ thuật phân tích gen. Tuy 175 đột biến khác nhau đã được mô tả [12}) nhưng việc phân tích các đột biến dựa trên các kỹ thuật di truyền phân tử đã được đơn giản và nhanh chóng vì những khiếm khuyết của gen B glodin mang tính đặc trưng cho từng chủng tộc [15, Lố, 18, 19.

Ở nước ta tuy có rất nhiều công trình nghiên cứu về dịch tễ học. lâm sàng, điều trị nhưng ở mức đệ phản tử còn được biết đến rất Ít qua một số nghiên cứu hợp tác quốc tế [17. Đo vậy việc Iva chon một kỹ thuật áp dụng tại Việt nam sao cho vừa có khả năng phát hiện chính xác đột biến vừa có khả năng ấp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm tại Việt nam là một việc làm hết sức cần thiết. MUC TIEU NGHIEN CUU Từ những điểu đã trình bày trên, chúng tôi đã chọn cho mình để tài “Xác lập kỹ thuật ARMS phát hiện các kiểu đột biến trên gene gay 8 thalassenua tại Việt Nai ` iân cứu để tài này.

chúng tôi mong đạt các mục tiêu sau đây: I. Xác lập thông số tối ưu của kỹ thuật ARMS để chẩn đoán § đột biến đã được mê tả trước đây tại Việt nam trễ á+ bệnh nhàn đã được chẩn đoán § thai và gia đình họ. Xây dựng bộ kit SHPT để phất hiện các đột biến. Qua nghiên cứu này.

chúng tôi hy vọng có thể đóng góp vào việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phát hiên đột biến gen. góp phần vào việc chẩn đoán trước sinh bệnh § thai trong tương lai không xa. CHUONG 1 TONG QUAN TAI LIEU 1. CƠ SỞ DI TRUYỂN HOC PHAN TỬ BỆNH B THALLASSEMIA 1.

Các loại Hb và phân loại bệnh lý về Hb Hemoglobin (Hb) gồm 2 thành phẩn: phần pretein là globin gốm 4 chudi polypeptide va cdc chuối này gắn với thành phản thứ hai là hem gồm 4 nhân qua các vị trí gắn kết oxy. Các loại Hb khác nhau đặc trưng cho từng gia: đoạn phát triển: phôi. thai và sau sinh. Sự khác nhau này do các chuỗi giobin quy định [31].

Có các loại chuỗi sau đây: chuỗi alpha (œ), chuỗi beta :B:. Bệnh lý về Hb là bệnh di truyền phân tử pnẻ biển nhất của loà: người [33,94]. Các bất thường về Hb chủ yếu xảy ra phần globin cla phân tử hemoglobin. Có 2 nhóm bệnh về Hb: Nhóm các Hb bất thường Do có sự thay đổi 1 acid amin ở vị trí bình thường bằng | acid amin khác làm thay đổi cấu trúc của chuỗi globin polypeptide.

Các chuỗi polypeptide nay có sự thay đổi về thứ tự so với các polypeptide Ở người bình thường [31, 33, 39, 90]. Có tác giả gọi đây là bệnh lý chất lượng chuỗi Hb. Cho tới nay có gần 300 loại Hb bất thường đã được phát hiện (31]. Các loại Hb bất thường trong nhóm nay 14 HbE, HbC.

Tại khu vực'Đông Nam Á, HbE có sự lưu hành rất cao và đồng thời lưu hành với gen thalassemia nên đã tạo ra nhiều thể bệnh phối hợp ví dụ HbE với 8 thai. HbE với œ thai [8, 37, 68, 75, 81]. Nhém thalassemia Thalassemia được định nghĩa là bệnh lý di tuyển do sự mất hoặc giảm tổng hợp một hoặc nhiều chuỗi globin. Có tác giả gọi đây là bệnh lý ế lượng chuỗi globin.

Nhóm bệnh này được phân loại tùy theo sự giảm w téng hop chudi globin nao: «. œ Thalassemia gây ra đo giảm sẽ luợng chuỗi œ slebin. Có 2 dạng chính dựa theo độ năng củ “ bệnh: dạng nặng do không có chuối # (HbBarts) gây phù bào thai. dạng nhẹ hơn do giảm số lượng chuỗi œ ( bệnh HbH).

8 Thalassemia gay ra do sự giảm số lượng chudi B globin. Néu mat hoan toan sé lugng chuối B thì gại là B° thai. nếu giảm một phần thì gọi là §” thal: 1.Các gen tổng hợp các chuỗi globin Mỗi chuỗi polypepude globin được mã hóa bởi Ì gen. ở người và các động vật có vú khác, cụm gen B nằm trên 1 NST.

trong khi cụm gen œ nằm trên NST khác. Ở người, cụm gen B (e. 6 va ) nằm trên nhánh ngấn NST số II. rải dài trên đoạn DNA dai 60.

CHUTE G2 Ệ Gy Ay FR š OB : IHIE— —IE-IIE—y ad Hình 1.1: NST 1! va cde gen B globin (3!) + ao 1 ALN Hai gen a globin aim wén nhánh ngắn NST lố ( từ 16 p 13.33) trên một đoạn DNA đài 30.XST 16 và cụm gen œ giasi: 31] Trên mỗi NST l6 có 2 geạ ơ. Vùng mã hoá c¿a gen được sắp xếp 31 trong 3 exon và ma hod cho 141 acid amin trong đó exon Ì mã hóa cho acid acid amin, exon 2 mã hóa cho 68 acid amin va exon 3 ma hda cho 42 amin.NHBR -—; 13132 99 100141 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Hinh 1.3: Gen a globin [31] Tương tự như gen a. gen B cd 3 exon va 2 intron nhưng các exon va intron nay có độ đài khác với gen œ. Gen B ma hod cao chuối B globin dai héa cho 141 acid amin.

Exon 1 ma hod cho acid amia từ !-3¢. exon 2 ma acid amin ti 31-104 vi exon 3 mã hóa cho các acid amin tiv 105-146. Exon 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 Hình 1.4: Gen ff globin [31] Các exon nầy tương ứng với 3 vùng cấu trúc và chức năng của chuỗi B globin. Hai ving chứa các acid amin từ 1-30 và 105-136 (mã hóa bởi exon Ì và exon 3) nằm ở phía ngoài và chủ yếu là các acid amin ưa nước.

Vùng thứ 3 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin ky nước. Khi đột biến gen xây ra, trình tự về mặt chức năng bị thay đổi. ví dụ các acid amin ưa nước ở bể mặt bị thay thế bởi các acid amin ky nước thì sẽ tạo ra các thay đổi về lý hóa dẫn đến sự giảm đàn hồi. gảy ra sự không ổn định của phản tử [31].

Bệnh học phân tử của § thai Cho đến nay. 175 đột biến khác nhau gây B thai đã được mô tả. một số ít đột biến là do mất đoạn. còn chủ vếu là do đột biến điểm [23].

Các đột biến này có thể gây ra khiếm khuyết trong quá trình phiên mã. trong quá trình cắt nối RNA. làm xuất hiện mä đừng hoặc làm thay đổi quá trình đọc mã[33. xen B globin Eg3z ú Intron 2 a Inưoal _ Aad, ,, oo $ 6 Z “ở ổ nghĩa Z 44 46 6 8 (+ độtbiến vùng Paiy A °ow z % Hình 1.5: 8 thai do cae đột biến khác nhau gây ra [ 84] Hậu quả của các đột biếa là sự mất hoặc giản tổng hợp chuỗi 8 globin và có thể xếp các đột biến thành 2 nhóm [31, 58.

- Các đột biến gây mất hoàn toàn tổng hợp chuỗi B globin gọi là B ũ thai. sác đột biến B7 thai [58]. Các đột biến này có thể xảy ra ở vùng exon, intron va vùng promoter. Các đột biến vùng proimoter Đã có 18 đột biến vùng promoter được phá: hiện.Các đột biến ở vùng này gây ảnh hưởng đến quá trình phiên mã và nhìn chụng chỉ gây giảm nhẹ số lượng chuỗi beta globin voi các biểu hiện lâm sàng của § thai trung gian [23].

Đột biến trong quá trình cắt nối RNA Sau quá trình phiên mã, mRNA phải được cắt nối để loại bổ các intron. Các khiếm khuyết trong quá trình này có thể gây ra mất hoàn toàn quá trình cất nối bình thường hoặc giảm một phần hoặc tạo ra vị ưrí cắt nối mới trên intron hoặc exon gây ra B “ hoặc B ° thai [23. Các đột biến tạo ra các mÌNA không có chức năng - Đột biến vô nghĩa: xây ra khi thay thế 1 base này bằng 1 base khác làm xuất hiện mã dừng. Các chuỗi globin không hoàn chỉnh sẽ được tạo ra và nhanh chóng bị thoái hóa.

Các đột biến này gây ra kiểu hình 8° thai [SL].