ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch vẫn là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở cấp độ toàn cầu trong 20 năm qua. Số ca tử vong do bệnh tim mạch tăng hơn 2 triệu người kể từ năm 2000, lên gần 9 triệu người vào năm 2019, và hiện chiếm 16% tổng số ca tử vong do mọi nguyên nhân [73]. Các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh tim mạch và đột quỵ là chế độ ăn uống không lành mạnh, lười vận động, sử dụng thuốc lá, chất kích thích. Tác động của các yếu tố nguy cơ có thể biểu hiện ở mỗi người như tăng huyết áp, tăng đường huyết, rối loạn lipid máu (RLLPM) và thừa cân, béo phì.
Như vậy, rối loạn lipid máu là một trong các mục tiêu điều trị chính để phòng ngừa các bệnh tim mạch. Điều trị RLLPM phải kết hợp giữa điều chỉnh lối sống và điều trị bằng thuốc. Y học hiện đại sử dụng nhóm thuốc statin, fibrate, resin chelate hóa, acid nicotinic, các acid béo không no omega-3 có tác dụng hạ lipid máu nhanh, hiệu quả điều trị tốt nhưng đi kèm với nó là những tác dụng không mong muốn do thuốc gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và sinh hoạt hàng ngày của bệnh nhân như đau đầu, chóng mặt, mất ngủ, rối loạn tiêu hóa, đau mỏi cơ, tiêu cơ,… [18], [23], [37]. Vì vậy, xu hướng điều trị RLLPM hiện nay ưu tiên sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên vừa có hiệu quả điều trị vừa hạn chế được những tác dụng không mong muốn của thuốc tân dược.
Phương thuốc Giáng chỉ ẩm có xuất xứ từ sách “Thiên gia diệu phương” công năng ích âm, hóa ứ, giáng chỉ; chủ trị can thận âm hư, khí trệ, huyết ứ, lipid trong máu tăng [1], [26], biểu hiện lưng gối đau mỏi, ngũ tâm phiền nhiệt, mệt mỏi, đầu choáng tai ù, tự hãn, miệng khô, họng ráo [19] ứng dụng trong điều trị RLLPM. Theo một số tài liệu nghiên cứu chứng minh rằng, hai thành phần hóa học chính của vị dược liệu Đan sâm có trong phương thuốc là acid salvianolic B và tanshinon IIA làm giảm nồng độ của TC và TG, LDL-C, tăng HDL-C trong máu do đó có tác dụng làm hạ lipid máu [44], [58], [62], [65], [77]. Vì vậy việc định tính, định lượng hai hoạt chất trên có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá chất lượng của dược liệu và hiệu quả điều trị của phương thuốc. 1 Năm 2021 trong báo cáo đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu acid salvianolic B từ phương thuốc Giáng chỉ và xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng” của Ths.Ds Hoàng Mạnh Tuấn [28] đã đạt được một số kết quả: - Xây dựng được quy trình chiết xuất bằng nước nóng, điều chế cao đặc giàu acid salvianolic B từ phương thuốc Giáng chỉ ẩm.
- Định tính được 5 thành phần dược diệu có trong phương thuốc Giáng chỉ ẩm. - Định lượng acid salvianolic B (Sal-B) trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm. Tuy nhiên, đề tài còn một số nội dung cần tiếp tục nghiên cứu: - Đã xây dựng quy trình định lượng acid salvianolic B bằng phương pháp HPLC nhưng thời gian lưu dài (khoảng 30 phút), chưa xây dựng phương pháp định tính, định lượng tanshinon IIA (Tan-IIA) trong cao đặc. - Chưa nghiên cứu tác dụng sinh học của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm.
Để tiếp tục nghiên cứu, phát triển phương thuốc Giáng chỉ theo hướng ứng dụng, đề tài “Định tính, định lượng đồng thời acid salvianolic B, tanshinon II A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Định tính, định lượng đồng thời acid salvianolic B và tanshinon IIA trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm bằng mô hình gây tăng lipid máu nội sinh. Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC 1. Phương pháp HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao, là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [3]. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục gọi là pha động. Tốc độ di chuyển của các chất là khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan giữa ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [7].
Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động. 2 - Bộ phận khử khí. 4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler). 5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.
7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu vàđiều khiển toàn bộ hệ thống. 8 - Thiết bị in dữ liệu. Ứng dụng của phương pháp HPLC Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, hiện nay phương pháp HPLC là phương pháp rất phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm, dược phẩm, môi trường…Vì ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng định lượng tốt, mức độ chính xác cao, đặc biệt thích hợp để tách các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt nên nó được sử dụng khá nhiều cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu thí nghiệm, pháp lý và y dược. Đây là phương pháp được ứng dụng rất lớn trong ngành kiểm nghiệm nhất là kiểm nghiệm thuốc, dược liệu.
HPLC là công cụ đắc lực nhất trong phép phân tích định tính và định lượng các thành phần hóa học, hoạt chất trong dược liệu, các loại dược phẩm đa thành phần. Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA bằng HPLC Trong DĐVN V, hai thành phần hóa học Sal-B và Tan-IIA trong vị dược liệu Đan sâm được định tính, định lượng độc lập bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng. Chưa đưa ra phương pháp định tính, định lượng đồng thời 2 hoạt chất trên. Hiện nay, trên thế giới đã đưa ra một số phương pháp định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất trên bằng HPLC, UPLC-MS [51], [69].
- Bài báo “Xác định đồng thời 5 hoạt chất ưa nước và kỵ nước được chiết xuất từ rễ cây Đan sâm bằng HPLC” (Lu LL et all, 2015). Hàm lượng các hoạt chất (aldehyd protocatechuic, acid salvianolic B, tanshinon IIA, cryptotanshinone, danshensu) được định lượng ở bước sóng 281 nm, rửa giải bằng gradient nồng độ với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9990 trong một khoảng nồng độ tương đối rộng [69]. - Bài báo “Định lượng đồng thời các hợp chất đã chọn từ các loại thảo mộc Salvia bằng phương pháp HPLC và ứng dụng của chúng” (Hai-Ting Cheng et al, 2012). Hàm lượng các hoạt chất (danshensu, aldehyd protocatechuic, acid rosemarinic, acid salvianolic B, dihydrotanshinon I, tanshinon I, cryptotanshinon và tanshinon IIA) được định lượng ở bước sóng 254 nm, 281 nm, 330 nm với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9994 trong một khoảng nồng độ tương đối rộng [51].
4 - Bài báo “Định lượng đồng thời 6 thành phần trong cốm “Jiang-Zhi” bằng phương pháp UPLC –MS”. Hàm lượng các hoạt chất (acid salvianolic B, tanshinon IIA, danshensu, emodin, acid chlorogenlc, nulferin) đã được xác định với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9992 trên các khoảng nồng độ khảo sát [68]. - Đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Đan sâm” (Nguyễn Lan Hương, 2021) đã định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất acid Sal-B và Tan-IIA bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 270 nm với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9995 trên các khoảng nồng độ khảo sát [14]. Tổng quan về lipid máu 1.
Khái niệm về lipid máu Lipid máu là những phân tử kỵ nước, khó tan trong nước. Lipid được tìm thấy trong màng tế bào, duy trì tính nguyên vẹn của tế bào và cho phép tế bào chất chia thành các ngăn tạo nên những cơ quan riêng biệt. Lipid là tiền thân của một số hormon và acid mật là chất truyền tín hiệu ngoại bào và nội bào [5]. Lipid trong cơ thể gồm có: mô mỡ trung tính tức triglycerid, các phospholid, cholesterol và các acid bé tự do.
- Cholesterol là một alcol vòng không no, là thành phần tham gia cấu tạo màng tế bào. - Triglycerid cấu tạo gồm một phân tử glycerol và 3 acid béo, có 3 chức năng chính là: tạo nên mỡ trung tính dưới dạng dự trữ và cung cấp năng lượng, cách nhiệt, là lớp đệm để bảo vệ các cơ quan trong cơ thể. - Phospholipid là một phức hợp có nhiều dạng, có nhiều chức năng đặc hiệu như: truyền tin trong tế bào, chất làm căng bề mặt, tham gia cấu tạo màng tế bào. - Acid béo là những chuỗi cacbon có mạch thẳng được chia thành 2 nhóm chính: acid béo bão hòa và acid béo không bão hòa [2], [5].
Lipid không tan trong nước, không tan trong máu, vì vậy phải kết hợp với protein nhờ liên kết Vander - Walls để tạo thành lipoprotein. Nhờ tạo thành lipoprotein nên các lipid tan được trong nước và vận chuyển đến các mô [5]. Phân loại Các loại lipid máu theo kích thước: - Chilomicron vi dưỡng chấp chứa triglycerid - VLDL (very low density lipoprotein) - LDL (low density lipoprotein) - HDL (high density lipoprotein) [5]. Con đường chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể Lipid là nguồn cung cấp năng lượng chính cho cơ thể, tham gia cung cấp 25% - 30% năng lượng cơ thể.
1g lipid cung cấp đến 9,1 kcal. Lipid là nguồn năng lượng dự trữ lớn nhất trong cơ thể, dạng dự trữ là mỡ trung tính triglycerid tại mô mỡ. Bình thường khối lượng mỡ thay đổi theo tuổi, giới và chủng tộc [5]. Quá trình chuyển hóa lipid theo hai chu trình ngoại sinh và nội sinh (Hình 1.2), khi hai chu trình này diễn ra bình thường thì sẽ không xảy ra tình trạng rối loạn lipid máu.
Trường hợp các yếu tố tạo nên 2 chu trình này bị tác động gây dư thừa hoặc thiếu sẽ gây rối loạn lipid máu [18]. Chuyển hoá lipoprotein nội và ngoại sinh LPL: lipoprotein lipase; FFA: free fatty acids; VLDL: very low density lipoproteins; IDL: intermediate density lipoproteins; LDL: low density lipoproteins; LDLR: low-density lipoprotein receptor.