Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật là một trong những thách thức nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng và an toàn chuỗi cung ứng thực phẩm toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm thế giới ghi nhận khoảng 600 triệu ca ngộ độc thực phẩm, khiến 420.000 người tử vong, trong đó ngộ độc do vi sinh vật chiếm tới 66%. Tại Việt Nam, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cùng tập quán tiêu thụ nhiều sản phẩm chế biến từ tinh bột, gạo, ngũ cốc tạo môi trường thuận lợi cho vi khuẩn Bacillus cereus phát triển và sinh độc tố. Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương có khả năng tạo nội bào tử bền nhiệt, tồn tại qua quá trình nấu nướng thông thường và có thể gây ra hai dạng ngộ độc chính: dạng nôn ói (do độc tố cereulide bền nhiệt và bền acid) và dạng tiêu chảy (do độc tố ruột bản chất protein).

Phương pháp kiểm nghiệm truyền thống theo TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) sử dụng môi trường chọn lọc Mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) đòi hỏi thời gian nuôi cấy và khẳng định kéo dài từ 3 đến 5 ngày. Đồng thời, đĩa thạch MYP thường gặp hiện tượng khuẩn lạc lan rộng dính chùm, khó đếm, và bị che lấp bởi hệ vi sinh vật nền phong phú. Nhằm rút ngắn thời gian phân tích, môi trường thạch sinh màu RAPID’B.cereus (Bio-Rad) được phát triển để định lượng nhanh Bacillus cereus trong vòng 21 - 24 giờ ở 30°C mà không cần trải qua các bước khẳng định sinh hóa phức tạp. Tuy nhiên, để đưa vào ứng dụng chính thức tại các phòng kiểm nghiệm, môi trường mới cần phải được xác nhận giá trị sử dụng và đánh giá hiệu năng theo các tiêu chuẩn thẩm định hiện hành.

Khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Xác định mức độ nhiễm Bacillus cereus của các nhóm thực phẩm lưu thông trên thị trường.
  2. Đánh giá hiệu năng môi trường thạch tạo màu RAPID’B.cereus về độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu.
  3. Nghiên cứu độ đúng tương đối để so sánh kết quả phân tích thu được giữa môi trường chuẩn (MYP) và môi trường mới (RAPID’B.cereus) trên các nền mẫu thực tế, xác định các nền mẫu phù hợp.
  4. Nghiên cứu độ chính xác nhằm đánh giá kết hợp độ chụm và độ đúng của môi trường chuẩn và môi trường thay thế.

Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Bacillus cereus hiện diện trong các mẫu thực phẩm thuộc 5 nhóm nền mẫu: Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc; Bột và tinh bột; Rau củ và sản phẩm từ rau củ; Sữa và sản phẩm từ sữa; Bánh mứt kẹo. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh thuộc Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM (CASE) trong thời gian từ tháng 02/2023 đến tháng 06/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên các tiêu chuẩn phương pháp luận và quy chuẩn kỹ thuật:

  • TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch ở 30°C (phương pháp chuẩn, sử dụng môi trường MYP và thử nghiệm khẳng định tan máu trên thạch máu Blood Agar).
  • TCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016): Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Thẩm định phương pháp – Phần 2: Giao thức thẩm định các phương pháp thay thế so với phương pháp chuẩn.
  • Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế: Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm đối với chỉ tiêu Bacillus cereus.

Phương pháp thực nghiệm được triển khai theo các quy trình chuẩn hóa:

  • Phương pháp vi sinh thực nghiệm: Nuôi cấy trải đĩa thạch đếm khuẩn lạc; ủ mẫu ở 30°C $\pm$ 1°C trong 21 - 48 giờ; quan sát hình thái khuẩn lạc đặc trưng (trên MYP: khuẩn lạc màu hồng có vòng tủa mờ đục; trên RAPID’B.cereus: khuẩn lạc màu đỏ có hoặc không có quầng mờ xung quanh).
  • Đánh giá hiệu năng môi trường:
    • Độ phát triển ($P_R$): Xác định tỷ lệ thu hồi khuẩn lạc của chủng chuẩn Bacillus cereus ATCC 11778 giữa môi trường thử nghiệm và môi trường tham chiếu không chọn lọc Tryptone Soya Agar (TSA), yêu cầu $P_R \ge 0,5$.
    • Độ chọn lọc và độ đặc hiệu: Khảo sát mức độ ức chế đối với chủng chứng âm Escherichia coli ATCC 25922 (độ chọn lọc) và Bacillus subtilis ATCC 6633 (độ đặc hiệu).
  • Nghiên cứu độ đúng tương đối (Relative Trueness): Phân tích dữ liệu định lượng trên 124 mẫu thực phẩm nhiễm tự nhiên bằng đồ thị phân tán và phương pháp đồ thị chênh lệch Bland-Altman, tính toán chênh lệch trung bình ($\bar{D}$), độ lệch chuẩn ($s_D$) và khoảng giới hạn tin cậy 95% (CL).
  • Nghiên cứu độ chính xác (Accuracy Profile): Tiến hành gây nhiễm nhân tạo trên 5 nhóm mẫu ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) với 5 lần lặp lại cho mỗi mức, tính toán độ chệch ($B_i$), khoảng dung sai dự kiến $\beta$-ETI ($\beta = 80%$) và so sánh với giới hạn chấp nhận $AL = \pm 0,5 \log_{10}$.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu bao gồm 164 mẫu thực phẩm thương mại do khách hàng gửi phân tích tại CASE và các chủng vi sinh vật đối chứng chuẩn gồm Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis ATCC 6633 và Escherichia coli ATCC 25922 lưu trữ tại phòng Vi sinh - CASE.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương này làm rõ tính cấp thiết của việc kiểm soát ô nhiễm Bacillus cereus trong thực phẩm tại Việt Nam. Tác giả chỉ ra rằng phương pháp chuẩn hiện hành theo TCVN 4992:2005 đòi hỏi quy trình trải đĩa trên môi trường MYP và bước thử nghiệm khẳng định sinh hóa (phản ứng tan máu $\beta$ trên môi trường Blood Agar) mất từ 3 đến 5 ngày, làm chậm tiến độ kiểm nghiệm và giải phóng lô hàng của doanh nghiệp. Nhu cầu ứng dụng môi trường sinh màu mới RAPID’B.cereus (Bio-Rad) cho phép đọc kết quả sau 21 - 24 giờ mà không cần bước khẳng định sinh hóa là rất lớn. Do đó, việc thực hiện đề tài nhằm thẩm định lại toàn diện các chỉ số kỹ thuật của môi trường mới theo chuẩn mực ISO 16140-2:2016 là điều kiện tiên quyết trước khi áp dụng vào thực tế kiểm nghiệm.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 hệ thống hóa cơ sở lý luận về vệ sinh an toàn thực phẩm, đặc điểm sinh học và các phương pháp kiểm nghiệm Bacillus cereus:

  • Đặc điểm vi sinh vật: Bacillus cereus thuộc họ Bacillaceae, là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,5 - 1,5 $\times$ 2 - 4 $\mu$m, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt (chỉ bị tiêu diệt ở 121°C trong 20 phút hoặc sấy khô 160°C trong 1 giờ).
  • Cơ chế gây bệnh: Vi khuẩn tiết ra độc tố gây tiêu chảy (protein phân hủy tại ruột) và độc tố gây nôn (cereulide cấu trúc peptide vòng, chịu được nhiệt độ cao và pH acid của dạ dày). Mật độ vi khuẩn từ $10^5$ CFU/g trở lên trong thực phẩm đủ khả năng gây ngộ độc cấp tính.
  • Tổng quan các phương pháp phát hiện: Phân tích ưu nhược điểm của các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống (MYP, PEMBA), kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, real-time PCR, kết hợp PMA/PMAxx để loại bỏ DNA tế bào chết), kỹ thuật miễn dịch và hóa lý (ELISA, LC-MS/MS, FTIR, MALDI-TOF) và công nghệ môi trường thạch sinh màu (sử dụng cơ chất enzyme phosphatidylinositol phospholipase C - PI-PLC và $\beta$-D-glucosidase kết hợp kháng sinh ức chế chọn lọc).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 3 trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất, chủng giống vi sinh và các bước thực nghiệm:

  • Thiết bị: Tủ an toàn sinh học (ESCO), nồi hấp tiệt trùng (HIRAYAMA), tủ ấm (LABTECH, ESCO), máy dập mẫu Stomacher 80 Biomaster.
  • Hóa chất và môi trường: Môi trường MYP (Merck, Cat#105267), RAPID’B.cereus (Bio-Rad), nước đệm pha loãng MRD, thạch TSA, thạch máu BA.
  • Quy trình định lượng: Chuẩn bị dung dịch mẫu $10^{-1}$ bằng cách đồng nhất 10 g mẫu với 90 mL MRD; pha loãng bậc 10; cấy gạt 1 mL (hoặc 100 $\mu$L đối với mẫu lỏng) lên bề mặt đĩa thạch; ủ ở 30°C trong 24 $\pm$ 3 giờ; đếm khuẩn lạc đặc trưng và tính mật độ CFU/g hoặc CFU/mL theo công thức chuẩn.
  • Quy trình thẩm định: Thiết kế các bước kiểm tra độ phát triển ($P_R$), độ chọn lọc ($S_R$), độ đặc hiệu trực quan, độ đúng tương đối trên 124 mẫu nhiễm tự nhiên chia làm 5 nhóm, và độ chính xác trên các mẫu nhiễm nhân tạo theo chuẩn TCVN 12365-2:2018.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm qua 3 nội dung chính:

1. Mức độ nhiễm Bacillus cereus trong các nhóm thực phẩm

Khảo sát 164 mẫu thực phẩm trên môi trường chuẩn MYP ghi nhận 115 mẫu dương tính, đạt tỷ lệ nhiễm chung là 70,12%. Chi tiết tỷ lệ nhiễm và số lượng mẫu không đạt theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT được tổng hợp trong bảng sau:

STT Nhóm thực phẩm Tổng số mẫu thử Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Giới hạn BYT (CFU/g) Số mẫu không đạt chuẩn BYT
1 Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc 50 37 74,00 $10^1$ 16/37
2 Bột và tinh bột 36 27 75,00 $10^2$ 7/27
3 Rau củ và sản phẩm rau củ 31 17 54,84 $10^1$ 11/17
4 Sữa và sản phẩm từ sữa 21 16 76,19 $10^1$ 11/16
5 Bánh mứt kẹo 26 18 69,23 $10^1$ 8/18
Tổng Toàn bộ 5 nhóm 164 115 70,12 -- 53/115 (46,09%)

Mật độ nhiễm cao nhất ghi nhận được ở mẫu nhiễm tự nhiên lên đến $2,9 \times 10^4$ CFU/g.

2. Đánh giá độ phát triển, độ chọn lọc và độ đặc hiệu

  • Độ phát triển ($P_R$): Chủng Bacillus cereus ATCC 11778 trên RAPID’B.cereus đạt số đếm 125 CFU ($P_R = 0,97$), cao hơn so với MYP đạt 108 CFU ($P_R = 0,81$) khi so sánh với môi trường đối chứng TSA (133 CFU). Cả hai đều thỏa mãn tiêu chí chấp nhận ($P_R \ge 0,5$).
  • Độ chọn lọc: Chủng Escherichia coli ATCC 25922 ở nồng độ $10^4$ CFU/mL bị ức chế hoàn toàn, không mọc trên cả hai môi trường RAPID’B.cereus và MYP.
  • Độ đặc hiệu: Chủng Bacillus subtilis ATCC 6633 ở nồng độ $10^4$ CFU/mL bị ức chế hoàn toàn trên RAPID’B.cereus; trong khi trên MYP vẫn phát triển thành các khuẩn lạc màu vàng không điển hình. Trên các mẫu thực phẩm tự nhiên có hệ vi sinh vật nền cao, RAPID’B.cereus thể hiện khả năng ức chế tạp khuẩn vượt trội, khuẩn lạc B. cereus phát triển màu đỏ rõ nét, không bị hiện tượng mọc tràn lan hay che lấp như trên MYP.

3. Đánh giá độ đúng tương đối và độ chính xác theo TCVN 12365-2:2018

  • Độ đúng tương đối: Thực hiện trên 124 mẫu nhiễm tự nhiên (40 mẫu Ngũ cốc, 28 mẫu Bột, 20 mẫu Rau củ, 17 mẫu Sữa, 19 mẫu Bánh mứt kẹo). Đồ thị Bland-Altman thể hiện độ chênh lệch trung bình giữa hai phương pháp là 0,14 $\log_{10}$ CFU/g. Số lượng điểm nằm ngoài giới hạn độ tin cậy 95% không vượt quá 1/20 tổng số mẫu thử nghiệm, đáp ứng yêu cầu kỹ thuật của tiêu chuẩn thẩm định.
  • Độ chính xác: Kết quả đánh giá trên các mẫu gây nhiễm nhân tạo ở 3 mức nồng độ với 5 lần lặp lại cho thấy đường dung sai dự kiến $\beta$-ETI ($\beta = 80%$) của tất cả các nhóm nền mẫu đều nằm trọn vẹn trong khoảng giới hạn chấp nhận $AL = \pm 0,5 \log_{10}$ (hoặc nằm trong giới hạn điều chỉnh $AL_S$). Điều này khẳng định độ chính xác của môi trường sinh màu RAPID’B.cereus hoàn toàn tương đương với phương pháp chuẩn MYP.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  1. Khảo sát thực trạng cho thấy tỷ lệ nhiễm Bacillus cereus trong thực phẩm thương mại ở mức cao (70,12% trên MYP và 75,61% trên RAPID’B.cereus), trong đó có tới 46,09% số mẫu nhiễm vượt ngưỡng an toàn cho phép theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT.
  2. Xác nhận môi trường RAPID’B.cereus có hiệu năng sinh học cao: độ phát triển $P_R = 0,97$ (vượt trội so với MYP $P_R = 0,81$); ức chế hoàn toàn vi khuẩn Gram âm (E. coli) và vi khuẩn Gram dương không mục tiêu (B. subtilis); ức chế hiệu quả hệ vi sinh vật nền cạnh tranh.
  3. Chứng minh phương pháp định lượng bằng RAPID’B.cereus đạt độ đúng tương đối (độ lệch trung bình 0,14 $\log_{10}$ CFU/g) và độ chính xác tương đương với phương pháp chuẩn TCVN 4992:2005 trên toàn bộ 5 nhóm nền mẫu thực phẩm thử nghiệm.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Kiến nghị các phòng kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm áp dụng môi trường thạch sinh màu RAPID’B.cereus vào quy trình kiểm nghiệm thường quy nhằm rút ngắn thời gian phân tích từ 3 - 5 ngày xuống còn 21 - 24 giờ.
  • Khuyến nghị áp dụng quy trình không cần bước khẳng định sinh hóa tan máu đối với các khuẩn lạc đỏ điển hình trên RAPID’B.cereus, giúp giảm chi phí hóa chất, nhân công và hạn chế phơi nhiễm kháng sinh cho kiểm nghiệm viên.
  • Đề xuất tăng cường giám sát an toàn vi sinh đối với các nhóm thực phẩm giàu tinh bột và ngũ cốc lưu thông trên thị trường do tỷ lệ nhiễm vượt giới hạn cho phép còn ở mức cao.

Đóng góp về mặt khoa học và thực tiễn

Khóa luận đã cung cấp một bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện về việc xác nhận giá trị sử dụng của môi trường sinh màu RAPID’B.cereus theo chuẩn mực quốc tế ISO 16140-2:2016 (TCVN 12365-2:2018) trên các nền mẫu thực phẩm thực tế tại Việt Nam. Nghiên cứu giải quyết được các nhược điểm cố hữu của phương pháp truyền thống (khuẩn lạc mọc dính, đục đĩa, dương tính giả do vi sinh vật nền), đồng thời khẳng định độ tin cậy tương đương của phương pháp thay thế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu tập trung đánh giá trên 5 nhóm thực phẩm phổ biến (164 mẫu) tại một trung tâm kiểm nghiệm (CASE); số lượng chủng vi sinh vật đối chứng âm để kiểm tra độ chọn lọc và độ đặc hiệu còn hạn chế ở 2 chủng chuẩn đại diện (E. coli ATCC 25922 và B. subtilis ATCC 6633) theo đề xuất CoA của nhà sản xuất.
  • Hướng mở rộng: Mở rộng khảo sát thẩm định trên các nền mẫu thực phẩm phức tạp khác (thực phẩm lên men, gia vị, thủy hải sản); kiểm tra độ đặc hiệu với nhiều loài khác thuộc chi Bacillus (như Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides); tiến hành thử nghiệm liên phòng thí nghiệm (inter-laboratory study) để hoàn thiện hồ sơ chuẩn hóa phương pháp thay thế trên quy mô toàn quốc.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo chuyên môn giá trị cho:

  • Sinh viên và học viên cao học thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Đảm bảo chất lượng và An toàn thực phẩm trong việc xây dựng đề cương và thực hiện các đề tài thẩm định phương pháp vi sinh.
  • Kiểm nghiệm viên và quản lý phòng thí nghiệm vi sinh tại các trung tâm phân tích (CASE, Quatest, Viện Vệ sinh Y tế Công cộng) tham khảo quy trình triển khai chi tiết các thông số ISO 16140-2:2016 (độ phát triển, độ chọn lọc, độ đúng Bland-Altman, độ chính xác Accuracy Profile).
  • Phần đáng tham khảo nhất: Chương 3 và Chương 4 với các công thức tính toán toán học - thống kê cho giao thức thẩm định phương pháp thay thế và bảng số liệu định lượng chi tiết trên 5 nhóm nền mẫu thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Môi trường sinh màu RAPID’B.cereus nhận diện khuẩn lạc Bacillus cereus dựa trên đặc điểm hình thái và cơ chế sinh học nào?
Khuẩn lạc Bacillus cereus điển hình trên môi trường RAPID’B.cereus có màu đỏ đặc trưng, được bao quanh bởi một quầng sáng mờ đục (hoặc không có quầng sáng trong một số ít trường hợp). Cơ chế dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất tạo màu đặc hiệu bởi enzyme của vi khuẩn và hoạt tính enzyme phospholipase C (PI-PLC).

2. Tiêu chí đánh giá độ phát triển ($P_R$) của môi trường nuôi cấy được tính toán như thế nào và kết quả của hai môi trường ra sao?
Độ phát triển được tính bằng công thức $P_R = N_s / N_o$, trong đó $N_s$ là tổng số khuẩn lạc trên môi trường kiểm tra và $N_o$ là tổng số khuẩn lạc trên môi trường tham chiếu không chọn lọc (TSA). Tiêu chí chấp nhận là $P_R \ge 0,5$. Kết quả thực nghiệm với chủng B. cereus ATCC 11778 cho thấy RAPID’B.cereus đạt $P_R = 0,97$ (125/133 CFU), cao hơn môi trường MYP đạt $P_R = 0,81$ (108/133 CFU).

3. Tại sao môi trường RAPID’B.cereus lại hạn chế được hiện tượng dương tính giả so với môi trường MYP khi kiểm tra độ đặc hiệu với Bacillus subtilis?
Trên môi trường MYP, chủng chứng âm Bacillus subtilis ATCC 6633 vẫn có thể mọc và tạo thành các khuẩn lạc màu vàng không điển hình, dễ gây nhầm lẫn hoặc che lấp khuẩn lạc mục tiêu khi mật độ cao. Ngược lại, trên môi trường RAPID’B.cereus, Bacillus subtilis bị ức chế hoàn toàn, không xuất hiện khuẩn lạc.

4. Nghiên cứu sử dụng tiêu chuẩn nào để thẩm định phương pháp thay thế và kết quả độ đúng tương đối giữa hai phương pháp đạt bao nhiêu?
Nghiên cứu áp dụng tiêu chuẩn TCVN 12365-2:2018 (tương đương ISO 16140-2:2016) bằng phân tích đồ thị Bland-Altman trên 124 mẫu thực phẩm. Kết quả cho thấy độ chênh lệch trung bình giữa phương pháp sử dụng RAPID’B.cereus và phương pháp chuẩn MYP là 0,14 $\log_{10}$ CFU/g, đa số các điểm phân bố nằm trong giới hạn tin cậy 95% (CL).

5. Tỷ lệ nhiễm Bacillus cereus không đạt theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT trong nghiên cứu là bao nhiêu và nhóm thực phẩm nào có tỷ lệ nhiễm cao nhất?
Trong tổng số 115 mẫu thực phẩm nhiễm tự nhiên, có 53 mẫu không đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế, chiếm tỷ lệ 46,09%. Nhóm Sữa và sản phẩm từ sữa có tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất (76,19%), tiếp theo là Bột và tinh bột (75,00%), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc (74,00%).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Võ Thị Như Bích đã đánh giá toàn diện khả năng phát hiện và định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm của môi trường sinh màu RAPID’B.cereus so với phương pháp chuẩn MYP theo TCVN 4992:2005. Dữ liệu thực nghiệm trên 164 mẫu thực phẩm thương mại và các chủng chuẩn đã chứng minh môi trường mới đạt đầy đủ các tiêu chí thẩm định về độ phát triển, độ chọn lọc, độ đặc hiệu, độ đúng tương đối và độ chính xác theo TCVN 12365-2:2018 (ISO 16140-2:2016). Việc ứng dụng môi trường RAPID’B.cereus cho phép rút ngắn thời gian kiểm nghiệm xuống còn 21 - 24 giờ, giảm thiểu thao tác sinh hóa khẳng định và nâng cao độ chính xác trong công tác kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm.