Luận văn nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm

Nghiên cứu chiết xuất enzyme lumbrokinase từ giun quế, tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm chức năng và đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Trang
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn A
• Trường học: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Lumbrokinase từ Giun Quế: Tiềm năng Tạo Thực Phẩm Chức Năng & An Toàn Vi Sinh
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. HỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO
• 1.1.1. Sơ lược về hội chứng tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân bệnh tắc nghẽn mạch máu
• 1.1.3. Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch
• 1.1.4. Huyết khối động mạch do xơ vữa
• 1.2. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối
• 1.3. Một số thuốc điều trị huyết khối
• 1.3.1. Các thuốc có bản chất hóa học
• 1.3.2. Các thuốc có bản chất enzyme
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE
• 1.4.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới
• 1.4.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI
• 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 2.1.1. Các dung dịch và đệm
• 2.1.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
• 2.1.3. Chủng vi sinh vật
• 2.1.4. Máy móc và thiết bị
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô
• 2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase
• 2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin
• 2.2.4. Xác định hàm lượng protein
• 2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein
• 2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide
• 2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn
• 2.2.8. Định danh vi khuẩn bằng Kit API 20 E
• 2.2.9. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX ESCAVATUS
• 3.2. NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE
• 3.2.1. Tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ
• 3.2.2. Tủa phân đoạn bằng kết tủa muối amonium sulphate
• 3.2.3. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel
• 3.2.4. Thử hoạt tính thủy phân casein
• 3.3. KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN KHÁC NHAU
• 3.3.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm
• 3.3.2. Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật
• 3.3.3. Tìm vi khuẩn gây bệnh
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1
• PHỤ LỤC 2
• PHỤ LỤC 3
• PHỤ LỤC 4
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

Tóm tắt

I. Tổng quan về Lumbrokinase

Lumbrokinase là một enzyme được chiết xuất từ giun quế, có khả năng thủy phân fibrin, giúp làm tan cục máu đông. Enzyme này được nghiên cứu và phát triển như một phương pháp điều trị hiệu quả cho các bệnh liên quan đến huyết khối. Theo Mihara và cộng sự (1991), lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin cao, cho phép nó hoạt động hiệu quả trong việc điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu. Lumbrokinase không chỉ có tác dụng trực tiếp lên fibrin mà còn có khả năng hoạt hóa plasminogen thành plasmin, từ đó tăng cường hiệu quả điều trị. Điều này làm cho lumbrokinase trở thành một lựa chọn an toàn và hiệu quả hơn so với các thuốc điều trị huyết khối thông thường.

1.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của Lumbrokinase

Cấu trúc của lumbrokinase rất phức tạp, với nhiều izozyme khác nhau, mỗi izozyme có hoạt tính và đặc tính riêng. Cơ chế hoạt động của enzyme này liên quan đến việc thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông. Lumbrokinase hoạt động bằng cách cắt đứt các liên kết trong cấu trúc fibrin, từ đó làm giảm độ bền của cục máu đông. Nghiên cứu cho thấy rằng lumbrokinase có thể hoạt động hiệu quả trong môi trường sinh lý, giúp tăng cường khả năng hấp thu qua đường tiêu hóa và vào máu. Điều này cho phép lumbrokinase được sử dụng như một loại thuốc uống, mang lại sự tiện lợi cho người bệnh.

II. Tiềm năng ứng dụng của Lumbrokinase trong thực phẩm chức năng

Lumbrokinase không chỉ được nghiên cứu trong lĩnh vực y học mà còn có tiềm năng lớn trong việc phát triển thực phẩm chức năng. Với khả năng làm tan cục máu đông, lumbrokinase có thể được sử dụng để tạo ra các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe, đặc biệt là cho những người có nguy cơ cao mắc các bệnh tim mạch. Việc phát triển thực phẩm chức năng từ lumbrokinase có thể giúp cải thiện sức khỏe tim mạch, giảm nguy cơ huyết khối và tăng cường sức đề kháng. Các sản phẩm này có thể được chế biến dưới dạng viên nang, bột hoặc nước uống, mang lại sự tiện lợi cho người tiêu dùng.

2.1. Lợi ích dinh dưỡng và sức khỏe

Lumbrokinase không chỉ có tác dụng làm tan cục máu đông mà còn cung cấp nhiều lợi ích dinh dưỡng khác. Enzyme này có thể giúp cải thiện tuần hoàn máu, tăng cường sức khỏe tim mạch và hỗ trợ quá trình tiêu hóa. Nghiên cứu cho thấy rằng việc bổ sung lumbrokinase vào chế độ ăn uống có thể giúp giảm cholesterol xấu và tăng cholesterol tốt, từ đó cải thiện sức khỏe tổng thể. Hơn nữa, lumbrokinase còn có khả năng hỗ trợ hệ miễn dịch, giúp cơ thể chống lại các bệnh tật hiệu quả hơn.

III. An toàn vi sinh trong sản phẩm chứa Lumbrokinase

An toàn vi sinh là một yếu tố quan trọng trong việc phát triển sản phẩm chứa lumbrokinase. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lumbrokinase có thể được sản xuất trong điều kiện kiểm soát vi sinh, đảm bảo rằng sản phẩm cuối cùng không bị nhiễm khuẩn. Việc kiểm tra và xác định mức độ vi sinh vật trong sản phẩm là cần thiết để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Các phương pháp như thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn và định danh vi khuẩn bằng kit API 20 E đã được áp dụng để đảm bảo rằng sản phẩm chứa lumbrokinase đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm.

3.1. Các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm

Để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng, các sản phẩm chứa lumbrokinase cần tuân thủ các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm nghiêm ngặt. Điều này bao gồm việc kiểm tra hàm lượng vi sinh vật, xác định các chất gây ô nhiễm và đảm bảo rằng sản phẩm không chứa các thành phần độc hại. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lumbrokinase có thể được sản xuất trong điều kiện an toàn, với mức độ vi sinh vật nằm trong giới hạn cho phép. Điều này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn nâng cao giá trị thương mại của sản phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Rối loạn tim mạch và mạch máu não là nguyên nhân gây khoảng 26 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn cầu, trong đó bệnh tắc nghẽn mạch máu chiếm tỷ lệ cao và gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch não và huyết khối tĩnh mạch. Tại Việt Nam, khoảng 16% dân số mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ, với tỷ lệ tử vong lên đến 24% và 50% bệnh nhân sống sót nhưng chịu di chứng nặng nề. Nguyên nhân chủ yếu là do cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu, làm gián đoạn lưu thông máu. Việc làm tan cục máu đông trở thành mục tiêu quan trọng trong điều trị các bệnh lý này.

Hiện nay, các thuốc tan huyết khối chủ yếu nhập khẩu, có dạng tiêm, giá thành cao và nhiều tác dụng phụ, gây khó khăn cho người bệnh. Enzyme lumbrokinase, chiết xuất từ giun đất, được phát hiện có khả năng thủy phân fibrin mạnh mẽ, làm tan cục máu đông một cách đặc hiệu và an toàn, có thể sử dụng đường uống. Lumbrokinase vừa thủy phân trực tiếp fibrin, vừa kích hoạt plasminogen thành plasmin, mang lại hiệu quả kép trong điều trị huyết khối.

Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu này tập trung vào việc tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế Perionyx escavatus làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng, đồng thời đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm. Mục tiêu cụ thể gồm: (1) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch enzyme lumbrokinase; (2) xác định các chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm lumbrokinase nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn. Nghiên cứu được thực hiện tại Việt Nam, trong điều kiện phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP, ISO/IEC 17025 và tiền đánh giá của WHO, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế đông máu và tan huyết khối: Quá trình đông máu gồm ba giai đoạn chính: hình thành phức hợp prothrombinase, chuyển prothrombin thành thrombin, và tạo mạng lưới fibrin từ fibrinogen. Tan huyết khối diễn ra qua hai cơ chế: thủy phân fibrin trực tiếp và hoạt hóa plasminogen thành plasmin để phân hủy fibrin. Lumbrokinase có khả năng thực hiện cả hai cơ chế này, giúp làm tan cục máu đông hiệu quả và an toàn.

• Đặc tính enzyme lumbrokinase: Là nhóm gồm 6 isozyme serine protease kiềm, có khối lượng phân tử từ 25 đến 32 kDa, giàu asparagine và aspartic acid. Lumbrokinase có khả năng thủy phân fibrin mạnh, ổn định trong khoảng pH rộng (4-12) và nhiệt độ lên đến 50°C, đồng thời có thể hấp thu qua đường ruột vào máu, phù hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc uống.

• Mô hình tinh sạch enzyme: Sử dụng các phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ (acetone, ethanol, butanol, methanol), kết tủa muối amonium sulphate, sắc ký lọc gel Sephadex G100 và cột cut-off để phân tách và tinh sạch enzyme dựa trên kích thước phân tử và tính chất hòa tan.

• Chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm: Áp dụng các tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam 5 và các tiêu chuẩn ISO để xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi nấm men, vi khuẩn Gram âm dung nạp mật, và định danh các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu chính là giun quế Perionyx escavatus thu mua từ trang trại tại Hà Nội. Enzyme lumbrokinase được chiết xuất từ dịch nghiền giun quế đã được làm sạch. Các hóa chất, môi trường nuôi cấy vi sinh vật và thiết bị hiện đại được sử dụng trong phòng thí nghiệm đạt chuẩn GLP, ISO/IEC 17025.

• Phương pháp phân tích:

  • Tinh sạch enzyme qua các bước: kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ và muối amonium sulphate, thẩm tích loại muối, sắc ký lọc gel Sephadex G100, cột cut-off 10 kDa và 50 kDa.
  • Xác định hoạt tính thủy phân fibrin bằng phương pháp đĩa fibrin, so sánh với chuẩn plasmin.
  • Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.
  • Xác định hoạt tính thủy phân casein theo phương pháp Anson cải tiến.
  • Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide SDS-PAGE để đánh giá độ tinh sạch.
  • Thử giới hạn nhiễm khuẩn theo Dược điển Việt Nam 5, bao gồm đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí, vi nấm, vi khuẩn Gram âm dung nạp mật và định danh vi khuẩn gây bệnh bằng kit API 20E.

• Timeline nghiên cứu:

  • Thu thập và chuẩn bị mẫu enzyme thô: 1 tháng.
  • Thực hiện các phương pháp tinh sạch enzyme: 3 tháng.
  • Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein: song song trong 3 tháng.
  • Kiểm tra vi sinh vật và thử giới hạn nhiễm khuẩn: 2 tháng.
  • Phân tích dữ liệu và hoàn thiện báo cáo: 1 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu:
   Giun quế Perionyx escavatus được làm sạch kỹ lưỡng, dịch nghiền thu được có hoạt tính thủy phân fibrin cao đạt khoảng 1250 IU/ml, đảm bảo nguồn enzyme thô chất lượng cho các bước tinh sạch tiếp theo.

2. Hiệu quả các phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ:

   • Acetone và ethanol thu được mẫu enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin đạt khoảng 908 IU/ml, tương đương 73% hiệu suất so với dịch thô ban đầu.
   • Butanol và methanol cho hiệu suất thấp hơn, lần lượt 45,4% và 65,1%.
   • Điện di SDS-PAGE cho thấy các băng protein chính tập trung trong khoảng 25-45 kDa, rõ nét nhất ở 35 kDa, đặc biệt với acetone và ethanol.

3. Kết quả kết tủa muối amonium sulphate:

   • Ở nồng độ 50% muối, enzyme thu được có hàm lượng protein cao nhất 0,073 mg/ml và hoạt tính thủy phân fibrin đạt 4997 IU/ml, gấp 4 lần so với dịch thô ban đầu.
   • Các nồng độ 40%, 60%, 70% cũng cho hoạt tính cao nhưng thấp hơn 50%.
   • Điện di SDS-PAGE xác nhận sự xuất hiện rõ các băng protein kích thước 25-45 kDa, phù hợp với enzyme lumbrokinase.

4. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Sephadex G100:

   • Sau khi tủa muối amonium sulphate 50%, dịch enzyme được tinh sạch qua cột Sephadex G100 thu được 24 phân đoạn.
   • Các phân đoạn có hoạt tính thủy phân fibrin cao được xác định và tiếp tục tinh sạch bằng cột cut-off.

5. Kiểm tra vi sinh vật trong sản phẩm:

   • Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm men trong sản phẩm sau bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4°C đều nằm trong giới hạn cho phép của Dược điển Việt Nam 5.
   • Không phát hiện vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella trong các mẫu thử.
   • Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật có mặt ở mức rất thấp, không vượt quá ngưỡng an toàn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp kết tủa muối amonium sulphate ở nồng độ 50% là hiệu quả nhất trong việc thu nhận enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin cao, gấp 4 lần so với enzyme thô ban đầu. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về tinh sạch enzyme từ giun đất, đồng thời điện di SDS-PAGE xác nhận độ tinh sạch và kích thước phân tử phù hợp với lumbrokinase.

Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ cho thấy acetone và ethanol là dung môi thích hợp hơn butanol và methanol, tuy nhiên hiệu suất thấp hơn so với muối amonium sulphate. Việc sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G100 giúp phân tách các phân đoạn enzyme có hoạt tính cao, tạo điều kiện cho việc tinh sạch sâu hơn.

Kiểm tra vi sinh vật cho thấy sản phẩm lumbrokinase đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh, không chứa các vi khuẩn gây bệnh, đảm bảo chất lượng và an toàn cho người sử dụng. Kết quả này có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme và hàm lượng protein ở các bước tinh sạch, cũng như bảng tổng hợp số liệu vi sinh vật trong sản phẩm.

So với các nghiên cứu trong và ngoài nước, nghiên cứu này đã hoàn thiện quy trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế Perionyx escavatus, đồng thời đánh giá đầy đủ các chỉ tiêu vi sinh vật, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng quy trình tinh sạch muối amonium sulphate 50% kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G100 để sản xuất enzyme lumbrokinase chất lượng cao, nâng cao hoạt tính thủy phân fibrin, đảm bảo hiệu quả điều trị. Thời gian triển khai: 6-12 tháng; chủ thể thực hiện: các nhà sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng.

2. Xây dựng hệ thống kiểm soát chất lượng vi sinh vật nghiêm ngặt theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 5 trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm lumbrokinase, nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Thời gian: liên tục; chủ thể: phòng kiểm nghiệm và nhà máy sản xuất.

3. Nghiên cứu mở rộng về ổn định enzyme lumbrokinase trong các điều kiện bảo quản khác nhau để tối ưu hóa thời gian sử dụng và bảo quản sản phẩm, giảm thiểu mất hoạt tính enzyme. Thời gian: 12 tháng; chủ thể: viện nghiên cứu và doanh nghiệp.

4. Phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng chứa lumbrokinase dạng uống tiện lợi, giá thành hợp lý nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh huyết khối tại Việt Nam và các nước đang phát triển. Thời gian: 18-24 tháng; chủ thể: doanh nghiệp dược phẩm, trung tâm nghiên cứu phát triển sản phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, dược học:

   • Lợi ích: Hiểu rõ quy trình tinh sạch enzyme lumbrokinase, phương pháp đánh giá hoạt tính và kiểm soát chất lượng vi sinh vật.
   • Use case: Áp dụng trong nghiên cứu phát triển enzyme và sản phẩm sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng:

   • Lợi ích: Áp dụng quy trình tinh sạch enzyme hiệu quả, đảm bảo chất lượng sản phẩm, nâng cao giá trị cạnh tranh.
   • Use case: Sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối.

3. Cơ quan quản lý chất lượng và kiểm nghiệm dược phẩm:

   • Lợi ích: Tham khảo tiêu chuẩn kiểm soát vi sinh vật trong sản phẩm enzyme, nâng cao hiệu quả giám sát.
   • Use case: Xây dựng quy trình kiểm nghiệm và cấp phép sản phẩm.

4. Bác sĩ và chuyên gia y tế trong lĩnh vực tim mạch:

   • Lợi ích: Hiểu về cơ chế hoạt động và hiệu quả của enzyme lumbrokinase trong điều trị huyết khối.
   • Use case: Tư vấn và lựa chọn sản phẩm hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân.

Câu hỏi thường gặp

1. Lumbrokinase là gì và có tác dụng như thế nào trong điều trị huyết khối?
   Lumbrokinase là một nhóm enzyme serine protease chiết xuất từ giun đất, có khả năng thủy phân fibrin trực tiếp và kích hoạt plasminogen thành plasmin, giúp làm tan cục máu đông hiệu quả và an toàn. Ví dụ, enzyme này có thể hấp thu qua đường ruột và hoạt động trong máu, phù hợp dùng đường uống.

2. Phương pháp tinh sạch enzyme lumbrokinase nào hiệu quả nhất?
   Kết tủa muối amonium sulphate ở nồng độ 50% kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G100 được chứng minh là phương pháp hiệu quả nhất, thu được enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin gấp 4 lần so với enzyme thô ban đầu.

3. Sản phẩm lumbrokinase có an toàn về mặt vi sinh vật không?
   Sản phẩm sau tinh sạch và bảo quản được kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 5, không phát hiện vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, và tổng số vi sinh vật hiếu khí, vi nấm men đều nằm trong giới hạn cho phép.

4. Lumbrokinase có thể sử dụng thay thế các thuốc tan huyết khối hiện nay không?
   Lumbrokinase có ưu điểm là dùng đường uống, ít tác dụng phụ và hiệu quả cao nhờ cơ chế kép thủy phân fibrin trực tiếp và hoạt hóa plasminogen, có thể là lựa chọn thay thế hoặc bổ sung cho các thuốc tan huyết khối truyền thống như t-PA, urokinase.

5. Làm thế nào để bảo quản enzyme lumbrokinase giữ được hoạt tính lâu dài?
   Nghiên cứu đề xuất bảo quản enzyme ở nhiệt độ thấp (4°C) và tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao hoặc ánh sáng trực tiếp để duy trì hoạt tính. Cần nghiên cứu thêm về ổn định enzyme trong các điều kiện bảo quản khác nhau để tối ưu hóa thời gian sử dụng.

Kết luận

• Đã phát triển thành công quy trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế Perionyx escavatus với hoạt tính thủy phân fibrin tăng gấp 4 lần so với enzyme thô.
• Phương pháp kết tủa muối amonium sulphate 50% kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G100 là hiệu quả nhất trong việc thu nhận enzyme tinh khiết.
• Sản phẩm lumbrokinase đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh vật theo Dược điển Việt Nam 5, không chứa vi khuẩn gây bệnh.
• Nghiên cứu góp phần nâng cao chất lượng và độ an toàn của sản phẩm enzyme lumbrokinase, phục vụ sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu ổn định enzyme và phát triển sản phẩm dạng uống tiện lợi, giá thành hợp lý trong vòng 1-2 năm tới.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích áp dụng quy trình tinh sạch và kiểm soát chất lượng này để phát triển sản phẩm lumbrokinase chất lượng cao, góp phần cải thiện sức khỏe cộng đồng trong lĩnh vực tim mạch và huyết khối.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. H ỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO 1. Sơ lược về hội chứng tắc nghẽn mạch máu Hội chứng tắc nghẽn mạch máu (huyết khối) gây ra rối loạn tim mạch và tai biến mạch máu não là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Liên đoàn tim mạch thế giới đưa ra thống kê cứ ba người thì có một người tử vong trong đó có một người tử vong vì bệnh tim mạch.

Ở Mỹ cứ 29 giây có một người bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một người tử vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong, phí tổn do bệnh này chiếm 128 tỉ USD mỗi năm. Theo thống kê của Hội Đột quỵ Mỹ, cứ mỗi 45 giây trôi qua, trên thế giới có ít nhất một người bị đột quỵ. Và cứ 3 phút trôi qua, thế giới lại có một người tử vong do đột quỵ.

Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 200.000 người bị đột quỵ, khoảng 50% trong số đó tử vong. Nếu như trước đây, đột quỵ thường gặp ở những người tuổi từ 50 trở lên thì hiện nay, bệnh ngày càng trẻ hóa. Theo thống kê tại các bệnh viện, tỷ lệ đột quỵ ở người trẻ tuổi đang có xu hướng tăng lên, trung bình khoảng 2% mỗi năm. Hiện nay trên thế giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biết mạch máu não ngày càng gia tăng, nhất là các nước đang phát triển.

Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu não như: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi. Nguyên nhân chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỉ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đã đi theo hướng xử lý các huyết khối hình thành trong thành mạch. Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch.

Khái niệm và nguyên nhân của hội chứng tắc nghẽn mạch máu Hội chứng tắc nghẽn mạch máu là một chứng bệnh cục máu đông được 6 tạo thành do fibrin bị đóng cục lưu giữ trong mạch gây tắc mạch và cản trở lưu thông máu. Hội chứng huyết khối tác động lên cả hệ thống tĩnh mạch (thuyên tắc - huyết khối tĩnh mạch) và hệ thống động mạch (huyết khối động mạch do xơ vữa) [6]. Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch, là sự tắc nghẽn tĩnh mạch do máu cục máu đông, là bệnh tim mạch phổ biến thứ ba ở những nước phương Tây. Hàng năm có 0,1% dân số thế giới mắc bệnh này.

Biểu hiện phổ biến nhất của thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch là huyết khối tĩnh mạch sâu, hiện tượng này xảy ra khi có một cục máu đông hình thành trong lòng các tĩnh mạch sâu của chi dưới. Đây là một bệnh lý phổ biến ở những bệnh nhân lớn tuổi nằm liệt giường, những bệnh nhân sau phẫu thuật không thể cử động trong một thời gian dài cũng như những bệnh nhân vừa trải qua một cuộc đại phẫu, hay phẫu thuật chỉnh hình. Bệnh này cũng có thể xảy ra ở những bệnh nhân có bệnh di truyền dẫn đến đông máu bất thường, xảy ra ở người già, những phụ nữ trẻ cũng không miễn nhiễm, đặc biệt trong thời kì sinh đẻ [7]. Hậu quả nghiêm trọng nhất của huyết khối tĩnh mạch sâu là thuyên tắc động mạch phổi.

Tắc mạch phổi xảy ra khi cục máu đông hay một mảnh của nó bong ra và di chuyển đến phổi và gây ra tình trạng tắc nghẽn mạch máu phổi. Thuyên tắc phổi là bệnh lý rất nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong rất cao. Huyết khối động mạch do xơ vữa Huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra khi cục máu đông hình thành trên nền của một mảng xơ vữa ở thành động mạch. Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra, tại những chỗ đó máu sẽ bị hoạt hóa và đông cục gây tắc động mạch [6].

Đây là một bệnh rất nguy hiểm vì nếu cục máu đông này phát triển và làm tắc nghẽn hoàn toàn, động mạch bị tổn thương, thì máu qua động mạch này sẽ ngừng chảy và mô bên dưới do động mạch này cung cấp máu sẽ rơi vào nguy cơ bị thiếu máu, đôi khi dẫn đến hậu quả là đe dọa tính mạng người bệnh. Nếu huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra tại những động mạch cung cấp máu cho tim, hiện tượng này tạo ra hội chứng động mạch vành cấp hoặc 7 những cơn đau tim. Tương tự, nếu bệnh lý này xảy ra tại những động mạch cung cấp máu cho não thì những cơn đột quỵ do thiếu máu cục bộ sẽ xảy ra. Bệnh động mạch ngoại biên xảy ra khi huyết khối động mạch do xơ vữa tác động lên các động mạch chi dưới.

Bệnh huyết khối động mạch do xơ vữa đang gia tăng chủ yếu do lối sống hiện đại của chúng ta. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối Sinh lý học hoàn chỉnh của sự hình thành cục máu đông fibrin là một quá trình tương đối dễ hiểu. Một cục máu đông hoặc huyết khối bao gồm các tế bào máu được chứa trong một ma trận của protein fibrin. Huyết khối hoặc tiêu sợi huyết là quá trình điều hòa enzyme để hòa tan cục máu đông.

Trong tuần hoàn động vật có vú, enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình tiêu sợi huyết là plasmin, một protease serine giống như trypsin [8]. Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết. Quá trình đông máu diễn ra gồm một chuỗi các phản ứng theo kiểu bậc thang bao gồm ba giai đoạn: (1) giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua hai con đường nội sinh và ngoại sinh, (2) giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và (3) giai đoạn tạo thành mạng lưới fibrin từ fibrinogen tạo thành cục máu đông [9].

Hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần là tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu). Khi rối loạn một trong hai yếu tố trên đều ảnh hưởng đến quá trình đông máu. Phản ứng đông máu ngay lập tức được kích hoạt khi tổn thương xảy ra làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Bước đầu của quá trình đông máu, tiểu cầu tạo nút chặn để cầm máu vết thương sau đó các yếu tố đông máu có trong huyết tương sẽ đáp ứng một loạt các phản ứng tạo ra sợi huyết, củng cố nút chặn tiểu cầu.

Sợi huyết được tạo thành đó là do quá trình tạo fibrin từ fibrinogen hòa tan trong huyết tương. Tiểu cầu cùng với sợi huyết tạo thành cục máu đông gắn vào thành mạch máu để ngăn ngừa sự mất máu và giúp liền vết thương. 8 Ngược với quá trình đông máu là quá trình tan huyết khối, giúp tái lưu thông tuần hoàn máu. Có hai cơ chế tan huyết khối là: cơ chế thủy phân fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin và cơ chế thủy phân trực tiếp fibrin.

Với sự có mặt của chất hoạt hóa, plasmin có hoạt tính thủy phân fibrin được sản xuất từ plasminogen không hoạt động có trong hệ thống tuần hoàn. Sự chuyển đổi sinh hóa của plasminogen không hoạt động thành plasmin liên quan đến sự phân cắt protein do các chất kích hoạt plasminogen khác nhau [10]. Cơ chế thủy phân fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen chỉ xảy ra khi tuyệt đối cần thiết và theo một quy trình rất kĩ càng, lúc đầu chỉ ở khu trú ở khu vực có cục máu đông (tức là nơi có fibrin). Bình thường khi máu đang lưu thông thì không có sự xuất hiện của plasmin.

Khi có cục máu đông lập tức xảy ra quá trình kích hoạt plasminogen, như vậy fibrin chính là tác nhân chủ yếu và quan trọng nhất để khởi phát cho sự hoạt hóa plasminogen và từ đó dẫn đến quá trình tiêu fibrin. Plasminogen bị cắt thành hai chuỗi: chuỗi A là chuỗi nặng, trọng lượng phân tử 6.000 kDa, và chuỗi B là chuỗi nhẹ, trọng lượng phân tử là 2.600 kDa, hai chuỗi được kết nối với nhau bằng một cầu disulfua. Về mặt cấu trúc plasmin chỉ khác plasminogen ở chỗ có hai chuỗi, trình tự acid amin vẫn giống nhau, và có cầu disulfua nối hai chuỗi nên trọng lượng phân tử và tính kháng nguyên vẫn như nhau. Plasmin sau khi được tạo ra xúc tác cho quá trình cắt fibrin thành các sản phẩm tan được gọi là sản phẩm thoái giáng của fibrin (FDPs), các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm chậm quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin nên làm chậm tạo thành cục máu đông (Hình 1.

Cơ chế hoạt hoá plasminogen Trong các chất hoạt hóa plasminogen thì t-PA có vai trò quan trọng, nó thường phát huy tác dụng sớm nhất và mạnh nhất, hiệu lực hoạt hóa tăng lên rất nhiều khi có mặt của fibrin. Trong máu người bình thường plasmin tồn tại song song với yếu tố ức chế là antiplasmin, nó có nồng độ cao gấp 30 lần so với plasmin, có tác dụng ngăn chặn việc tác động của plasmin tới việc phân hủy các protein trong huyết tương [11]. Hai yếu tố hoạt hóa plasminogen tự nhiên trong máu là urokinase (u-PA) và yếu tố hoạt hóa mô (t-PA), hoạt động tiêu sợi huyết được kiểm soát bởi các chất ức chế plasmin (a1- antiplasmin, a2- macroglobulin), các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (PAL-I: plasminogen activator inhibitor -1, một chất ức chế nhanh tác dụng của t-PA và u-PA) [12]. Nhờ cơ chế trên mà cơ thể giữ được sự cân bằng, ổn định, không có sự đông máu hoặc chảy máu bất thường (Hình 1.

Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông 10 Cơ chế tan huyết khối thông qua sự thủy phân trực tiếp fibrin an toàn hơn cơ chế thủy phân bằng quá trình hoạt hóa plasminogen vì plasmin liên quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lượng plasmin được tạo ra mất cân bằng với lượng antiplasmin thì sẽ rất nguy hiểm với các vết thương chảy máu, có thể gây ra chảy máu ồ ạt và nguy hiểm đến tính mạng. Ngoài các yếu tố lumbrokinase, t-PA, u-PA không có yếu tố nào có thể thủy phân trực tiếp fibrin mà đều phải thông qua quá trình hoạt hóa plasminogen [1]. Một số thuốc điều trị huyết khối Hiện nay nhu cầu về các thuốc điều trị huyết khối ngày càng tăng cao do bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến tim mạch, huyết khối trên thế giới ngày càng gia tăng theo tốc độ phát triển của xã hội và lối sống hiện đại.