Luận Án Tiến Sĩ Sinh Học: Đánh Giá Hoạt Động Gen Tổng Hợp Tinh Bột Và Thử Nghiệm Chuyển Gen SSIV Vào Cây Sắn

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Đánh Giá Hoạt Động Của Một Số Gen Liên Quan Đến Tổng Hợp, Tích Lũy Tinh Bột Và Thử Nghiệm Chuyển Gen SSIV Vào Cây Sắn
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn
• 1.2. Nguồn gốc và phân loại
• 1.3. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền
• 1.4. Giá trị của cây sắn
• 1.5. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam
• 1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn
• 1.7. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay
• 1.8. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn
• 1.9. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật
• 1.10. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
• 1.11. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen
• 1.12. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn
• 1.13. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn
• 1.14. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu thực vật
• 2.3. Chủng vi khuẩn, vector
• 2.4. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm
• 2.5. Môi trường nuôi cấy
• 2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh giá
• 2.7.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.7.3. Phương pháp phân lập gen và promoter
• 2.7.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen
• 2.7.5. Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giống sắn phục vụ cho nghiên cứu
• 2.7.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.7.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
• 2.7.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển
• 2.7.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen
• 2.7.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột
• 3.2. Lựa chọn các giống sắn sử dụng
• 3.3. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn
• 3.4. Tách chiết ARN tổng số
• 3.5. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA
• 3.6. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột
• 3.7. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và củ sắn
• 3.8. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen
• 3.8.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu
• 3.8.2. Phân lập gen SSIV ở sắn
• 3.8.3. Thiết kế vector chuyển gen
• 3.9. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá
• 3.9.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen chuyển
• 3.9.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển
• 3.10. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn
• 3.10.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn
• 3.10.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen GUS
• 3.10.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột
• 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột
• 4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá
• 4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn
• 4.4. Hệ thống tái sinh cây sắn
• 4.5. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua Agrobacterium
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÓM TẮT TIẾNG ANH
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Đánh giá gen tổng hợp tinh bột

Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá hoạt động của các gen liên quan đến tổng hợp tinh bột trong cây sắn. Các gen như SSIV, AGPS, AGPL, GBSS, SSI, SSII, SSIII, và SBE được phân tích để hiểu rõ vai trò của chúng trong quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của các gen này thay đổi theo giai đoạn phát triển của cây, đặc biệt là ở lá và củ. SSIV được xác định là gen quan trọng trong việc tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột, mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng trong cải thiện năng suất cây trồng.

1.1. Phân tích biểu hiện gen

Phân tích biểu hiện gen được thực hiện thông qua kỹ thuật real-time PCR, cho thấy sự biểu hiện của các gen AGPS, AGPL, và GBSS tăng cao trong giai đoạn tích lũy tinh bột. SSIV cũng thể hiện vai trò quan trọng trong quá trình này, đặc biệt ở củ sắn. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học để tối ưu hóa quá trình tổng hợp tinh bột thông qua điều chỉnh biểu hiện gen.

1.2. Phân lập gen SSIV

Gen SSIV được phân lập từ củ sắn và thiết kế thành vector chuyển gen. Quá trình này bao gồm việc tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, và thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Kết quả phân lập gen SSIV cho thấy sự khác biệt nhỏ trong trình tự nucleotide so với gen tham chiếu, nhưng không ảnh hưởng đến chức năng của protein.

II. Thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

Nghiên cứu tiến hành chuyển gen SSIV vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hệ thống tái sinh in vitro được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả chuyển gen. Kết quả thu được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính với SSIV, mở ra tiềm năng ứng dụng trong cải thiện năng suất tinh bột sắn.

2.1. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen

Quy trình chuyển gen được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh thời gian nhiễm khuẩn và nồng độ kháng sinh Kanamycin. Kết quả cho thấy thời gian nhiễm khuẩn 20 phút và nồng độ Kanamycin 50 mg/L là tối ưu để đảm bảo tỷ lệ sống sót và tái sinh của mô sẹo.

2.2. Đánh giá hiệu quả chuyển gen

Các dòng sắn chuyển gen được đánh giá thông qua PCR và Southern blot, xác nhận sự hiện diện của gen SSIV trong bộ gen cây sắn. Kết quả cho thấy sự tích lũy tinh bột tăng đáng kể ở các dòng chuyển gen so với cây đối chứng, chứng minh hiệu quả của việc chuyển gen SSIV.

III. Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải thiện giống cây sắn

Nghiên cứu này đã ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại để cải thiện giống cây sắn, tập trung vào việc tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột. Kết quả nghiên cứu không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về các gen liên quan đến tổng hợp tinh bột và quy trình chuyển gen hiệu quả. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực di truyền cây trồng và công nghệ gen.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng rộng rãi trong việc cải thiện năng suất các loại cây trồng dự trữ tinh bột như khoai tây, khoai lang. Điều này góp phần giải quyết vấn đề an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững trong bối cảnh biến đổi khí hậu.