Luận án tiến sĩ sinh học đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen ssiv vào cây sắn

Luận án tiến sĩ nghiên cứu sinh học đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp tích lũy tinh bột và thử nghiệm, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

Chuyên ngành

Di truyền học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

luận án tiến sĩ

2018

186
1
0

Phí lưu trữ

45 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn

1.2. Nguồn gốc và phân loại

1.3. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền

1.4. Giá trị của cây sắn

1.5. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam

1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn

1.7. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay

1.8. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn

1.9. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật

1.10. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan

1.11. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen

1.12. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn

1.13. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn

1.14. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.2. Vật liệu thực vật

2.3. Chủng vi khuẩn, vector

2.4. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm

2.5. Môi trường nuôi cấy

2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.7. Phương pháp nghiên cứu

2.7.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh giá

2.7.2. Các phương pháp sinh học phân tử

2.7.3. Phương pháp phân lập gen và promoter

2.7.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen

2.7.5. Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giống sắn phục vụ cho nghiên cứu

2.7.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.7.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

2.7.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển

2.7.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen

2.7.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột

3.2. Lựa chọn các giống sắn sử dụng

3.3. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn

3.4. Tách chiết ARN tổng số

3.5. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA

3.6. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột

3.7. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và củ sắn

3.8. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen

3.8.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu

3.8.2. Phân lập gen SSIV ở sắn

3.8.3. Thiết kế vector chuyển gen

3.9. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá

3.9.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen chuyển

3.9.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển

3.10. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn

3.10.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn

3.10.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen GUS

3.10.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột

4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá

4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn

4.4. Hệ thống tái sinh cây sắn

4.5. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua Agrobacterium

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÓM TẮT TIẾNG ANH

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Đánh giá gen tổng hợp tinh bột

Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá hoạt động của các gen liên quan đến tổng hợp tinh bột trong cây sắn. Các gen như SSIV, AGPS, AGPL, GBSS, SSI, SSII, SSIII, và SBE được phân tích để hiểu rõ vai trò của chúng trong quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của các gen này thay đổi theo giai đoạn phát triển của cây, đặc biệt là ở lá và củ. SSIV được xác định là gen quan trọng trong việc tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột, mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng trong cải thiện năng suất cây trồng.

1.1. Phân tích biểu hiện gen

Phân tích biểu hiện gen được thực hiện thông qua kỹ thuật real-time PCR, cho thấy sự biểu hiện của các gen AGPS, AGPL, và GBSS tăng cao trong giai đoạn tích lũy tinh bột. SSIV cũng thể hiện vai trò quan trọng trong quá trình này, đặc biệt ở củ sắn. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học để tối ưu hóa quá trình tổng hợp tinh bột thông qua điều chỉnh biểu hiện gen.

1.2. Phân lập gen SSIV

Gen SSIV được phân lập từ củ sắn và thiết kế thành vector chuyển gen. Quá trình này bao gồm việc tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, và thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Kết quả phân lập gen SSIV cho thấy sự khác biệt nhỏ trong trình tự nucleotide so với gen tham chiếu, nhưng không ảnh hưởng đến chức năng của protein.

II. Thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

Nghiên cứu tiến hành chuyển gen SSIV vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hệ thống tái sinh in vitro được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả chuyển gen. Kết quả thu được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính với SSIV, mở ra tiềm năng ứng dụng trong cải thiện năng suất tinh bột sắn.

2.1. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen

Quy trình chuyển gen được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh thời gian nhiễm khuẩn và nồng độ kháng sinh Kanamycin. Kết quả cho thấy thời gian nhiễm khuẩn 20 phút và nồng độ Kanamycin 50 mg/L là tối ưu để đảm bảo tỷ lệ sống sót và tái sinh của mô sẹo.

2.2. Đánh giá hiệu quả chuyển gen

Các dòng sắn chuyển gen được đánh giá thông qua PCRSouthern blot, xác nhận sự hiện diện của gen SSIV trong bộ gen cây sắn. Kết quả cho thấy sự tích lũy tinh bột tăng đáng kể ở các dòng chuyển gen so với cây đối chứng, chứng minh hiệu quả của việc chuyển gen SSIV.

III. Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải thiện giống cây sắn

Nghiên cứu này đã ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại để cải thiện giống cây sắn, tập trung vào việc tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột. Kết quả nghiên cứu không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về các gen liên quan đến tổng hợp tinh bột và quy trình chuyển gen hiệu quả. Đây là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực di truyền cây trồngcông nghệ gen.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng rộng rãi trong việc cải thiện năng suất các loại cây trồng dự trữ tinh bột như khoai tây, khoai lang. Điều này góp phần giải quyết vấn đề an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững trong bối cảnh biến đổi khí hậu.

01/03/2025
Luận án tiến sĩ sinh học đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen ssiv vào cây sắn

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH BỘT Ở SẮN 1. Nguồn gốc và phân loại 1. Nguồn gốc Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây 5000 năm.

Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900 - 200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời (Rogers, 1965). Ở Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, Việt Nam và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ XVIII. Tuy nhiên, đến thế kỷ XIX, nghề trồng sắn và tiêu thụ sắn mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ.

Từ đó đến nay, diện tích, năng suất và sản lượng sắn ngày một tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). Phân loại Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu dầu. Vào năm 1651 Bauhin là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ chi này khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thày tu Pháp A. Thevet mang từ Brazin về, ông đặt tên loài là Manihot theveti.

Có thể cho rằng loài cây đó hiện nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965). Năm 1776, Crantz công bố sự mô tả loài với tên Manihot esculenta, căn cứ 5 vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam năm 1726. Sau đó nhiều tác giả đã nghiên cứu về chi Manihot với các cách phân nhóm khác nhau. Đến năm 1938, Cifferi trở lại cách gọi tên của Crantz, ông dùng lại tên loài M.esculenta và không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt, ông cung cấp một quan niệm về các giống trồng phổ biến (cultivar).

Bảng phân loại cuối cùng của Rogers và Appan (1973) là kết quả của một công trình nghiên cứu rất đầy đủ về chi Manihot, tiến hành trong 20 năm với phương pháp phân loại số lượng. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền 1. Đặc điểm hình thái * Thân cây Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1 - 3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng.

Thân sắn có khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây. Thân và cành già đã hoá gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng.

Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh, phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom không bị mất nước (Tribadi và cs. * Lá sắn Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá. Cuống lá dài từ 3 - 30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tuỳ theo giống (màu vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi). Phiến lá thường chia 5 - 7 thuỳ nhưng cũng có khi không chia thuỳ.

Lá của cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chí thuỳ không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ của phiến lá thường giảm. Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi và cs.1: Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (Nguồ n: Liu và cs., 2011) Chú thích: A.

Cây sắn khi trồng ở ruộng; B. Củ sắn khi thu hoạch; C. Cây con nảy mầm từ hạt; G. Thân sắn dùng để trồng cây.

* Hoa sắn Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ phân cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hoá hoa hoặc do mầm hoa rụng đi. Những cụm hoa sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm. Cụm hoa gồm một trục dài 2 - 10 cm và các trục bên hợp lại thành chuỳ (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).

Hoa cái có năm lá đài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có một bầu hoa 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhuỵ ngắn với đầu nhuỵ uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn ở bên trong và có lông ở phía ngoài.

Có khoảng 8 - 10 nhị đực xếp thành hai vòng và mọc lên từ các thuỳ của mỗi đĩa phía dưới. Bao phấm mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012). Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây.

Hoa 7 đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào cuối buổi chiều. Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1 giờ, sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là 1 tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhuỵ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất sau 1 ngày.

Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8 - 19 giờ (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012). * Quả và hạt Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1 - 1,5 cm. Quả có 3 ngăn được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa 1 hạt. Màu sắc quả thường biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng dến lục hay đỏ tía.

Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả. Hạt sắn hình trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu đỏ nâu trên nền kem hoặc xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012).

* Rễ sắn Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau đó các rễ phụ mọc ra, cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ. Rễ mọc ra từ hom đầu tiên thì mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hoá và dự trữ. Rễ đồng hoá thường cắm sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc.

Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ có một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể có hoặc không có cuống củ (Ceballos & Cruz, 2012). Đặc điểm sinh thái Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới (Allem.

Sắn được phân bố phổ biến từ 33 o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam. 8 Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi trồng. Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yucca (tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca (tiếng Bồ Đào Nha). Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích khá rộng từ 20 – 40oC.

Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tuổi thọ lá và chỉ số diện tích lá. Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC, tuổi thọ của lá giảm nhưng tăng số lá mới hình thành. Là cây ưa sáng, cây sắn thích hợp với thời gian chiếu sáng 12h/ngày để tích luỹ tinh bột về củ (Keating và cs. Đặc điểm di truyền Chi Manihot thuộc họ thầu dầu, có tới hơn 300 chi và 8000 loài hầu hết là cây nhiệt đới.

Đặc điểm của họ thầu dầu là thường hay có mạch, nhựa mủ. Chi Manihot thuộc nhóm Manihotae. Tất cả các loài trong chi đều có số lượng nhiễm sắc thể 2n= 36. Rogers & Appan (1973) đã xây dựng một bảng phân loại cho 98 loài thuộc chi Manihot, phân thành 17 nhóm.

Sự nhận dạng các loài và các nhóm dựa vào sự phân tích nhiều mặt của đặc điểm hình thái ở các bộ phận trên mặt đất. Nhờ vào bảng phân loại người ta đã lập được một bảng nhận dạng các loài trong chi. Giá trị của cây sắn Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới sau lúa và ngô (Kim và cs. Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84 - 87% khối lượng khô, là nguồn cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới.

Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg,. Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn còn góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Abrahamian & Kantharajah, 2011).

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Tài liệu có tiêu đề "Đánh Giá Hoạt Động Gen Tổng Hợp Tinh Bột & Thử Nghiệm Chuyển Gen SSIV Vào Cây Sắn" cung cấp cái nhìn sâu sắc về việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ gen trong việc cải thiện năng suất cây sắn thông qua việc tổng hợp tinh bột. Tài liệu này không chỉ trình bày các phương pháp đánh giá hoạt động của gen mà còn mô tả quy trình chuyển gen SSIV vào cây sắn, từ đó mở ra hướng đi mới cho việc nâng cao chất lượng và sản lượng cây trồng. Độc giả sẽ tìm thấy những thông tin hữu ích về tiềm năng của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, cũng như những lợi ích mà nó mang lại cho ngành trồng trọt.

Nếu bạn muốn mở rộng kiến thức về các nghiên cứu liên quan đến chất lượng nước và các vấn đề môi trường, hãy tham khảo tài liệu "Luận văn thạc sĩ hóa học phân tích và đánh giá chất lượng nước giếng khu vực phía đông vùng kinh tế dung quất huyện bình sơn tỉnh quảng ngãi". Ngoài ra, tài liệu "Luận văn thạc sĩ khoa học xác định mức độ ô nhiễm các hợp chất hydrocarbons thơm đa vòng pahs trong trà cà phê tại việt nam và đánh giá rủi ro đến sức khỏe con người" cũng sẽ cung cấp cho bạn cái nhìn về ô nhiễm môi trường và tác động của nó đến sức khỏe con người. Cuối cùng, bạn có thể tham khảo "Luận văn đề xuất các giải pháp nhằm nâng cao hiệu quả áp dụng" để tìm hiểu thêm về các giải pháp cải tiến trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ. Những tài liệu này sẽ giúp bạn có cái nhìn toàn diện hơn về các vấn đề liên quan đến nông nghiệp và môi trường.