MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam. Đây là một giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. Dendrobium đã thực sự trở thành một giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam trong nhiều năm qua.
Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm sản xuất hoa lan lớn nhất cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một trong hai giống lan đóng góp chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa lan thành phố trong năm 2015 [10]. Tuy nhiên, hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại Thành phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước. Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước. Nghiên cứu nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam.
Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan, trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra. Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) [88]. Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam [2], [5], [7], và đặc biệt là lan Dendrobium được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV [2].
Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam. 1 Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch. Quan trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh chóng qua các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn với mức độ rất nghiêm trọng. Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh virus vẫn là phòng tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá trình sản xuất giống và canh tác.
Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu quả như mong muốn. Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo ra khả năng kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA (RNAi). Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên thế giới [34]. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các loại virus khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV [12], virus CMV [11] và kháng đồng thời cả hai loại virus TMV và CMV [3]; cà chua kháng virus TYLCV [13]; đu đủ kháng virus PRSV [4], đậu tương kháng virus SMV và BYMV [9].
Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất nghiêm trọng trên giống lan này. Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan. Mục tiêu và yêu cầu Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho cây lan Dendrobium Sonia trong điều kiện nuôi cấy in vitro: - Nghiên cứu chọn được vùng trình tự bảo thủ của gen CP và ORF2-4 từ virus CyMV phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen RNAi. - Nghiên cứu xây dựng được quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium để tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP.
- Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro. Đ ượng và phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây bệnh trên lan. Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP của virus CyMV vào PLBs lan bằng kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu, bao gồm việc đánh giá khả năng kháng virus của cây chuyển gen, được giới hạn trong điều kiện in vitro.
Ý ĩa k a c và thực tiễn *Ý ĩa k a - Góp phần làm sáng tỏ vấn đề về mức độ bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV tại Việt Nam. - Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên đối tượng lan Dendrobium. - Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung. 3 *Ý ĩa ự ễ Tạo ra được các dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả năng kháng virus CyMV trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống lan kháng virus thông qua lai tạo.
Đóng góp mới của luận án - Chứng minh được tính bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV tại Việt Nam. - Khẳng định được tính khả thi của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc tạo khả năng kháng virus cho lan Dendrobium. - Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả năng kháng virus của cây lan chuyển gen trong điều kiện nuôi cấy in vitro. - Tạo ra được các dòng lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng virus trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống lan kháng virus.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược v hoa lan 1. Giới thiệu v h hoa lan Họ hoa lan (Orchidaceae) bao gồm khoảng 900 giống và 2500-3500 loài. Đây là một trong những họ thực vật lớn nhất và nhận được sự quan tâm đặc biệt do có hoa đẹp, lâu tàn cũng như rất đa dạng về màu sắc, hình dạng và kích thước.
Chúng được xem là các loại hoa cắt cành và hoa chậu phổ biến về mặt kinh tế trên toàn thế giới. Nhiều loài mới mang những tính trạng cải tiến của họ này vẫn đang tiếp tục được tạo ra để đáp ứng cho nhu cầu của thị trường [46]. Gi ng lan Dendrobium Giống lan Dendrobium được Olof Swartz đặt tên vào năm 1799. Chữ Dendrobium có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp.
Dendro có nghĩa là cây lớn, bio là sống, vì tất cả các loài của Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ. Dendrobium rất phong phú về chủng loại, là giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan, với khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và châu Úc [8]. Trong đó, Dendrobium Sonia là dòng lan lai được tạo ra từ tổ hợp lai Dendrobium Caesar x Dendrobium Tomie Drake bởi tác giả Chittraphong và được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1984 [29]. Về hình thái, đây là loài lan đa thân, bao gồm nhiều giả hành, mỗi giả hành có nhiều lóng, thường có 2-3 lá dai, bền, không rụng ở đỉnh.
Hoa màu tím (gồm 3 cánh hoa màu tím pha trắng ở phần gốc cách hoa, 3 lá đài có màu tương tự như cánh hoa nhưng phần màu tím nhạt hơn và môi màu tím đậm), họng trắng (Hình 1. Hoa lan Dendrobium Sonia Phát hoa phát sinh ở cả giả hành cũ và mới. Ở giả hành mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành phát hoa, những chồi già bên dưới phát triển sau. Nói cách khác, sự phát triển phát hoa từ chồi xảy ra theo thứ tự từ ngọn đến gốc, và thường có 1-4 chồi phát triển thành phát hoa cùng lúc (mô tả theo [8]).
Về sinh trưởng, đây là loài lan có đặc điểm sinh trưởng liên tục, không có thời gian nghỉ hay thời gian nghỉ rất ngắn. Tương tự như hầu hết các loài trong giống lan Dendrobium, Dendrobium Sonia thích nghi với ánh sáng từ 70-80% ánh sáng tự nhiên. Ánh sáng quá mức có thể gây ra hiện tượng vàng lá, cháy lá; ngược lại thiếu sáng cây sẽ phát triển kém, ít ra hoa, số hoa trên phát hoa ít. Nhiệt độ thích nghi cho sự phát triển của lan Dendrobium Sonia khoảng 25oC [8].
Lan Dendrobium Sonia là một loại hoa phù hợp cho cả mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. So với nhiều loại lan khác, nhu cầu của thị trường đối với hoa lan Dendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng trong nhiều năm qua. Do vậy, việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cải thiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng. ơ lược v PLBs (Protocorm like bodies) Sự hình thành protocorm là một đặc tính riêng của sự phát triển ở họ hoa lan.
Trong đó, thuật ngữ “protocorm” được Treub sử dụng lần đầu tiên vào năm 1980, để thay cho thuật ngữ “embryonic tuber” (củ phôi), đã được sử dụng trước đó để mô tả một cấu trúc dạng củ (tuberidiform), có lông ở phần bên dưới, được hình thành trong quá trình nẩy mầm của phôi ở cây thạch tùng. Thuật ngữ này cũng được 6 Balfour (1905) sử dụng để chỉ dạng cây mầm (seeding) của hoa lan. Trước đây, việc xác định protocorm là cây mầm hay phôi vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau từ các nhà nghiên cứu [19]. Tương tự với protocorm, PLBs (protocorm like bodies) được Morel sử dụng lần đầu tiên vào năm 1960 trong thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi (shoot-tip) của lan Cymbidium do có các đặc điểm về phát triển và cấu trúc giống với protocorm.