Luận Văn Tốt Nghiệp: Chiết Xuất và Xác Định Cấu Trúc Hợp Chất Từ Quả Tiêu Lốt (Piper Longum L)

Tổng hợp kiến thức Chiết Xuất và Phân Tích Hợp Chất Từ Quả Tiêu Lốt (Piper Longum L), tiếp cận khoa học, hỗ trợ học tập và nghiên cứu hiệu quả trong

• Tác giả: Nguyễn Thị Mỹ Linh
• Người hướng dẫn: PGS. Đỗ Thị Hà
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Chiết Xuất và Phân Tích Hợp Chất Từ Quả Tiêu Lốt (Piper Longum L.)
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC ẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về chi Piper
• 1.2. Tổng quan về loài Piper longum
• 1.3. Vị trí phân loại
• 1.4. Đặc điểm thực vật
• 1.5. Sinh thái và phân bố
• 1.6. Thành phần hóa học
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp chiết xuất
• 2.5. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.6. Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn
• 3.2. Phân lập các chất
• 3.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất
• 4. CHƯƠNG 4: ÁN LUẬN
• 4.1. Hợp chất Piperin
• 4.2. Hợp chất Pipernonalin
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Tiêu lốt Piper longum L

Tiêu lốt, hay còn gọi là Piper longum L., là một loài thực vật thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae). Loài này chủ yếu phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở Ấn Độ và Việt Nam. Tiêu lốt được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm khả năng chống viêm, kháng khuẩn và điều hòa miễn dịch. Nghiên cứu về thành phần hóa học của Tiêu lốt cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất phenolic và alkaloid. Những hợp chất này không chỉ có giá trị trong y học cổ truyền mà còn có tiềm năng trong y học hiện đại.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố

Tiêu lốt là cây thân thảo lâu năm, có thể cao từ 2 đến 4 mét. Cây ưa ẩm và thường mọc rải rác trong các khu rừng nhiệt đới. Tại Việt Nam, Tiêu lốt phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng cao nguyên. Đặc điểm thực vật của Tiêu lốt bao gồm lá hình trứng, hoa mọc thành cụm và quả mọng nhỏ. Những đặc điểm này không chỉ giúp nhận diện loài mà còn ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trong môi trường tự nhiên.

II. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất

Quá trình chiết xuất thực vật từ Tiêu lốt được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm chiết xuất bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng. Các phương pháp này giúp tách biệt và xác định các hợp chất sinh học có trong quả Tiêu lốt. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như LC-MS/MS và NMR cho phép xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất một cách chính xác. Kết quả từ quá trình chiết xuất cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất phenolic và alkaloid, trong đó có piperin và pipernonalin, là những hợp chất nổi bật với nhiều tác dụng sinh học.

2.1. Các phương pháp chiết xuất

Các phương pháp chiết xuất được áp dụng bao gồm chiết xuất bằng ethanol, methanol và các dung môi hữu cơ khác. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất và chất lượng của các hợp chất thu được. Việc lựa chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng để tối ưu hóa quá trình chiết xuất và đảm bảo thu được các hợp chất sinh học có giá trị nhất từ Tiêu lốt.

III. Tác dụng dược lý của các hợp chất từ Tiêu lốt

Các hợp chất chiết xuất từ Tiêu lốt đã được nghiên cứu và chứng minh có nhiều tác dụng dược lý. Piperin, một trong những hợp chất alkaloid chính, cho thấy khả năng chống ung thư và điều hòa miễn dịch. Nghiên cứu cho thấy piperin có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và giảm viêm. Ngoài ra, các hợp chất phenolic cũng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa và cải thiện sức khỏe tổng thể.

3.1. Tác dụng chống ung thư

Piperin đã được chứng minh có khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư trong các nghiên cứu trên động vật. Sử dụng piperin trong điều trị có thể làm giảm đáng kể sự hình thành khối u và cải thiện tình trạng sức khỏe của bệnh nhân. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư từ thiên nhiên, đặc biệt là từ các hợp chất sinh học có trong Tiêu lốt.

IV. Kết luận và triển vọng nghiên cứu

Khóa luận này đã cung cấp cái nhìn sâu sắc về chiết xuất và phân tích hợp chất từ quả Tiêu lốt (Piper longum L.). Các kết quả nghiên cứu không chỉ khẳng định giá trị dược lý của Tiêu lốt mà còn mở ra nhiều cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ Tiêu lốt có thể góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng và phát triển y học hiện đại.

4.1. Triển vọng ứng dụng trong y học

Với những tác dụng dược lý đã được chứng minh, Tiêu lốt có thể được ứng dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và hiện đại. Các sản phẩm chiết xuất từ Tiêu lốt có thể được phát triển thành thuốc điều trị hoặc thực phẩm chức năng, góp phần nâng cao sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Nghiên cứu thêm về các hợp chất sinh học trong Tiêu lốt sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của loài thực vật này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), dược liệu đóng vai trò thiết yếu trong hệ thống chăm sóc sức khỏe ban đầu của cộng đồng. Trên phạm vi toàn cầu, trong tổng số khoảng 500.000 loài thực vật bậc cao, tỷ lệ loài được sàng lọc hoạt tính sinh học mới chỉ đạt khoảng 6% và tỷ lệ được khảo sát chuyên sâu về thành phần hóa học chỉ chiếm khoảng 15%. Tại Việt Nam, hệ thực vật ghi nhận hơn 4.000 loài cây thuốc có giá trị phòng và chữa bệnh trong y học cổ truyền. Xu hướng hiện đại hóa y dược học cổ truyền đòi hỏi việc xây dựng các cơ sở dữ liệu khoa học chuẩn xác về thành phần hóa học và tác dụng sinh học nhằm đảm bảo tính an toàn và hiệu quả khi sử dụng dược liệu.

Tiêu lốt, tên khoa học là Piper longum L., thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), là cây thuốc nhiệt đới phân bố tự nhiên tại Ấn Độ, miền Nam Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Singapore, Philippines và Việt Nam. Tại Việt Nam, cây mọc phổ biến ở các vùng cao nguyên và vùng núi đá vôi. Trong y học cổ truyền, quả và rễ Tiêu lốt có tính nóng, vị cay, được sử dụng trong các bài thuốc trị bệnh đường hô hấp và đường tiêu hóa. Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ghi nhận các nhóm hoạt chất alkaloid, lignan, ester, tinh dầu cùng các hoạt tính chống ung thư, điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn, bảo vệ gan và kháng viêm của Piper longum, nhưng tại thời điểm thực hiện đề tài, chưa có công bố chính thức nào về thành phần hóa học của cây Tiêu lốt thu hái trong nước. Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược học của sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Linh (Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội) được thực hiện nhằm lấp đầy khoảng trống dữ liệu này, gắn với Đề tài Nghị định thư Việt - Hàn mã số NĐT.KR/20.

Khóa luận xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Chiết xuất, phân lập được 2 hợp chất từ quả Tiêu lốt.
2. Xác định được cấu trúc hóa học của 2 hợp chất phân lập được từ quả Tiêu lốt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Quả của cây Tiêu lốt (Piper longum L.), thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae).
• Phạm vi không gian thu mẫu: Mẫu quả được thu hái tại huyện Chư Sê (tỉnh Gia Lai) và huyện Đắk Song (tỉnh Đắk Nông). Tiêu bản thực vật được giám định tên khoa học bởi PGS. Phạm Thanh Huyền và ThS. Nguyễn Văn Hiếu thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu (mã số tiêu bản: N12-PL).
• Phạm vi thời gian và địa điểm thực nghiệm: Mẫu thu hái vào ngày 12/09/2020; các nội dung chiết xuất, sắc ký phân lập và phân tích phổ được tiến hành tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu trong giai đoạn 2020–2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở lý thuyết về phân loại thực vật học họ Hồ tiêu (Piperaceae), hóa học các hợp chất thiên nhiên (chủ yếu là nhóm alkaloid, amide mạch hở và dị vòng, lignan, tinh dầu) và các quy chuẩn phân tích cấu trúc hóa thực vật hiện đại.

Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được áp dụng bao gồm:

• Phương pháp chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng: Chiết nóng hồi lưu bột dược liệu khô bằng dung môi ethanol 70% ở 80°C (3 lần, mỗi lần 3 giờ, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1:5 kg/L). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cao tổng ethanol. Phân tán cao tổng trong nước nóng và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan và ethyl acetat (EtOAc) để thu các cao phân đoạn tương ứng.
• Phương pháp phân lập sắc ký: Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) pha thường (DC-Alufolien 60G F254, Merck) và pha đảo (RP-18F254, Merck) để khảo sát hệ dung môi giải ly và kiểm tra độ tinh khiết; phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm và thuốc thử hiện màu dung dịch H2SO4 10% trong ethanol 96% kết hợp hơ nóng. Phân tách hoạt chất bằng sắc ký cột cổ điển (CC) với pha tĩnh silica gel pha thường (kích thước hạt 0,040–0,063 mm, Merck) và sắc ký cột pha đảo với silica gel pha đảo YMC (kích thước hạt 75 µm).
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Kết hợp dữ liệu phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ tứ cực chập ba LC-MS/MS với detector DAD (Shimadzu, Nhật Bản) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm phổ 1H-NMR (tần số 500 MHz hoặc 600 MHz) và 13C-NMR (tần số 125 MHz hoặc 150 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (Bruker, Hoa Kỳ), sử dụng dung môi đo CDCl3; đối chiếu với các tài liệu phổ chuẩn quốc tế đã công bố.

Hóa chất và trang thiết bị chính:

• Hóa chất: Ethanol 70%, n-hexan, ethyl acetat, methanol, dichloromethan, aceton, nước cất đạt tiêu chuẩn công nghiệp; CDCl3 dùng cho đo phổ NMR; silica gel phân tích và điều chế từ Merck và YMC Co.
• Thiết bị: Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor (các model R-124, R-210 và R-220 Pro dung tích 20L), bể siêu âm Vevor Ultrasonic Cleaner 10L, tủ sấy Memmert UF110 và Binder FD 115, bếp cách thủy Memmert WNB14, cân kỹ thuật Ohaus PA2102, cân phân tích Precisa XT 220A, đèn tử ngoại Vilber VL-6.LC.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về chi Piper và loài Piper longum L.:

• Tổng quan chi Piper: Chi có hơn 700 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Đến nay, hơn 592 hợp chất đã được phân lập từ các loài trong chi này, bao gồm 145 alkaloid/amide, 47 lignan, 70 neolignan, 89 hợp chất terpen, cùng các dẫn xuất propenylphenol, steroid, chalcone, flavone và flavanone.
• Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của Piper longum: Cây thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Piperales, họ Piperaceae, chi Piper. Cây thân thảo lâu năm, phần gốc bò lan, thân mang hoa mọc đứng cao 2–4 m, lá hình trứng thuôn dài 6–7,5 cm, hoa đơn tính mọc thành cụm. Cụm quả hình trụ dài 1,5–3,5 cm, đường kính 0,3–0,5 cm, mặt ngoài màu đen hoặc nâu, hạt kích thước 2–2,5 mm, mùa hoa quả rơi vào tháng 3–5.
• Thành phần hóa học: Quả chứa tinh dầu (caryophyllene 17,8%, pentadecane 17,8%, bisabolene 11%, α-zingiberene 5%...), các lignan (sesamin, pluviatilol, fargesin), các ester của acid coumaric, và đặc biệt là hàm lượng phong phú các alkaloid/amide như piperin, pipernonalin, piperlongumin, dihydropiperlongumin, piperundecalidin, guineensin, pipercid, pregumidiene, brachystamide B, piperderidine.
• Dược lý thực nghiệm và y học cổ truyền: Tổng hợp các hoạt tính sinh học của dịch chiết và các alkaloid từ P. longum gồm: ức chế di căn tế bào u ác tính B16F-10 (piperin làm giảm 95,2% điểm khối u ở phổi chuột C57BL/6); điều hòa miễn dịch qua giảm lympho CD4+ và CD8+; kháng viêm và giảm đau thực nghiệm; chống oxy hóa; chống loét dạ dày trên mô hình thắt môn vị và stress lạnh; bảo vệ gan chống tổn thương do CCl4; kích thích hô hấp đối kháng morphin; ức chế ngưng tập tiểu cầu thỏ (collagen, AA, PAF); hạ đường huyết ở chuột tiểu đường do alloxan; giảm cholesterol máu; chống trầm cảm qua ức chế men MAO; diệt côn trùng, kháng nấm thực vật (Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani...) và diệt amip (Entamoeba histolytica, Blastocystis hominis). Đặc biệt, piperin đóng vai trò chất tăng cường sinh khả dụng đối với nhiều dược chất như curcumin, indomethacin, vasicine. Trong y học cổ truyền, quả tiêu lốt (liều 1,5–3 g/ngày) và rễ tiêu lốt (liều 2–3 g/ngày) được dùng chữa đau bụng lạnh, nôn mửa, tiêu chảy, viêm xoang, đau răng, đau thắt ngực.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình xử lý nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm:

• Xử lý nguyên liệu: 3 kg quả Tiêu lốt khô (sấy ở nhiệt độ 50°C) được nghiền nhỏ thành bột thô.
• Quy trình chiết xuất: Bột quả được chiết nóng hồi lưu với ethanol 70% ở 80°C trong 3 lần (3 giờ/lần), lọc và cô cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cao tổng ethanol. Phân tán cao tổng trong nước nóng, chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với dung môi n-hexan và ethyl acetat (EtOAc) để tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau.
• Quy trình phân lập: Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thuận rửa giải theo thang dung môi gradient n-hexan - EtOAc (từ 100:0 đến 0:100, v/v) để chia nhỏ phân đoạn cao EtOAc, sau đó tinh chế bằng kết tinh lại hoặc sắc ký cột pha đảo YMC với hệ dung môi methanol - nước (4:1, v/v).
• Phương pháp phân tích phổ: Đo phổ ESI-MS trên hệ LC-MS/MS; đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR trong dung môi CDCl3 trên máy Bruker AM500 để xác định công thức phân tử và cấu trúc không gian của các chất tinh chế.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chiết xuất, phân lập và giải cấu trúc hóa học:

Mẫu cao chiết / Phân đoạn	Khối lượng thu được (g)	Tỷ lệ so với khối lượng dược liệu ban đầu (%)
Cao tổng EtOH 70%	600,33	20,01%
Cao phân đoạn n-hexan	99,83	3,33%
Cao phân đoạn EtOAc	192,32	6,41%
Cắn nước còn lại	233,94	7,80%

Quy trình sắc ký phân lập từ 192,32 g cao EtOAc:

• Chạy sắc ký cột silica gel pha thuận thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ 1A đến 1K. Phân đoạn 1H khi cô đặc tạo kết tủa; lọc và rửa tủa bằng n-hexan thu được 24,75 g hợp chất tinh khiết ký hiệu PL-16A1.
• Phân đoạn 1I (khối lượng 5,02 g) tiếp tục được phân tách qua cột sắc ký pha đảo YMC (hệ dung môi MeOH - H2O tỷ lệ 4:1, v/v), thu được 9 phân đoạn ký hiệu từ 2A đến 2I. Phân đoạn 2E cô đặc tạo kết tủa; lọc và rửa tủa thu được 0,86 g hợp chất tinh khiết ký hiệu PL-I6.

Xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất:

1. Hợp chất PL-16A1:

• Cảm quan: Bột màu vàng nhạt.
• Phổ ESI-MS: Xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 286,2 [M+H]+, xác định khối lượng phân tử là 285 Da, tương ứng với công thức phân tử C17H19NO3.
• Phổ 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (150 MHz, CDCl3): Ghi nhận tín hiệu vòng thơm thế 1,3,4 (hệ ABX) tại δH 6,98 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'), 6,78 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5'), 6,89 (1H, dd, J = 1,8; 7,8 Hz, H-6') tương ứng với các carbon δC 105,7 (C-2'), 108,5 (C-5'), 122,5 (C-6'), 131,1 (C-1'), 148,2 (C-3') và 148,1 (C-4'); một nhóm methylenedioxy (-OCH2O-) tại δH 5,97 (2H, s) và δC 101,3; 2 liên kết đôi liên hợp cấu hình trans tại δH 6,44 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-2), 7,40 (1H, m, H-3), 6,73 (2H, m, H-4, H-5) tương ứng các carbon δC 120,1 (C-2), 142,5 (C-3), 125,4 (C-4), 138,2 (C-5); một carbon carbonyl amide tại δC 165,5 (C-1); cùng 5 nhóm CH2 thuộc vòng piperidine tại vùng trường cao δH 1,58–3,58 ppm (10H) tương ứng các carbon δC 43,3 (C-2''), 26,7 (C-3''), 24,7 (C-4''), 25,6 (C-5'') và 46,9 (C-6''). Dữ liệu phổ hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của piperin.

2. Hợp chất PL-I6:

• Cảm quan: Bột màu trắng.
• Phổ ESI-MS: Xuất hiện pic ion giả phân tử tại m/z 343,3 [M+H]+, xác định khối lượng phân tử là 342 Da, tương ứng với công thức phân tử C21H27NO3 (lớn hơn piperin 56 Da, tương đương 4 nhóm -CH2-).
• Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): Xác nhận sự hiện diện của mạch 4 nhóm methylen (-CH2-) tại δH 1,67 (4H, m) và 2,20 (4H, m), tương ứng với các carbon δC 29,0 (C-5), 29,7 (C-6), 32,4 (C-7) và 32,7 (C-4); 2 nối đôi trans tách rời nhau ở hai phía của mạch alkyl gồm vị trí C-2/C-3 (δH 6,22, d, J = 15,0 Hz; δH 6,82, dt, J = 7,0; 15,0 Hz; δC 120,5 và 145,6) và vị trí C-8/C-9 (δH 6,02, m; δH 6,27, d, J = 15,5 Hz; δC 128,9 và 129,6); một nhóm carbonyl amide tại δC 165,6 (C-1); vòng thơm 1,3,4-thế có nhóm -OCH2O- tại δH 5,92 (2H, s) và δC 100,9; cùng vòng piperidine tại δC 43,1 (C-2''), 25,6 (C-3''), 24,7 (C-4''), 26,6 (C-5''), 46,9 (C-6''). Kết quả đối chiếu tài liệu khẳng định hợp chất PL-I6 là pipernonalin.

Thông số phân tích	Hợp chất PL-16A1	Hợp chất PL-I6
Tên hợp chất	Piperin	Pipernonalin
Dạng tồn tại / Màu sắc	Bột màu vàng nhạt	Bột màu trắng
Khối lượng phân lập	24,75 g	0,86 g
Ion giả phân tử (m/z, ESI-MS)	286,2 [M+H]+	343,3 [M+H]+
Công thức phân tử	C17H19NO3	C21H27NO3
Khối lượng phân tử	285 Da	342 Da
Nhóm chức amide (-CON-)	δC 165,5 ppm	δC 165,6 ppm
Nhóm methylenedioxy (-OCH2O-)	δH 5,97 ppm; δC 101,3 ppm	δH 5,92 ppm; δC 100,9 ppm

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích ý nghĩa khoa học của các kết quả thực nghiệm:

• Khẳng định tính chính xác của cấu trúc 2 alkaloid phân lập được (piperin và pipernonalin) dựa trên sự tương đồng hoàn toàn giữa dữ liệu phổ NMR, MS đo được với các tài liệu chuẩn quốc tế.
• Đánh giá hàm lượng và hiệu suất phân lập: Cả hai hợp chất đều thu được với lượng tương đối lớn từ phân đoạn ethyl acetat (piperin thu 24,75 g; pipernonalin thu 0,86 g từ 3 kg dược liệu). Điều này cho thấy piperin và pipernonalin là hai thành phần alkaloid chính, đặc trưng của quả Tiêu lốt thu hái tại Tây Nguyên (Gia Lai, Đắk Nông).
• Tiềm năng ứng dụng làm chất chỉ thị chất lượng (marker compounds): Do hàm lượng lớn, cấu trúc bền vững và gắn liền với các hoạt tính sinh học quan trọng (chống ung thư, giảm lipid máu, kháng nấm, tăng sinh khả dụng), piperin và pipernonalin có thể được lựa chọn làm hợp chất đối chiếu phục vụ công tác kiểm tra, chuẩn hóa và đánh giá chất lượng dược liệu quả Tiêu lốt cũng như các chế phẩm bào chế từ dược liệu này tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính của khóa luận:

• Đã chiết xuất từ 3 kg quả Tiêu lốt thu hái tại Chư Sê (Gia Lai) và Đắk Song (Đắk Nông), thu hồi được 600,33 g cao tổng ethanol 70% (tỷ lệ 20,01%), 99,83 g cao n-hexan (3,33%), 192,32 g cao EtOAc (6,41%) và 233,94 g cắn nước (7,80%).
• Đã phân lập thành công 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn cao EtOAc bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thuận và pha đảo, gồm 24,75 g hợp chất PL-16A1 và 0,86 g hợp chất PL-I6.
• Đã giải mã và xác định chính xác cấu trúc hóa học của 2 hợp chất dựa trên dữ liệu phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR: hợp chất PL-16A1 là piperin (C17H19NO3) và PL-I6 là pipernonalin (C21H27NO3).

Đóng góp khoa học của đề tài:

• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về thành phần hóa học của loài Tiêu lốt (Piper longum L.) được thu hái tại môi trường tự nhiên ở Việt Nam, chứng minh sự hiện diện của hai hoạt chất alkaloid chủ đạo là piperin và pipernonalin.
• Bổ sung cơ sở dữ liệu hóa thực vật phục vụ cho Đề tài Nghị định thư Việt - Hàn (mã số NĐT.KR/20) về nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và điều hòa miễn dịch từ cây thuốc Việt Nam.
• Đề xuất định hướng sử dụng piperin và pipernonalin làm chất chuẩn chỉ thị để kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu Tiêu lốt lưu hành trên thị trường.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của khóa luận:

• Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm mới chỉ tập trung phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của cao chiết ethanol, chưa tiến hành phân lập sâu trên các phân đoạn còn lại như phân đoạn n-hexan hay phân đoạn cắn nước.
• Đề tài mới dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất chính, chưa thực hiện các thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học trực tiếp trên các chất tinh khiết phân lập được từ nguồn mẫu Việt Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất hóa học khác từ cao tổng, phân đoạn ethyl acetat và các cao phân đoạn còn lại (n-hexan, cắn nước) của quả Tiêu lốt nhằm phát hiện thêm các hợp chất thứ cấp mới hoặc có hàm lượng nhỏ.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Dược học, Hóa dược, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Thực vật học.
• Cán bộ nghiên cứu tại các viện dược liệu, trung tâm kiểm nghiệm thuốc và mỹ phẩm trong việc tra cứu quy trình chiết xuất phân đoạn, thông số kỹ thuật sắc ký cột và bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối lượng (ESI-MS) chuẩn của hai hợp chất piperin và pipernonalin.
• Các nhà nghiên cứu phát triển phương pháp kiểm nghiệm dược liệu quả Tiêu lốt (Piper longum L.) theo hướng định tính và định lượng hoạt chất chỉ thị.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu nghiên cứu quả Tiêu lốt trong khóa luận được thu thập ở đâu và do đơn vị nào giám định tên khoa học? Mẫu quả Tiêu lốt được thu hái vào ngày 12/09/2020 tại hai địa bàn thuộc Tây Nguyên gồm huyện Chư Sê (tỉnh Gia Lai) và huyện Đắk Song (tỉnh Đắk Nông). Mẫu được PGS. Phạm Thanh Huyền và ThS. Nguyễn Văn Hiếu thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Piper longum L., họ Hồ tiêu (Piperaceae), lưu trữ dưới mã tiêu bản N12-PL.

2. Hiệu suất chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ 3 kg quả Tiêu lốt đạt bao nhiêu? Từ 3 kg bột quả khô chiết nóng bằng ethanol 70%, tác giả thu được 600,33 g cao tổng ethanol 70% (đạt hiệu suất 20,01%). Sau khi phân bố lỏng - lỏng với các dung môi hữu cơ, khối lượng các cao phân đoạn thu được gồm: 99,83 g cao phân đoạn n-hexan (tỷ lệ 3,33%), 192,32 g cao phân đoạn ethyl acetat (tỷ lệ 6,41%) và 233,94 g cắn nước (tỷ lệ 7,80%).

3. Khóa luận đã phân lập và xác định cấu trúc của những hợp chất nào, với khối lượng bao nhiêu? Tác giả đã phân lập thành công 2 hợp chất alkaloid từ phân đoạn ethyl acetat:

• Hợp chất PL-16A1: Thu được 24,75 g dưới dạng bột màu vàng nhạt, được xác định là piperin (công thức phân tử C17H19NO3, khối lượng phân tử 285 Da).
• Hợp chất PL-I6: Thu được 0,86 g dưới dạng bột màu trắng, được xác định là pipernonalin (công thức phân tử C21H27NO3, khối lượng phân tử 342 Da).

4. Căn cứ phổ nghiệm nào phân biệt được cấu trúc của pipernonalin (PL-I6) so với piperin (PL-16A1)? Phổ khối ESI-MS của PL-I6 cho pic ion giả phân tử tại m/z 343,3 [M+H]+, lớn hơn piperin 56 Da, tương ứng với sự có mặt thêm của 4 nhóm -CH2-. Phổ NMR của PL-I6 xác nhận 4 nhóm methylen này tại δH 1,67; 2,20 ppm và δC 29,0; 29,7; 32,4; 32,7 ppm, đồng thời chỉ ra 2 nối đôi trans bị tách rời về hai phía của mạch carbon thay vì 2 nối đôi liên hợp nằm liền kề như ở cấu trúc của piperin.

5. Vì sao piperin và pipernonalin được đề xuất làm chất chỉ thị chất lượng cho quả Tiêu lốt? Piperin và pipernonalin là hai alkaloid chính chiếm khối lượng lớn nhất trong phân đoạn ethyl acetat của quả Tiêu lốt (24,75 g và 0,86 g từ 3 kg dược liệu), có cấu trúc phân tử xác định, độ tinh khiết cao và mang các hoạt tính sinh học quan trọng của dược liệu, đáp ứng đầy đủ tiêu chí để làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu.

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu nghiên cứu đề ra thông qua việc chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hai alkaloid chính từ quả Tiêu lốt (Piper longum L.) thu hái tại Việt Nam là piperin (24,75 g) và pipernonalin (0,86 g). Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về thành phần hóa học của loài này tại Việt Nam, đóng góp thiết thực cho Đề tài Nghị định thư Việt - Hàn mã số NĐT.KR/20. Đây là nguồn tài liệu khoa học chuẩn xác phục vụ công tác kiểm nghiệm, chuẩn hóa dược liệu và định hướng phân lập sâu các hợp chất tự nhiên trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã c ng nhận dƣợc liệu là thành phần quan trọng trong chăm sóc sức khỏe ban đầu [67]. Ƣớc tính trên thế giới có khoảng 500.000 loài thực vật, trong đó số loài đƣợc nghiên cứu sàng lọc hoạt tính chỉ chiếm khoảng 6%, số loài đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học chiếm khoảng 15% [20]. Tại Việt Nam, có khoảng hơn 4000 loài cây thuốc đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh [3]. Trong những thập kỷ gần đây, con ngƣời có xu hƣớng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ cây cỏ để đ p ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, nền y học cổ truyền ngày càng đƣợc chú trọng và phát triển hơn.

Do dó, cần thiết phải triển khai các nghiên cứu để tạo cơ sở dữ liệu khoa học về cây cỏ làm thuốc và nghiên cứu hiện đại hóa thuốc cổ truyền, góp phần đảm bảo sử dụng cây cỏ làm thuốc một cách an toàn, hiệu quả. Tiêu lốt có tên khoa học là Piper longum L., thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Nam Trung Hoa, Lào, Việt Nam và một số nƣớc khác ở Đ ng Nam Á. Tại Việt Nam, P. longum mọc tƣơng đối phổ biến ở các tỉnh vùng cao nguyên trên toàn quốc, nhất là những tỉnh có vùng núi đ v i.

longum có tính nóng, vị cay, thƣờng đƣợc dùng chữa các bệnh về hô hấp các bệnh về tiêu hóa [2]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng nhƣ t c dụng sinh học của loài này, cho thấy Tiêu lốt có thành phần gồm các alkaloid, lignin, ester, tinh dầu và acid hữu cơ. longum có nhiều tác dụng sinh học nhƣ chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch, kháng khuẩn và chống viêm,…[71]. Tuy nhiên cho đến nay chƣa có b o c o nào về thành phần hóa học của Tiêu lốt thu hái ở Việt Nam.

Vì vậy, để góp phần cung cấp cơ sở khoa học về thành phần hóa học cho những nghiên cứu sau này về loài P. longum thu hái ở Việt Nam, khóa luận đã đƣợc triển khai với đề tài: “Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ quả Tiêu lốt (Piper longum L. với 2 mục tiêu: 1. Chiết xuất, phân lập đƣợc 2 hợp chất từ quả Tiêu lốt.

Xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 2 hợp chất phân lập đƣợc từ quả Tiêu lốt. 1 Luan van CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về chi Piper Chi Piper thuộc họ Piperaceae có hơn 700 loài phân bố ở cả hai bán cầu, chủ yếu là ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Về đặc điểm thực vật, chúng có thể là những cây thân thảo, cây bụi, dây leo hoặc cây gỗ.

Thân có đốt lớn. Hoa đơn tính, nhỏ, không có l đài và c nh hoa, l bắc hình cầu và không có cuống. Hoa mọc thành cụm trên mỗi đốt của thân và đối diện với lá. Quả mọng, hình cầu hoặc hình elip, không cuống hoặc có cuống nhỏ [60,76].

Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Piper cho thấy sự xuất hiện của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng, tiêu biểu nhất là alkaloid. Hơn 592 hợp chất kh c nhau đã đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Piper, trong đó có 145 hợp chất là alkaloid và amid, 47 hợp chất là lignan, 70 hợp chất neolignan, 89 hợp chất terpen. Ngoài ra còn một số thành phần kh c nhƣ là propenylphenol, steroid, kawapyrones, piperolides, chalcones, dihydrochalcones, flavon và flavanones [76]. Các loài thuộc chi Piper mang lại nhiều tiềm năng trong thƣơng mại, kinh tế và y học, nhất là hệ thống y học Ayurvedic của Ấn Độ.