Tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger

Tìm hiểu quy trình tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger trong nghiên cứu dược phẩm.

• Tác giả: Trần Thị Hoa Mai
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Mai Anh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Chiết Xuất Và Tinh Sạch Chất Ức Chế Alpha Glucosidase Từ Aspergillus Niger
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Bệnh Đái tháo đường
• 1.1.1. Khái niệm
• 1.1.2. Phân loại
• 1.2. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng
• 1.2.1. Cơ chế của ĐTĐ typ 1
• 1.2.2. Cơ chế của ĐTĐ typ 2
• 1.2.3. Biến chứng của ĐTĐ
• 1.3. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường
• 1.3.1. Mục tiêu điều trị
• 1.3.2. Điều trị ĐTĐ typ 1
• 1.3.3. Điều trị ĐTĐ typ 2
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về chiết xuất chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger

Chiết xuất và tinh sạch chất ức chế alpha glucosidase từ nấm Aspergillus niger đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong điều trị bệnh đái tháo đường. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát hiện ra các hoạt chất mới mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị an toàn và hiệu quả. Aspergillus niger là một trong những chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp các chất ức chế enzym alpha glucosidase, giúp kiểm soát đường huyết sau ăn. Việc chiết xuất và tinh sạch các hoạt chất này từ nấm sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ của các thuốc hiện có.

1.1. Khái niệm về chất ức chế alpha glucosidase

Chất ức chế alpha glucosidase là những hợp chất có khả năng làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thu carbohydrate, từ đó giúp giảm đường huyết sau ăn. Các chất này thường được sử dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường typ 2, giúp bệnh nhân kiểm soát tốt hơn mức đường huyết của mình.

1.2. Vai trò của Aspergillus niger trong nghiên cứu

Aspergillus niger là một trong những chủng nấm phổ biến được nghiên cứu để chiết xuất các chất ức chế alpha glucosidase. Nấm này có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzyme và hoạt chất có lợi, giúp mở rộng khả năng điều trị bệnh đái tháo đường.

II. Thách thức trong việc chiết xuất và tinh sạch chất ức chế alpha glucosidase

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc chiết xuất và tinh sạch chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như lựa chọn dung môi tách chiết, điều kiện nuôi cấy và quy trình tinh sạch đều ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận hoạt chất. Ngoài ra, việc xác định hoạt tính của các chất chiết xuất cũng cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo tính hiệu quả trong điều trị.

2.1. Vấn đề lựa chọn dung môi tách chiết

Lựa chọn dung môi tách chiết là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả chiết xuất chất ức chế alpha glucosidase. Các dung môi khác nhau sẽ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và thu nhận hoạt chất từ nấm.

2.2. Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính

Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy có thể ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất.

III. Phương pháp chiết xuất và tinh sạch chất ức chế alpha glucosidase

Để chiết xuất và tinh sạch chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất lỏng-lỏng, sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ giúp tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

3.1. Phương pháp chiết xuất lỏng lỏng

Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng là một trong những kỹ thuật phổ biến để thu nhận chất ức chế alpha glucosidase. Kỹ thuật này cho phép tách biệt các hợp chất dựa trên độ hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau.

3.2. Sắc ký cột trong tinh sạch hoạt chất

Sắc ký cột là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch các hoạt chất chiết xuất từ nấm. Phương pháp này giúp loại bỏ các tạp chất và thu nhận các hợp chất có hoạt tính cao, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

IV. Ứng dụng thực tiễn của chất ức chế alpha glucosidase

Chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger có nhiều ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh đái tháo đường. Các nghiên cứu cho thấy rằng các chất này không chỉ giúp kiểm soát đường huyết mà còn có thể giảm thiểu các biến chứng liên quan đến bệnh. Việc phát triển các sản phẩm từ chất ức chế này có thể mang lại lợi ích lớn cho bệnh nhân đái tháo đường.

4.1. Tác dụng của chất ức chế alpha glucosidase trong điều trị

Chất ức chế alpha glucosidase giúp làm giảm đường huyết sau ăn, từ đó giảm nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân đái tháo đường. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng các chất này có thể cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.2. Kết quả nghiên cứu về hoạt chất từ Aspergillus niger

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hoạt chất chiết xuất từ Aspergillus niger có hoạt tính ức chế alpha glucosidase mạnh mẽ. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả hơn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu chất ức chế alpha glucosidase

Nghiên cứu về chiết xuất và tinh sạch chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger đang mở ra nhiều cơ hội mới trong điều trị bệnh đái tháo đường. Với những kết quả khả quan từ các nghiên cứu hiện tại, tương lai của lĩnh vực này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều sản phẩm điều trị an toàn và hiệu quả hơn cho bệnh nhân. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chất ức chế mới từ nguồn gốc sinh học sẽ là một xu hướng quan trọng trong y học hiện đại.

5.1. Xu hướng nghiên cứu trong tương lai

Xu hướng nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc phát triển các chất ức chế alpha glucosidase mới từ các nguồn gốc sinh học khác nhau. Điều này không chỉ giúp mở rộng danh sách các sản phẩm điều trị mà còn nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu chất ức chế alpha glucosidase

Nghiên cứu chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển thuốc điều trị bệnh đái tháo đường mà còn góp phần vào việc nâng cao hiểu biết về cơ chế hoạt động của các chất này trong cơ thể.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là một rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết kéo dài, bắt nguồn từ sự suy giảm tiết insulin, đề kháng insulin hoặc phối hợp cả hai cơ chế. Theo số liệu của Hiệp hội Đái tháo đường Thế giới (IDF) công bố năm 2021, toàn cầu có khoảng 537 triệu người trưởng thành mắc bệnh đái tháo đường và dự báo con số này sẽ tăng lên 783 triệu người vào năm 2045. ĐTĐ hiện được xem là đại dịch không lây nhiễm nguy hiểm với tỷ lệ tử vong đứng thứ ba thế giới, chỉ sau nhóm bệnh ung thư và tim mạch. Tình trạng tăng đường huyết mạn tính gây tổn thương hệ thống mạch máu, dẫn đến nhiều biến chứng nặng nề tại mắt, thận, thần kinh và tim mạch; đồng thời người bệnh ĐTĐ còn đối mặt với nguy cơ tiên lượng nặng và gia tăng biến chứng khi mắc các bệnh nhiễm trùng như COVID-19.

Trong phác đồ điều trị đái tháo đường typ 2, nhóm thuốc ức chế enzym alpha-glucosidase (Alpha-Glucosidase Inhibitors - AGIs) giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự gia tăng đường huyết sau bữa ăn. Cơ chế của nhóm này là ức chế cạnh tranh enzym thủy phân carbohydrat tại diềm bàn chải ruột non, làm chậm quá trình phân giải oligosaccharid thành glucose tự do và kích thích bài tiết GLP-1 mà không gây ra biến chứng hạ đường huyết đột ngột. Tuy nhiên, các thuốc AGIs thương mại có nguồn gốc tổng hợp hóa dược hiện nay (như acarbose, miglitol, voglibose) thường đi kèm các tác dụng phụ trên đường tiêu hóa (đầy hơi, ợ hơi, tiêu chảy) và tiềm ẩn nguy cơ tổn thương gan do tăng transaminase (AST, ALT). Thực trạng đó thúc đẩy xu hướng nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất AGIs tự nhiên từ vi sinh vật, đặc biệt là vi nấm, nhờ ưu điểm phát triển nhanh, an toàn sinh học và hiệu quả kinh tế cao.

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu các hợp chất ức chế alpha-glucosidase sinh tổng hợp từ chi nấm sợi Aspergillus còn hạn chế, chủ yếu mới ở giai đoạn sàng lọc ban đầu. Nhằm kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu trong khuôn khổ dự án "Phân lập, tuyển chọn và tinh sạch một số hoạt chất thứ cấp mới ức chế α-glucosidase định hướng ứng dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường typ II từ các chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam" (Mã số 01/19-21), khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Trần Thị Hoa Mai tập trung vào đề tài "Tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger".

Nhiệm vụ của nghiên cứu được cụ thể hóa thành 02 mục tiêu chính:

1. Lựa chọn được dung môi tách chiết hợp chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger VTCC 031.
2. Lựa chọn được điều kiện tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger VTCC 031.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm sợi Aspergillus niger VTCC 031 do Trung tâm Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia (VTCC) – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 06 năm 2022.
• Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa Sinh (Trường Đại học Dược Hà Nội) phối hợp cùng Phòng Công nghệ sinh học Enzym và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen (Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về enzym học, hóa học hợp chất tự nhiên và kỹ thuật chiết tách - sắc ký sinh học:

• Khung lý thuyết và mô hình sinh học: Enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) có cấu trúc gồm hai tiểu phần N tận và C tận với khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, thuộc nhóm GH31 phân nhóm 1 chứa chuỗi bảo thủ WiDMNE tại trung tâm xúc tác. Enzym xúc tác phản ứng exohydrolysis thủy phân liên kết α-1,4-glycosid ở đầu không khử của carbohydrat giải phóng α-D-glucose. Chủng nấm Aspergillus niger (lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae) là loài nấm vi sợi hiếu khí đạt tiêu chuẩn an toàn GRAS của FDA, có khả năng sinh tổng hợp dồi dào enzym ngoại bào và các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học.
• Quy trình nuôi cấy và sinh tổng hợp: Chủng A. niger VTCC 031 được hoạt hóa trên môi trường thạch PDA (bột khoai tây 20%, D-glucose 2%, agar 2%, pH 7) ở 30°C trong 72 giờ. Quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất được thực hiện trong môi trường lỏng gồm 5% D-glucose và 1% cao malt (pH 5), nuôi cấy ở 37°C, lắc 200 vòng/phút trong 7 ngày, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút để thu dịch lên men ngoại bào.
• Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase: Thực hiện theo phương pháp đo quang của Kim và cộng sự trên phiến vi thể với máy đọc ELISA reader ở bước sóng 405 nm. Phản ứng sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG 5 mM trong đệm natri phosphat 0,1 M, pH 6,9) và enzym α-glucosidase (1-2 U/ml). Cơ chất bị enzym thủy phân tạo ra p-nitrophenol màu vàng. Mức độ ức chế enzym được tính toán thông qua sự giảm mật độ quang OD405 so với mẫu đối chứng sau 5 phút phản ứng ở 37°C.
• Phương pháp chiết tách và tinh sạch:
  • Chiết lỏng - lỏng: Khảo sát chiết dịch ngoại bào với 5 dung môi hữu cơ có độ phân cực giảm dần gồm n-butanol, ethyl acetat, chloroform, dịchloromethan và n-hexan (tỷ lệ 1:1, chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng, lắc 2 giờ) để phân tách thành pha nước và pha dung môi hữu cơ.
  • Sắc ký lọc gel (cho pha nước): Đưa dịch chiết pha nước lên 3 hệ cột lọc gel kích thước khác nhau (Sephacryl S-200, Sephadex G-100, Sephadex G-25), cân bằng bằng nước cất, rửa giải bằng đệm phosphat 0,05 M với tốc độ dòng 25 ml/giờ; thu thập 12 phân đoạn (1,5 ml/phân đoạn).
  • Sắc ký cột Silica gel 60 (cho pha dung môi): Cắn chiết n-butanol được hòa tan trong chloroform, ly tâm loại tạp, cô quay thu cắn rồi hòa tan trong methanol trước khi nạp lên cột sắc ký Silica gel 60 (kích thước 52 x 2 cm). Pha động được lựa chọn qua khảo sát 5 hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng (TLC).
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck). Đối với pha nước, hệ dung môi khai triển là Isopropanol : Acid acetic : Nước (4:1:1), hiện màu bằng thuốc thử ninhydrin 2%. Đối với pha dung môi, hệ dung môi khai triển là n-BuOH : Acid acetic : EtOAc : Nước (3:1:3:1), hiện màu bằng hơi iod.
  • Phương pháp xác định giá trị IC50: Mẫu sau khi cạo vết TLC được pha loãng ở các dải nồng độ khác nhau trong DMSO, đo hoạt tính ức chế enzym, dựng đường chuẩn hồi quy tuyến tính trong Microsoft Excel 2016 và tính toán giá trị nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym (IC50) so sánh với chất đối chứng dương acarbose tinh khiết (Sigma).

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học về bệnh đái tháo đường, sinh lý bệnh học của ĐTĐ typ 1 và typ 2, các biến chứng cấp/mạn tính và mục tiêu điều trị theo hướng dẫn của Bộ Y tế và ADA. Tác giả trình bày cấu trúc hóa học, vị trí phân bố và vai trò sinh học của enzym α-glucosidase ở bờ bàn chải ruột non. Tiếp đó, tổng quan phân tích cơ chế tác dụng, phân loại các chất AGIs (nhóm giả đường monosaccharid và nhóm phi glycosyl như imidazole, pyrazole, chromones), so sánh nguồn cung cấp AGIs từ thực vật (alkaloid, flavonoid, DNJ) và từ vi sinh vật (Actinoplanes sp., Bacillus subtilis, Streptomyces). Chương tổng quan cũng đi sâu vào đặc điểm phân loại học, hình thái sợi nấm, điều kiện sinh trưởng của Aspergillus niger, đồng thời cập nhật tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính ức chế α-glucosidase từ chi Aspergillus (như butyrolactone I từ A. terreus, peptid từ A. awamori và A. oryzae, các alkaloid từ A. fumigatus).

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi sinh vật A. niger VTCC 031, danh mục hóa chất tinh khiết, hệ thống trang thiết bị thí nghiệm và thành phần các môi trường nuôi cấy (môi trường hoạt hóa PDA và môi trường lên men lỏng glucose 5% - cao malt 1%). Chương này thiết lập chi tiết quy trình thực nghiệm gồm: sơ đồ nuôi cấy sinh tổng hợp; kỹ thuật đo quang xác định hoạt tính ức chế enzym bằng cơ chất pNPG; quy trình chiết lỏng - lỏng khảo sát 5 dung môi hữu cơ; kỹ thuật sắc ký lọc gel trên 3 loại gel Sephacryl S-200, Sephadex G-100, Sephadex G-25; quy trình sắc ký cột hấp phụ Silica gel 60; khảo sát 5 hệ dung môi pha động chạy TLC; phương pháp cạo tách vết phân đoạn trên bản mỏng; và quy trình toán học xử lý số liệu xác định phương trình hồi quy, đường chuẩn IC50.

Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được và phân tích các phát hiện khoa học:

1. Sinh tổng hợp hoạt chất: Dịch lên men ngoại bào của chủng A. niger VTCC 031 sau 7 ngày nuôi cấy thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 67,24% (độ biến thiên mật độ quang ΔAtn = 0,006 so với đối chứng ΔAđc = 0,019).
2. Lựa chọn dung môi tách chiết: Trong 5 dung môi khảo sát, n-butanol cho hiệu quả chiết hoạt chất ở pha dung môi cao nhất với hoạt tính ức chế đạt 37,50% (các dung môi khác chỉ đạt 8,82% - 25,46%). Ở pha nước còn lại sau chiết lỏng - lỏng, mẫu chiết với ethyl acetat giữ lại hoạt tính ức chế cao nhất, đạt 64,71% (các mẫu khác đạt 55,15% - 58,41%).
3. Tinh sạch pha nước: Khảo sát qua 3 cột lọc gel cho thấy các phân đoạn từ số 5 đến 10 có hoạt tính ức chế rõ rệt, trong đó phân đoạn 6 - 8 đạt đỉnh hoạt tính cao nhất. Cột Sephadex G-25 cho khả năng tách loại tạp và cho các vết sắc ký gọn, rõ ràng nhất trên bản mỏng TLC so với Sephacryl S-200 và Sephadex G-100. Thuốc thử ninhydrin 2% cho phản ứng bắt màu tím/hồng, gợi ý các hoạt chất AGIs trong pha nước có bản chất là peptid hoặc protein phân tử lượng thấp.
4. Khảo sát hệ dung môi chạy cột Silica gel: Trong 5 hệ dung môi pha động chạy TLC, hệ (III) gồm n-BuOH : Acid acetic : EtOAc : H2O (tỷ lệ thể tích 3:1:3:1) được lựa chọn do phân tách vết rõ nét, vết gọn gàng và hạn chế độc tính so với hệ chứa n-hexan.
5. Tinh sạch pha dung môi và xác định IC50: Qua cột Silica gel 60 lần 1, phân đoạn số 11 được chọn để chạy sắc ký bản mỏng lặp lại 10 lần và cạo 3 vết hiển thị với hơi iod. Kết quả đo hoạt tính cho thấy chỉ có vết TLC2 (Rf = 0,65) thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 39,31%, trong khi vết TLC1 (Rf = 0,24) và TLC3 (Rf = 0,94) hầu như không có hoạt tính.
6. Bàn luận khoa học: Tác giả thảo luận về sự phân bố hoạt chất ở cả hai pha (pha nước chứa protein/peptid, pha hữu cơ chứa các chất chuyển hóa thứ cấp ít phân cực). Việc hoạt tính ức chế giảm dần qua các bước tinh chế (từ dịch thô 67,24% xuống còn 39,31% ở mẫu TLC2) phản ánh trong dịch lên men ban đầu có sự cộng hưởng của nhiều chất có hoạt tính đã bị loại bỏ bớt trong quá trình tách phân đoạn.

Giai đoạn tinh chế	Khối lượng cắn khô (g)	Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)
Dịch lên men ban đầu	2,52	67,24
Dịch chiết n-butanol	1,23	37,50
Vết cạo TLC2	0,0005	39,31

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và kiểm chứng các số liệu thực nghiệm cụ thể sau:

• Xác định được chủng vi nấm Aspergillus niger VTCC 031 có khả năng sinh tổng hợp ngoại bào các chất ức chế α-glucosidase với hoạt tính của dịch thô đạt 67,24%.
• Xác định được dung môi tối ưu cho quá trình chiết lỏng - lỏng: n-butanol là dung môi tốt nhất để thu nhận hoạt chất vào pha hữu cơ (hoạt tính 37,50%); ethyl acetat là dung môi thích hợp nhất để loại bớt tạp kém phân cực và giữ hoạt chất phân cực lại trong pha nước (hoạt tính 64,71%).
• Xác định cột Sephadex G-25 là hệ gel phù hợp nhất để tách sơ bộ các hoạt chất ức chế có bản chất peptid/protein phân tử lượng thấp từ pha nước.
• Xác định hệ dung môi pha động n-butanol : acid acetic : ethyl acetat : nước (3:1:3:1) là hệ tối ưu để chạy sắc ký cột Silica gel 60 và sắc ký lớp mỏng TLC đối với pha dung môi hữu cơ.
• Phân lập được phân đoạn hoạt chất TLC2 (Rf = 0,65) từ phân đoạn 11 sau cột Silica gel lần 1, có hoạt tính ức chế enzym đạt 39,31%.
• Dựng đường chuẩn hồi quy và xác định được giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) của mẫu TLC2 là 7873,72 µg/ml, so sánh với đối chứng dương acarbose tinh khiết có IC50 là 30,83 µg/ml.

Mẫu thí nghiệm	Dải nồng độ khảo sát (µg/ml)	Hoạt tính ức chế tương ứng (%)	Giá trị IC50 (µg/ml)
Mẫu TLC2	333,33 – 1666,67	2,08 – 10,35	7873,72
Acarbose chuẩn	10,00 – 90,00	34,18 – 90,31	30,83

Đóng góp khoa học của khóa luận:

• Cung cấp quy trình thực nghiệm bước đầu trong việc chiết xuất và phân đoạn làm sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng vi nấm bản địa A. niger VTCC 031 tại Việt Nam.
• Khẳng định khả năng sinh tổng hợp đồng thời hai nhóm hoạt chất AGIs ở chủng vi nấm này: nhóm chất phân cực tan trong nước (bản chất peptid/protein) và nhóm chất thứ cấp phân cực trung bình - yếu tan trong dung môi hữu cơ.
• Đóng góp dữ liệu tiền lâm sàng quan trọng cho chuỗi đề tài phát triển nguồn dược liệu sinh học mới hỗ trợ điều trị đái tháo đường typ 2.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế do điều kiện thời gian và trang thiết bị thực nghiệm:

• Quá trình tinh sạch ở pha dung môi mới dừng lại ở bước sắc ký cột Silica gel 60 lần 1; mẫu hoạt chất TLC2 thu được bằng phương pháp cạo bản mỏng thủ công nên khối lượng thu nhận rất nhỏ (0,0005 g) và chưa loại bỏ triệt để tạp chất, dẫn đến giá trị IC50 còn tương đối cao so với chất chuẩn.
• Đối với pha nước, nghiên cứu mới nhận diện sơ bộ sự có mặt của peptid/protein qua phản ứng màu với ninhydrin mà chưa tiến hành điện di xác định khối lượng phân tử hay định lượng hàm lượng protein cụ thể.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Tiếp tục khảo sát và tối ưu hóa hệ dung môi để tiến hành sắc ký cột Silica gel lần 2, kết hợp kỹ thuật sắc ký pha đảo và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm thu nhận hoạt chất ở độ tinh khiết cao hơn.
• Với pha nước: Sử dụng hệ màng lọc/cột cut-off có kích thước dưới 5 kDa để phân tách nhóm peptid; kết hợp sắc ký trao đổi ion, điện di gel (SDS-PAGE) và định lượng protein.
• Tiến hành phân tích cấu trúc hóa học của các hoạt chất tinh sạch thông qua các phương pháp phổ hiện đại như khối phổ (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên sau đại học ngành Dược học, Công nghệ sinh học, Hóa sinh và Hóa học các hợp chất tự nhiên khi tiếp cận phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro và kỹ thuật tinh chế hợp chất vi sinh.
• Cán bộ nghiên cứu đang thực hiện các đề tài về hoạt chất sinh học từ vi nấm, đặc biệt là quy trình lên men, chiết lỏng - lỏng phân đoạn và kỹ thuật sắc ký lọc gel (Sephadex, Sephacryl) kết hợp sắc ký hấp phụ pha thuận (Silica gel).
• Phần giá trị tham khảo chuyên sâu: Quy trình pha chế dung dịch đệm, kỹ thuật thiết lập phản ứng enzym trên đĩa vi thể ELISA đo bước sóng 405 nm và bảng khảo sát hệ dung môi pha động cho bản mỏng TLC (Mục 2.3, 2.4 và Mục 3.2, 3.3).

Câu hỏi thường gặp

1. Hoạt tính ức chế alpha-glucosidase của dịch lên men chủng Aspergillus niger VTCC 031 ban đầu đạt bao nhiêu? Dịch lên men ngoại bào của chủng A. niger VTCC 031 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường chứa 5% D-glucose và 1% cao malt (pH 5, 37°C, lắc 200 rpm) đạt hoạt tính ức chế α-glucosidase là 67,24%.

2. Khi chiết lỏng - lỏng, dung môi hữu cơ nào cho hiệu quả tách chiết hoạt chất cao nhất ở pha dung môi? Dung môi n-butanol cho hiệu quả tách chiết cao nhất ở pha dung môi với hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 37,50%, vượt trội so với ethyl acetat (25,46%), chloroform (10,50%), dichloromethan (10,00%) và n-hexan (8,82%).

3. Ở pha nước, loại cột sắc ký lọc gel nào cho khả năng phân tách hoạt chất tốt nhất? Cột Sephadex G-25 cho khả năng tách loại tạp và hiển thị các vết sắc ký gọn, rõ ràng nhất trên bản mỏng TLC so với hai cột Sephacryl S-200 và Sephadex G-100; các phân đoạn có hoạt tính ức chế cao nhất tập trung ở phân đoạn số 6 đến số 8.

4. Hệ dung môi pha động nào được lựa chọn để tinh sạch hoạt chất pha hữu cơ qua cột sắc ký Silica gel 60? Hệ dung môi được lựa chọn là n-butanol : acid acetic : ethyl acetat : nước với tỷ lệ thể tích tương ứng 3:1:3:1 (Hệ III), do cho khả năng phân tách vết rõ ràng, không bị kéo vệt và ít độc hại hơn hệ chứa n-hexan.

5. Giá trị IC50 của hoạt chất thu được từ vết TLC2 là bao nhiêu khi so sánh với đối chứng dương acarbose? Mẫu TLC2 (Rf = 0,65) có giá trị IC50 là 7873,72 µg/ml, cao hơn nhiều so với chất đối chứng dương là acarbose tinh khiết (IC50 = 30,83 µg/ml) do mẫu mới ở bước tinh sạch sơ bộ lần 1 và còn chứa tạp chất.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thị Hoa Mai đã khảo sát thành công quy trình chiết tách và bước đầu tinh sạch các hoạt chất ức chế α-glucosidase từ dịch lên men chủng nấm sợi Aspergillus niger VTCC 031. Nghiên cứu đã xác định được n-butanol và ethyl acetat là các dung môi thích hợp cho quá trình chiết lỏng - lỏng, đồng thời lựa chọn được cột lọc gel Sephadex G-25 (cho pha nước) và hệ dung môi n-BuOH : Acid acetic : EtOAc : H2O (3:1:3:1) trên cột Silica gel 60 (cho pha dung môi hữu cơ). Kết quả phân lập được vết hoạt chất TLC2 có hoạt tính ức chế 39,31% với giá trị IC50 là 7873,72 µg/ml là tiền đề khoa học quan trọng để tiếp tục tối ưu hóa quy trình tinh chế sâu và xác định cấu trúc hóa học của các chất chuyển hóa thứ cấp hướng tới ứng dụng điều trị bệnh đái tháo đường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), một bệnh rối loạn chuyển hóa mạn tính, tăng nhanh liên tục đã khiến cho căn bệnh này trở thành vấn đề sức khỏe toàn cầu và là một gánh nặng kinh tế cho rất nhiều quốc gia trên toàn thế giới. Năm 2021, theo báo cáo của Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (IDF) số người trưởng thành mắc đái tháo đường là 537 triệu người và xu hướng sẽ tăng lên 783 triệu người vào năm 2045 [31], [12], [27]. ĐTĐ đã được xem là một đại dịch không lây nhiễm với tỷ lệ tử vong xếp hàng thứ 3 chỉ sau bệnh ung thư và tim mạch. Theo các nghiên cứu gần đây, ĐTĐ được coi là một trong những yếu tố không những làm tăng nguy cơ nhiễm trùng máu mà còn thúc đẩy sự tiến triển nhanh chóng và nguy cơ tiên lượng nặng ở bệnh nhân mắc COVID-19 [4].

Các chất ức chế alpha glucosidase (AGIs) được sử dụng khá rộng rãi trên lâm sàng để điều trị ĐTĐ typ 2 với mục đích làm giảm đường huyết sau ăn, bảo vệ bệnh nhân tránh khỏi các biến chứng tim mạch và do đó giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân ĐTĐ do biến chứng nguy hiểm này. Mặc dù, các AGIs truyền thống như acarbose và voglibose có thể kiểm soát tốt đường huyết sau ăn, tuy nhiên những tác dụng không mong muốn của những thuốc này cũng phần nào hạn chế việc sử dụng chúng trên lâm sàng. Do đó, trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học rất nỗ lực để tìm kiếm những AGIs mới, vừa có tác dụng điều trị tốt mà lại ít tác dụng không mong muốn. Bên cạnh nguồn tổng hợp Hóa Dược, xu hướng hiện nay trên thế giới và cả ở Việt Nam là quan tâm và chú trọng việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc hạ đường huyết có nguồn gốc sinh học, đặc biệt là sinh tổng hợp các chất từ nấm và vi khuẩn.

Trong số các vi sinh vật tiềm năng, nấm Aspergillus là một trong các chủng đang được nghiên cứu sinh tổng hợp các chất ức chế enzym α-glucosidase ứng dụng để điều trị bệnh ĐTĐ [19]. Mặc dù vậy, tại Việt Nam, các nghiên cứu cứu về hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ chủng Aspergillus còn khá hạn chế, cho đến nay mới có một số nghiên cứu của Phạm Minh Hồng (2020) [5], Bùi Hồng Sơn (2021) [6], bước đầu nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger. Chính vì vậy, đề tài “Tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger” được tiến hành để mở rộng nghiên cứu chủng nấm tiềm năng này tại Việt Nam, giúp mở ra hướng điều trị ĐTĐ mới an toàn, hiệu quả. Đề tài được tiến hành nhằm đạt được 2 mục tiêu sau: 1.

Lựa chọn được dung môi tách chiết hợp chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. Lựa chọn được điều kiện tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. Bệnh Đái tháo đường 1. Khái niệm Theo hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ, bệnh Đái tháo đường (ĐTĐ) là một tập hợp những rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi sự tăng glucose huyết do suy giảm sản xuất insulin và/hoặc do không đáp ứng với insulin tại các mô.

Sự tăng glucose huyết mạn tính trong ĐTĐ có liên quan mật thiết với những tổn thương lâu dài, rối loạn và suy giảm chức năng của nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim mạch và mạch máu [8]. Phân loại Theo phân loại của ADA năm 2021 ĐTĐ được chia làm 4 loại [12]: - ĐTĐ typ 1 (phụ thuộc insulin): Chiếm khoảng 5-10% trong số người mắc bệnh ĐTĐ. ĐTĐ typ 1 xảy ra do tế bào β đảo tụy bị phá hủy, nên bệnh nhân không còn hoặc rất ít insulin gây ra thiếu insulin tuyệt đối. Nguyên nhân thường 95% do cơ chế tự miễn (typ 1A) và 5% vô căn (typ 1B).

Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu là ở trẻ em và thanh thiếu niên. - ĐTĐ typ 2 (không phụ thuộc insulin) Thường được gọi là ĐTĐ của người lớn tuổi hay ĐTĐ không phụ thuộc insulin với tỷ lệ chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ. Nguyên nhân do giảm bài tiết insulin tương đối của tiểu đảo tụy kết hợp với hiện tượng kháng insulin ở mô. - ĐTĐ thai kỳ (GDM): ĐTĐ thai kì được định nghĩa là bất cứ rối loạn dung nạp glucose huyết nào khởi phát hoặc lần đầu tiên được chẩn đoán phát hiện trong thời kì mang thai ở trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ typ 1, typ 2 trước đó.

Khoảng 7% phụ nữ có thai mắc phải ĐTĐ thai kì. - Các loại ĐTĐ đặc biệt do các nguyên nhân khác như: Giảm chức năng tế bào beta do khiếm khuyết gen MODY(maturity Onset Diabetes of the young- khởi phát ở người trẻ tuổi, thường trước 25 tuổi). Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen INSR. Bệnh lý tụy ngoại tiết: viêm tụy, chấn thương, cắt bỏ tụy, ung thư tụy.

Bệnh nội tiết (to đầu chi, hội chứng cushing, u tiết glucagon, u tủy thượng thận tăng tiết catecholamin, cường giáp, u tiết somatostatin, u tiết aldosteron). ĐTĐ do sử dụng thuốc và hóa chất: glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép mô,… 2 1. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng 1. Cơ chế của ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 1 được coi là một trong hơn 80 bệnh được có nguyên nhân do cơ chế tự miễn dịch, do hậu quả của sự phá hủy cơ quan miễn dịch của các tế bào sản xuất insulin trong các tế bào đảo tụy của Langerhans [9].

Trước tiên, do sự phá vỡ cơ chế điều hòa miễn dịch, dẫn đến mở rộng các tế bào T-CD4 và T-CD8 [14], [21], [25], tế bào lympho B sản xuất tự kháng thể [24], [29], [48] và kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh để tiêu diệt các tế bào β-tiểu đảo Langerhans sản xuất insulin [18], [59] gây ra ĐTĐ typ 1. Bệnh ĐTĐ typ 1 phát triển do sự kết hợp của khuynh hướng di truyền, các yếu tố môi trường và các sự kiện ngẫu nhiên. Vì nhiều lý do, được cho là liên quan đến vệ sinh dân số, tiếp xúc với ánh nắng mặt trời và các yếu tố môi trường khác, tỷ lệ mắc bệnh đã tăng mạnh trong hai thập kỷ qua, đặc biệt là ở trẻ em dưới 5 tuổi [26]. Những người dưới 18 tuổi thường mắc ĐTĐ typ 1 [38], nhưng cũng có một số lượng người trên 18 tuổi [13].

Cơ chế của ĐTĐ typ 2 Đái tháo đường typ 2 là một rối loạn không đồng nhất do sự kết hợp của các yếu tố di truyền liên quan đến suy giảm bài tiết insulin, kháng insulin và các yếu tố môi trường như béo phì, ăn quá nhiều, lười vận động, căng thẳng cũng như lão hóa. ĐTĐ typ 2 điển hình là một bệnh đa yếu tố liên quan đến nhiều gen và các yếu tố môi trường [27]. Trong điều kiện sinh lý bình thường, nồng độ glucose huyết tương được duy trì trong một phạm vi hẹp, bất chấp sự biến động lớn về cung và cầu, thông qua sự tương tác giữa mô nhạy cảm với insulin (đặc biệt là ở gan) và bài tiết insulin. Trong ĐTĐ typ 2 những cơ chế trên bị phá vỡ, gây ra hậu quả là suy giảm bài tiết insulin do rối loạn chức năng của tế bào β tuyến tụy và suy giảm hoạt động của insulin thông qua kháng insulin [27].

Theo một nghiên cứu chỉ ra rằng ĐTĐ typ 2 ảnh hưởng 1-2% người da trắng và tỷ lệ này cao hơn nhiều ở một số nhóm dân tộc như người da đỏ Pima và người Ả Rập và tiếp cận đến 50% ở Nam Ấn Độ [43]. Biến chứng của ĐTĐ ĐTĐ gây ra những biến chứng nguy hiểm cấp tính và mạn tính. Biến chứng cấp tính thường gặp là nhiễm toan ceton, nhiễm toan lactic, hạ đường huyết, tăng áp lực thẩm thấu. Khi mức đường huyết trong máu cao lâu dài có thể dẫn đến các biến chứng mạn tính gây ra bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến tim, mạch máu, mắt, thận, thần kinh,.

Theo một nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ tổn thương thần kinh do ĐTĐ là thường gặp nhất, chiếm 40-45% số bệnh nhân mắc ĐTĐ; bên cạnh đó sự xuất hiện của bệnh thận ở khoảng 20-40% thay đổi tùy theo sắc tộc, quốc gia [1]. Đây là nguyên nhân hàng đầu gây suy thận giai đoạn cuối, cần phải lọc thận và ghép thận ở các nước phát triển. Người lớn mắc 3 ĐTĐ có nguy cơ tăng gấp 2-3 nhồi máu cơ tim và đột quỵ. Bệnh võng mạc tiểu đường là một nguyên nhân quan trọng gây mù có khoảng 2,6% bệnh mù toàn cầu có thể là do ĐTĐ [1].

Do các biến chứng nghiêm trọng của ĐTĐ nên việc duy trì mức đường máu, huyết áp và cholesterol bình thường hoặc gần bình thường có thể giúp trì hoãn hoặc ngăn ngừa các biến chứng ĐTĐ. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường 1. Mục tiêu điều trị ĐTĐ là bệnh rối loạn chuyển hóa có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan trong cơ thể. Do vậy, trong điều trị ĐTĐ các mục tiêu quan trọng cần kiểm soát là: giảm đường huyết, đạt cân nặng hợp lý, làm chậm xuất hiện các biến chứng và nâng cao chất lượng đời sống của bệnh nhân.

Ngoài ra còn kiểm soát các chỉ tiêu về lipid huyết, huyết áp, chỉ số khối cơ thể [1]. Mục tiêu điều trị ĐTĐ ở người trưởng thành, không có thai được trình bày ở Bảng 1. Mục tiêu điều trị cho BN ĐTĐ ở người trưởng thành, không có thai Mục tiêu Chỉ số HbA1c < 7% (53mmol/mol) Glucose huyết tương 80-130 mg/dL (4,4-7,2 mmol/L)* lúc đói, trước ăn Đỉnh glucose huyết <180 mg/dL (10,0 mmol/L)* tương sau ăn 1-2 giờ Huyết áp Tâm thu <140 mmHg, Tâm trương <90 mmHg Nếu đã có biến chứng thận, hoặc có yếu tố nguy cơ tim mạch do xơ vữa cao: Huyết áp <130/80 mmHg Lipid máu LDL cholesterol <100 mg/dL (2,6 mmol/L), nếu chưa có biến chứng tim mạch LDL cholesterol <70 mg/dL (1,8 mmol/L) nếu đã có bệnh tim mạch vữa xơ, hoặc có thể thấp hơn <50 mg/dL nếu có yếu tố nguy cơ xơ vữa cao Triglycerid <150 mg/dL (1,7 mmol/L) HDL cholesterol >40 mg/dL (1,0 mmol/L) ở nam và >50 mg/dL (1,3 mmol/L) ở nữ * Mục tiêu điều trị ở các cá nhân có thể khác nhau [1]: - Mục tiêu có thể thấp hơn (HbA1c <6,5%) ở BN trẻ, mới chẩn đoán, không có các bệnh lý tim mạch, nguy cơ hạ glucose máu thấp. 4 - Ngược lại, mục tiêu có thể cao hơn (HbA1c từ 7,5 – 8%) ở những BN lớn tuổi, mắc bệnh ĐTĐ đã lâu, có nhiều bệnh lý đi kèm, có tiền sử hạ glucose máu nặng trước đó.