Luận Văn Thạc Sĩ: Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả Ở Người Tại Bệnh Viện Quân Y 103 Năm 2013 Bằng Kỹ Thuật PCR

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus chẩn đoán vi khuẩn tả ở người đến xét nghiệm tại bệnh viện quân y 103 năm 2013 bằng kỹ thuật pcr, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất

• Tác giả: Trương Thị Lan Hương
• Người hướng dẫn: Pgs. Kiều Chí Thành
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả Ở Người Đến Xét Nghiệm Tại Bệnh Viện Quân Y 103 Năm 2013 Bằng Kỹ Thuật PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Lí do chọn đề tài
• 0.2. Mục đích nghiên cứu
• 0.3. Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình bệnh tả
• 1.1.1. Tình hình bệnh tả trên thế giới
• 1.2. Vi khuẩn tả
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái
• 1.2.2. Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn
• 1.2.3. Độc tố của vi khuẩn tả
• 1.2.4. Khả năng gây bệnh
• 1.2.5. Diễn biến bệnh
• 1.2.5.1. Thời kỳ ủ bệnh
• 1.2.5.2. Thời kỳ khởi phát
• 1.2.5.3. Thời kỳ toàn phát
• 1.2.6. Một số phương pháp chẩn đoán tả
• 1.3. Tổng quan về kĩ thuật PCR
• 1.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
• 1.3.2. Các giai đoạn của một chu kì phản ứng PCR
• 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
• 1.3.4. Ứng dụng kĩ thuật PCR trong y học
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2.1. Chủng giống vi sinh vật
• 2.2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.2.3. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp mô tả
• 2.3.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
• 2.3.3. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm
• 2.3.4. Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật
• 2.3.5. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen appA và phyC
• 2.3.6. Tách chiết ADN khuôn mẫu bằng KIT QIAGEN
• 2.3.7. Phương pháp m-PCR dùng để xác định nhanh serogroup O1, O139 và hai biotype của V.
• 2.3.7.1. Phản ứng m-PCR1
• 2.3.7.2. Phản ứng m-PCR2
• 2.3.8. Điện di sản phẩm PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính, lứa tuổi
• 3.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen mã hóa cholera toxin ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR
• 3.4. Phân tích trình tự gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR
• 3.5. Thiết kế mồi nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR từ V.
• 3.6. Khuếch đại gen ctxA, rfb từ V. Cholerae bằng phản ứng m-PCR1
• 3.7. Khuếch đại gen tcpA, rstR từ V. Cholerae bằng m-PCR2
• 3.8. So sánh phương pháp chẩn đoán tả bằng kĩ PCR với kĩ thuật chẩn đoán tả bằng kĩ thuật nuôi cấy kết hợp sử dụng kháng huyết thanh
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả Tại Bệnh Viện Quân Y 103

Chẩn đoán vi khuẩn tả là một vấn đề quan trọng trong y học, đặc biệt tại Bệnh viện Quân Y 103. Năm 2013, bệnh viện này đã thực hiện nhiều nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn tả trong cộng đồng. Vi khuẩn tả, chủ yếu là V. cholerae, gây ra dịch bệnh nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Việc áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác vi khuẩn này, từ đó có biện pháp điều trị kịp thời.

1.1. Tình Hình Bệnh Tả Tại Việt Nam Năm 2013

Năm 2013, bệnh tả vẫn là một trong những nguyên nhân chính gây ra dịch tiêu chảy cấp tại Việt Nam. Số liệu cho thấy có nhiều ca bệnh được ghi nhận, đặc biệt ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung. Việc phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn tả là rất cần thiết để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh.

1.2. Vai Trò Của Kỹ Thuật PCR Trong Chẩn Đoán

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã được áp dụng rộng rãi trong y học để phát hiện vi khuẩn tả. Phương pháp này cho phép khuếch đại DNA của vi khuẩn, giúp xác định nhanh chóng sự hiện diện của V. cholerae trong mẫu bệnh phẩm. Điều này không chỉ tiết kiệm thời gian mà còn nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả Ở Người

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán vi khuẩn tả, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Việc phân lập và xác định chính xác các chủng vi khuẩn tả là rất khó khăn. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường tốn nhiều thời gian và không thể phân biệt giữa các chủng độc và không độc. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phát Hiện Nhanh

Việc phát hiện nhanh vi khuẩn tả là một thách thức lớn, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh bùng phát. Các phương pháp truyền thống không đáp ứng kịp thời nhu cầu chẩn đoán, dẫn đến nguy cơ lây lan dịch bệnh trong cộng đồng.

2.2. Chi Phí Cao Của Các Phương Pháp Chẩn Đoán

Chi phí cho các phương pháp chẩn đoán truyền thống thường cao, gây khó khăn cho nhiều cơ sở y tế trong việc thực hiện. Điều này làm giảm khả năng tiếp cận dịch vụ y tế cho bệnh nhân, đặc biệt là ở những vùng nông thôn.

III. Phương Pháp Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả Bằng Kỹ Thuật PCR

Kỹ thuật PCR đã trở thành phương pháp chính trong chẩn đoán vi khuẩn tả tại Bệnh viện Quân Y 103. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các chủng vi khuẩn tả, từ đó giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị kịp thời. Việc sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR.

3.1. Nguyên Tắc Của Kỹ Thuật PCR

Kỹ thuật PCR dựa trên nguyên tắc khuếch đại DNA, cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn gen cụ thể. Điều này giúp phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn tả trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và hiệu quả.

3.2. Các Giai Đoạn Của Phản Ứng PCR

Phản ứng PCR bao gồm ba giai đoạn chính: biến tính, gắn mồi và kéo dài. Mỗi giai đoạn đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của quá trình khuếch đại DNA.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả

Nghiên cứu tại Bệnh viện Quân Y 103 đã chỉ ra rằng kỹ thuật PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện vi khuẩn tả. Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnh nhân dương tính với V. cholerae cao, đặc biệt là trong các tháng mùa hè. Việc áp dụng kỹ thuật này đã giúp cải thiện đáng kể khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh nhân.

4.1. Tỷ Lệ Bệnh Nhân Dương Tính

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ bệnh nhân dương tính với V. cholerae trong giai đoạn nghiên cứu là khá cao. Điều này cho thấy sự cần thiết phải tiếp tục áp dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn tả.

4.2. So Sánh Với Các Phương Pháp Khác

Kỹ thuật PCR cho thấy ưu điểm vượt trội so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Thời gian chẩn đoán nhanh hơn, độ chính xác cao hơn, giúp bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

V. Kết Luận Về Chẩn Đoán Vi Khuẩn Tả Tại Bệnh Viện Quân Y 103

Chẩn đoán vi khuẩn tả bằng kỹ thuật PCR tại Bệnh viện Quân Y 103 đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng vi khuẩn tả mà còn nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân. Tương lai, việc áp dụng công nghệ mới trong chẩn đoán sẽ tiếp tục được nghiên cứu và phát triển.

5.1. Tương Lai Của Kỹ Thuật PCR Trong Y Học

Kỹ thuật PCR hứa hẹn sẽ tiếp tục phát triển và được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm khác. Việc cải tiến công nghệ sẽ giúp nâng cao độ chính xác và giảm chi phí cho các cơ sở y tế.

5.2. Đề Xuất Nghiên Cứu Thêm

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện kỹ thuật PCR, đồng thời phát triển các phương pháp chẩn đoán mới nhằm nâng cao khả năng phát hiện và điều trị bệnh tả hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1. Tình hình bệnh tả 1. Tình hình bệnh tả trên thế giới Bệnh tả được cho là xuất hiện cách đây hàng thế kỷ tại đồng bằng sông Hằng của các tiểu lục địa Ấn Độ. Thế kỷ thứ XI những đợt dịch tả đã lan tràn tới nhiều vùng trên thế giới từ Nam Á theo con đường buôn bán, hành hương và di tản.

Trong thời gian có đại dịch, nhiều vụ dịch lớn có tỷ lệ tử vong cao đã xảy ra ở khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ. Năm 1849, có một cuộc điều tra nổi tiếng của John Snow (Bác sỹ người Anh) đã chứng minh nước là môi trường truyền bệnh tả [48, 51]. Năm 1817 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ. Đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 "làn sóng bệnh tả" lan khắp thế giới, tiếp đó đến những năm 60 phạm vi "tung hoành" của vi khuẩn tả đã được "khoanh vùng" và cho đến những năm gần đây chủ yếu bệnh xuất hiện ở Đông nam Á.

Năm 1961 týp "El Tor" gây dịch tại Philippin và tạo "làn sóng thứ bảy". Từ đó trở đi typ vi khuẩn này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần châu Âu [2, 5, 10, 57]. Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành công vi khuẩn từ phân của bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng của bệnh này. Có tài liệu cho rằng trước đó 30 năm nhà giải phẫu học người Ý đã phát hiện ra phẩy khuẩn là nguyên nhân gây bệnh [43].

Các vụ đại dịch đều bắt nguồn từ châu Á, sau đó lan tới các châu lục khác ở nhiều nước, trong nhiều năm. Qua các vụ dịch, có một số ghi nhận đáng chú ý về dịch tễ học, sinh bệnh học, điều trị và phòng chống bệnh tả được tóm tắt như sau: - Vụ đại dịch thứ nhất: Lần đầu tiên ghi nhận bệnh tả xảy ra dưới dạng một đại dịch, vụ đại dịch này bắt đầu vào năm 1817 tại khu vực châu thổ sông Hằng, sau đó lan tới nhiều nước thuộc châu Á và châu Phi [5]. - Vụ đại dịch thứ hai: Lần đầu tiên bệnh tả gây dịch ở Bắc Mỹ năm 1832 tại khu vực Quebec (Canada), New York, Philadelphia, Washington. Trong vụ đại dịch này, đầu những năm 1930, O’Shaughnessy là người đầu tiên chứng minh phân của bệnh nhân bị bệnh tả có tính kiềm và có nồng độ điện giải rất cao.

Sau phát hiện có ý nghĩa này, Latta Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương đã điều trị thành công một số bệnh nhân tả mất nước nặng bằng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa muối và điện giải [5, 47]. - Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, tại Luân Đôn, John Snow đã phát hiện rất quan trọng về dịch tễ học là bệnh tả lan truyền theo đường nước sinh hoạt bị ô nhiễm và từ đó đã đề ra biện pháp chống dịch hiệu quả là loại bỏ nguồn nước sinh hoạt không hợp vệ sinh [17, 27, 61]. - Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hoành hành dữ dội ở New Orleans và các thành phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri và Ohio của nước Mỹ [1, 5, 62]. - Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đông, sau đó lan tới Nam Mỹ, gây ra các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao ở các nước Argentina, Chilê và Peru.

Tại Ai Cập và Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch đã phân lập được vi khuẩn tả từ phân của bệnh nhân bị bệnh tả, chỉ một năm sau khi Koch phân lập được vi khuẩn tả, Ferran là người đầu tiên đã gây miễn dịch dự phòng tả bằng vaccin [12, 45]. - Vụ đại dịch 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đông và bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngoài một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và châu Á, trong 6 vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, týp sinh học cổ điển do Pacini mô tả đầu tiên phân lập được năm 1854 và được nhà vi trùng học người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883 [5, 46, 59]. - Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh là V.

cholerae O1, týp sinh học El Tor, do Goschlich lần đầu tiên phân lập được năm 1905 được chia làm 4 giai đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú ở các đảo thuộc Indonesia và các nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1. Năm 1963-1969 chỉ trong thời gian ngắn dịch xuất hiện nhiều nước châu Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xô cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor vào tháng 1 năm 1964. Giai đoạn tiếp theo từ năm 1970-1990 theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới có 36 nước có dịch tả, điều đáng chú ý là tại Li Băng, Syri chủng gây dịch là El Tor Ogawa, trong khi đó ở các nước liền kề như Ả rập- Xê út, Israel chủng gây dịch lại là El Tor Inaba.Tiếp theo những năm 1991 đến nay điều đáng chú ý ở nước Trung Mỹ và Nam Mỹ 21/23 nước có bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả trên toàn thế giới. Tháng 7/1994 xảy ra một vụ dịch tả Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương thảm khốc tại trại tị nạn ở Uganda với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người mắc tả ở châu Phi chiếm 60% tổng số các trường hợp mắc tả trên thế giới [58, 60].

Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại sảy ra ở nước này. Vi khuẩn gây bệnh được xác định là V. Về mặt di truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng cũng biến đổi. Tất cả mọi lứa tuổi (kể cả trong vùng đã có dịch) đều có thể bị nhiễm.

Chủng O139 đã gây bệnh tại ít nhất 11 nước ở Đông nam Á (tính đến năm 2005). Không có số liệu chính xác số người bị bệnh do O139 vì các nước không thông báo cụ thể các trường hợp bệnh do O1 hay O139 riêng rẽ. Trong những năm cuối thế kỷ 20 dịch tả ngày càng trở nên nghiêm trọng, bệnh tả xảy ra ở tất cả các châu lục, tập trung chủ yếu ở những nước đang phát triển, mặc dù y học có những hiểu biết đáng kể về sinh bệnh học và điều trị bệnh tả nhưng tỷ lệ tử vong do bệnh tả vẫn ở mức độ cao, đặc biệt là khu vực châu Phi [3, 8, 53]. Những đặc điểm của týp El Tor giúp nó khẳng định khả năng "tiếp tục gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp hơn nhiều so với tỷ lệ nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau khi bị bệnh do El Tor dài hơn so với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor có khả năng tồn tại ngoài môi trường tốt hơn, dài hơn týp cổ điển.

Chính vì vậy El Tor có khả năng gây dịch tại cả những nơi Týp cổ điển từng "tung hoành" [7, 36, 50]. Tháng 4 năm 1997, dịch bùng phát trong cộng đồng 90 ngàn người tị nạn Ruanđa ở Cộng Hoà Công gô. Chỉ trong 22 ngày đầu đã có 1.521 người chết. Đa số các trường hợp chết đều do không được can thiệp kịp thời.

Tại Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đó được khống chế do đảm bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt. Tuy vậy, giao thông và du lịch tạo điều kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ. Đa số trường hợp do đi du lịch tại các nước Mỹ La tinh, châu Phi, châu Á. Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn mang về từ các quốc gia còn lưu hành bệnh [44, 51].

Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ 7 đã có 91 nước có dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế thế giới đã có ít nhất 98 nước có dịch tả. Nhờ những hiểu biết đáng kể về căn nguyên gây bệnh, về điều trị và cơ chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong do tả đã giảm xuống một cách đáng kể chỉ còn 1% - 3% [6]. cholerae O1 bao gồm hơn 60 nhóm huyết thanh, nhưng chỉ có một nhóm huyết thanh O1 là gây được bệnh tả, V. cholerae O1 Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Khóa 2011-2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương lại gồm 2 sinh týp là sinh týp cổ điển và sinh týp El-Tor, mỗi sinh týp lại gồm 2 týp huyết thanh (Ogawa và Inaba) [8, 22].

Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết các vụ dịch tả gần đây, tuy vẫn còn nhiều vụ dịch xảy ra ở tiểu lục địa Ấn Độ là do sinh týp cổ điển. Sinh týp El- Tor có thể sống kết hợp với một sinh vật dưới nước, làm cho nước trở thành một kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31, 54]. Từ cuối năm 1992, dịch tả do V. cholerae O139 đã xuất hiện ở một số nơi thuộc Đông nam Ấn Độ, sau đó nhanh chóng lan tới Đông Bắc nước này thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy ra ở Bangladesh, tiếp đó xuất hiện ở Miama, Trung Quốc (Tân Cương, 7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng 9 cùng năm đã có nhiều trường hợp mắc tả V.

Người ta đã phân lập được V. cholerae non O1 ở các bệnh nhân tiêu chảy nặng thuộc 2 cộng đồng ở Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hoá ở người và sự đồng nhất hoá của những chủng này làm nảy sinh những câu hỏi về sự tương quan của những chủng V. cholerae O1 độc và không độc dọc bờ biển Gulf của hoa Kỳ [39, 56]. Một đánh giá khảo sát trên tất cả các bệnh viện tư nhân ở Recife cho kết quả trong 1.435 mẫu chỉ có 1 mẫu dương tính với V.

cholerae El-Tor Inaba (0.07%), 17 mẫu dương tính (1. và rất ít gặp ở những người có điều kiện xã hội khá, ngay cả khi dịch đang xảy ra [49].Tình hình bệnh tả ở Việt Nam Bệnh tả là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam từ hơn một thế kỷ qua với 2 triệu trường hợp mắc bệnh tả được thông báo.